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문제 정의
- 다음은 apoptosis의 또 다른 경로인 death receptor (DR) pathway에 관여하는 관련 유전자들의 발현 변화를 조사하였다. 먼저 FS의 처리 양이 증가함에 따라 DR5, Fas, TRAIL의 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, FYA를 처리하여 확인한 RT-PCR 및 Western blotting의 결과에서는 DR5, Fas, FasL 의 발현 양도 증가하였음을 알 수 있었다[Fig.
- Class Ⅰ에 속하는 caspase들은 특이적인 분자들과 상호작용하게 되어 신호적 복합체로 연결되고, 이러한 다양한 신호 전달을 통해 class Ⅱ에 속하는 caspase들을 활성화 시켜 apoptosis가 일어나는 동안에 class Ⅱ의 caspase들이 세포질에 존재하는 수 백 개의 caspase 표적 단백질의 분해를 유발하게 된다[5,13,24]. 많은 선행연구에서 caspases의 활성화가 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다고 보고되어 있으므로, 본 연구에서는 AGS 세포에서 caspases의 발현에 미치는 FS 및 FYA의 영향을 조사하였다. Western blotting을 통하여 caspase의 발현 변화를 관찰한 결과, Fig.
- 본 연구에서는 AGS 인체위암세포에서 발효시킨 콩의 추출물에 의한 증식억제가 apoptosis 유발에 의한 것인지를 조사하였다. 선행 연구에서 발효시킨 콩의 성분을 정량화한 결과, 총 페놀, 단백질 및 당의 함량이 대두를 발효시킨 FS보다 노란 아가콩의 발효물인 FYA에서 높은 것을 확인하였다[14].
- 본 연구에서는 대두와 아가콩의 발효 추출물의 항암활성기전을 확인하기 위해 발효된 콩 추출물 처리를 통한 AGS 인체 위암세포의 증식억제가 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 확인하였으며, apoptosis 조절에 중요한 몇 가지 유전자 산물의 발현 변화를 조사하였다.
가설 설정
- 선행 연구에서 발효시킨 콩의 성분을 정량화한 결과, 총 페놀, 단백질 및 당의 함량이 대두를 발효시킨 FS보다 노란 아가콩의 발효물인 FYA에서 높은 것을 확인하였다[14]. 이를 통해 AGS 인체위암세포에 유발되는 apoptosis에 페놀, 단백질 및 당이 큰 역할을 한다 유추하였고, 이러한 효과는 FS보다 FYA에서 더욱 더 뛰어날 것이란 가정을 하였다. 이를 확인하기 위해 먼저 MTT assay를 수행하였는데, 이는 대사과정이 정상적인 세포가 미토콘드리아의 탈수소효소 작용에 의하여 노란색의 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan crystal로 환원되는 원리를 이용하는 것으로, 그 결과는 Fig.
제안 방법
- Caspase와 직·간접적으로 결합하여 그들의 활성을 차단함으로서 apoptosis를 억제하는 것으로 알려진 inhibitor of apoptosis protein (IAP) family 인자들이 FS 및 FYA에 의해 유발된 apoptosis에 미치는 영향을 확인하기 위해 mRNA 및 단백질 수준에서 조사하였다.
- Apoptosis induction of AGS cells by FS and FYA in AGS cells. Cells were treated with the indicated concentrations of FS and FYA for 48 hr, then collected and stained with PI for flow cytometry analysis. The percentages of cells with hypodiploid DNA (sub-G1 phase) contents represent the fractions undergoing apoptotic DNA degradation.
- FS 및 FYA 처리에 의한 AGS 세포의 전체적인 변화를 관찰하기 위하여 세포에 48 시간 동안 농도별로 처리 후 도립현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200 배의 배율로 각 농도에 따른 세포의 형태 변화를 관찰하였다. 또한 암세포에서 apoptosis 유발 시 특이적으로 나타나는 핵의 형태변화를 관찰하기 위하여 동일 조건으로 처리한 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 phosphate buffered saline (PBS)를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution으로 세포를 상온에서 10 분 동안 고정하고 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 상온에서 암조건으로 15 분간 염색시켰다.
- FS 및 FYA 처리에 의한 apoptosis 유발하는 과정에 어떠한 유전자들이 관여하는지 확인하기 위해, 먼저 FS 및 FYA를 처리하였을 때 Bcl-2 family의 발현 변화를 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 알아보았다. FS의 경우 처리 농도가 증가하여도 apoptosis 억제인자인 Bcl-2와 유발인자인 Bax 모두 mRNA 및 단백질 발현 상에서 큰 변화가 없었다.
- FS 및 FYA가 인체 위암세포 AGS의 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 FS 및 FYA를 농도별로 처리하여 48 시간 배양한 다음 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 FS 및 FYA의 처리 농도가 증가함에 따라 AGS 세포의 증식을 억제되었음을 Fig.
- 2B에서와 같이 FS와 FYA 를 처리함에 따라 점차적으로 세포의 밀도가 감소하였고 전형적으로 apoptosis가 일어난 세포에서 관찰되는 chromatin condensation에 의한 apoptotic body의 형성을 관찰 할 수 있었으며 이러한 현상은 FS에 비해 FYA의 고농도 처리군에서 매우 증가되었다. FS 및 FYA의 처리에 따라 apoptosis가 유발된 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 DNA flow cytometry를 이용하여 세포주기 중 apoptosis가 일어난 집단인 sub-G1기의 빈도를 조사하였다. 그 결과, Fig.
- 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer (Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 50 V에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 EtBr을 이용하여 염색한 후 UV하에서 확인하고 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- sm26 균주 배양액을 증자된 시료의 3% (w/w)가 되도록 접종하고 45℃에서 72 시간 발효하였다. 그 후 제조된 발효물을 70% ethanol로 추출하여 여과한 후 감압 농축하여 각각, 발효 대두 추출물(Fermented Soybean, FS), 발효 아가콩 3 호 추출물(Fermented Yellow Agabean, FYA)을 얻어 사용하였다.
- 처리된 membrane에 1차 항체를 4℃에서 overnight 시킨 후 PBS-T로 세척하고 처리된 1 차 항체에 맞는 2 차 항체를 사용하여 상온에서 1 시간 정도 반응 시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced cheiluminoscence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlignton Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 1 차 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
- , Carlsbad, CA, USA)를 4℃에서 1 시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer (Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 50 V에서 전기영동을 행하였다.
- 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 비특이적인 단백질과의 결합을 막기 위해 5% skim milk를 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)를 일정시간 처리하였다. 처리된 membrane에 1차 항체를 4℃에서 overnight 시킨 후 PBS-T로 세척하고 처리된 1 차 항체에 맞는 2 차 항체를 사용하여 상온에서 1 시간 정도 반응 시켰다.
- 5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenylmethylsulfonyfluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 1 시간 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30 분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 사용방법에 따라 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다.
- FS 및 FYA를 농도별로 처리한 배지에서 배양된 세포를 모아서 3,000 rpm으로 5 분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포들만 모은 후 PBS로 충분히 세척 후 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI) 염색을 하여 4℃,암실에서 30 분 동안 반응을 시켰다. 염색된 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 Cell Quest software 및 ModiFi LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- 또한 암세포에서 apoptosis 유발 시 특이적으로 나타나는 핵의 형태변화를 관찰하기 위하여 동일 조건으로 처리한 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 phosphate buffered saline (PBS)를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution으로 세포를 상온에서 10 분 동안 고정하고 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 상온에서 암조건으로 15 분간 염색시켰다. 염색된 세포를 PBS 및 증류수로 세척한 다음 absolute alcohol로 탈수과정을 거친 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 FS 및 FYA 각각 농도에 따른 AGS 세포의 핵 형태변화를 관찰하였다.
- 이러한 AGS 세포의 증식억제에 따른 형태적 변형이 apoptosis의 유발과 관계가 있을 것으로 예상 되어 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색을 실시하여 형광현미경을 통하여 세포핵의 변화를 관찰하였다. 그 결과 Fig.
- 방출된 cytochrome c는 apoptotic protease activating factor (apaf)-1과 caspase-9과 함께 세포질에서 apoptosome 복합체를 형성하는데, 이 apoptosome은 비활성 상태로 존재하고 있는 caspase-3를 활성화시키게 된다[5,8,9,10,13,24,31,32]. 이러한 intrinsic pathway 과정에서 FS 및 FYA의 처리가 Bcl-2 family의 발현에 변화를 주어 apoptosis를 유발시키는지 알아보기 위해 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 mRNA 및 단백질 수준에서 확인하였다. 그 결과, FS의 경우에는 Bcl-2 family의 발현이 대조군과 비교해 미약한 변화를 보였으나, FYA는 단백질 수준에서는 큰 변화가 없었으나, 전사 수분에서는 처리 농도가 증가함에 따라 Bcl-2의 발현양이 감소하고, Bax의 발현양이 증가하였다[Fig.
- 1에서 확인할 수 있었고, 그 효과는 FS보다 FYA가 더 높게 나타났다. 이러한 암세포의 증식억제 현상이 세포의 형태에는 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해 각각을 농도별로 처리하여 48 시간 동안 배양한 후 도립현미경을 통하여 세포의 모습을 관찰하였다. 그 결과 FS 및 FYA를 처리하지 않은 세포와 비교하였을 때 FS 및 FYA 를 처리한 세포의 밀도는 농도의존적으로 감소하였고, 세포의 모양 또한 불규칙적으로 변화된 것을 확인할 수 있었다 [Fig.
- 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 EtBr을 이용하여 염색한 후 UV하에서 확인하고 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 시료는 시중에서 판매되는 대두(Soybean)와 경북대학교에서 품종 육성되어진 아가콩 3 호(Yellow Agabean)를 제공받아 사용하였다. 시료 준비를 위해 각각의 콩을 수세하고 24 시간 동안 침지시킨 뒤 가압증자한 후 실험실에서 따로 분리된 Bacillus sp.
- 본 연구에 사용된 AGS 인체 위암세포는 한국생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분주 받아 사용하였으며, 세포의 배양을 위해 90%의 RPMI-1640배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovime serum (FBS, Gibco BRL) 에 1%의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
데이터처리
- 반응이 끝난 후 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Amersco)를 각 well에 동량으로 분주하여 well에 생성된 formazan을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며 그에 대한 평균값과 표준오차를 마이크로소프트 엑셀 프로그램으로 구하였다.
이론/모형
- The cells were incubated with the indicated concentrations of fermented soybean (FS) and yellow agabean (FYA) for 48 hr. The rates of cell viability were measured by MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
성능/효과
- 많은 선행연구에서 caspases의 활성화가 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다고 보고되어 있으므로, 본 연구에서는 AGS 세포에서 caspases의 발현에 미치는 FS 및 FYA의 영향을 조사하였다. Western blotting을 통하여 caspase의 발현 변화를 관찰한 결과, Fig. 7에서 볼 수 있듯이 FS 및 FYA를 처리하였을 때 caspase-3, -8 및 -9 모두 비활성형인 proform이 감소하였음을 확인할 수 있었다.
- Caspase와 직·간접적으로 결합하여 그들의 활성을 차단함으로서 apoptosis를 억제하는 것으로 알려진 inhibitor of apoptosis protein (IAP) family 인자들이 FS 및 FYA에 의해 유발된 apoptosis에 미치는 영향을 확인하기 위해 mRNA 및 단백질 수준에서 조사하였다. 그 결과 FS 및 FYA를 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 IAP family 인자의 발현 양이 감소하는 것을 전사 및 번역 수준에서 확인할 수 있었다[Fig. 5]. 이 때, IAP family 인자들의 발현 억제에도 FS 보다 FYA에서 더 뛰어남이 확연하게 드러났다.
- FS 및 FYA가 인체 위암세포 AGS의 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 FS 및 FYA를 농도별로 처리하여 48 시간 배양한 다음 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 FS 및 FYA의 처리 농도가 증가함에 따라 AGS 세포의 증식을 억제되었음을 Fig. 1에서 확인할 수 있었고, 그 효과는 FS보다 FYA가 더 높게 나타났다. 이러한 암세포의 증식억제 현상이 세포의 형태에는 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해 각각을 농도별로 처리하여 48 시간 동안 배양한 후 도립현미경을 통하여 세포의 모습을 관찰하였다.
- 이러한 AGS 세포의 증식억제에 따른 형태적 변형이 apoptosis의 유발과 관계가 있을 것으로 예상 되어 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색을 실시하여 형광현미경을 통하여 세포핵의 변화를 관찰하였다. 그 결과 Fig. 2B에서와 같이 FS 및 FYA를 처리하지 않은 배지에서 배양된 세포의 경우에는 핵의 전체가 고루 염색되는 양상을 보였으나 FS 및 FYA를 처리하였을 때에는 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하였고, 농도가 높아질수록 전형적으로 apoptosis가 일어난 세포에서 관찰되는 apoptotic body의 형성이 증가한 것을 확인하였다. 따라서 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 DNA flow cytometry를 이용하여 세포주기 중 apoptosis가 일어난 세포군에 해당하는 sub-G1기의 빈도를 조사한 결과, FS 및 FYA 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하는 것을 확인하였다.
- 이러한 intrinsic pathway 과정에서 FS 및 FYA의 처리가 Bcl-2 family의 발현에 변화를 주어 apoptosis를 유발시키는지 알아보기 위해 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 mRNA 및 단백질 수준에서 확인하였다. 그 결과, FS의 경우에는 Bcl-2 family의 발현이 대조군과 비교해 미약한 변화를 보였으나, FYA는 단백질 수준에서는 큰 변화가 없었으나, 전사 수분에서는 처리 농도가 증가함에 따라 Bcl-2의 발현양이 감소하고, Bax의 발현양이 증가하였다[Fig. 4]. 한편, apoptosis 조절에서 caspase와 직접적으로 결합하여 활성을 억제하는 것으로 알려진 IAP family[7,23]에 속하는 인자들 또한 FS 및 FYA의 처리농도가 증가함에 따라 mRNA 상에서나 단백질 수준에서의 발현이 억제되는 것을 확인함으로써 IAP family 인자들 또한 관여를 한다는 사실을 확인하였다[Fig.
- FS 및 FYA의 처리에 따라 apoptosis가 유발된 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 DNA flow cytometry를 이용하여 세포주기 중 apoptosis가 일어난 집단인 sub-G1기의 빈도를 조사하였다. 그 결과, Fig. 3에서 알수 있듯이 FS 및 FYA 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기의 세포 빈도가 점차 증가하였는데, 특히 FYA의 처리군에서의 증가율이 FS보다 높았으며, 고농도인 5 mg/ml는 대조군에 비하여 약 60 배 가까이 증가한 것으로 나타났다. 이상의 결과를 통하여 FS 및 FYA에 의해 일어나는 AGS 인체위암세포의 증식억제 및 형태적 변화는 apoptosis와 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
- 세포막에 존재하는 DR4, DR5나 TNF receptor super family에 속하는 Fas, TNFR-1에 각각의 apoptotic ligand인 TRAIL, FasL, TNF-α가 결합하게 되면 Fas-associated with death domain protein (FADD) 또는 TNFRSF1A-associated via death domain (TRADD) 및 procaspase-8이 death-inducing signaling complex (DISC)를 형성하게 되어 caspase-8의 활성화에 의한 caspases cascade에 의하여 apoptosis를 유발하게 된다[3,24,28,29,30]. 따라서 FS 및 FYA를 처리하였을 때 death receptor에 속하는 유전자들의 발현 변화를 살펴본 결과, FS를 처리한 경우, 처리된 FS의 양이 증가함에 따라 DR5, Fas 및 TRAIL의 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, FYA를 처리한 경우에는 DR5, Fas 및 FasL의 발현양이 증가하였다[Fig. 6]. 이러한 인자들의 발현 증가는 앞선 결과들과 유사하게 FS보다 FYA를 처리하였을 때 더욱 더 증가함을 알 수 있었다.
- 2B에서와 같이 FS 및 FYA를 처리하지 않은 배지에서 배양된 세포의 경우에는 핵의 전체가 고루 염색되는 양상을 보였으나 FS 및 FYA를 처리하였을 때에는 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하였고, 농도가 높아질수록 전형적으로 apoptosis가 일어난 세포에서 관찰되는 apoptotic body의 형성이 증가한 것을 확인하였다. 따라서 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 DNA flow cytometry를 이용하여 세포주기 중 apoptosis가 일어난 세포군에 해당하는 sub-G1기의 빈도를 조사한 결과, FS 및 FYA 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과는 특히 FYA의 처리군에서의 증가율이 FS보다 높았으며, 최고 농도인 5 mg/ ml에서는 apoptotic cell의 함량이 약 60%까지 증가한 것을 알 수 있었다[Fig.
- Initiator caspase에는 caspase-8, -9, -10 및 -12 등이 포함되며, effector caspase에는 caspase-3, -6 및 -7 등이 알려져 있는데, 이 중 caspase-3은 직접적으로 apoptosis 효과를 가지는 caspase로서, caspase-3의 활성화는 직접적으로 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)와 같은 표적 단백질의 단편화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 apoptosis 유발에 가장 핵심적인 역할을 하는 caspases의 활성에 FS 및 FYA가 미치는 영향을 알아본 결과, Fig. 7에 나타낸 바와 같이 FS 및 FYA를 처리하였을 때 처리 농도 의존적으로 caspase-3, -8 및 -9의 비활성 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
- 다음은 apoptosis의 또 다른 경로인 death receptor (DR) pathway에 관여하는 관련 유전자들의 발현 변화를 조사하였다. 먼저 FS의 처리 양이 증가함에 따라 DR5, Fas, TRAIL의 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, FYA를 처리하여 확인한 RT-PCR 및 Western blotting의 결과에서는 DR5, Fas, FasL 의 발현 양도 증가하였음을 알 수 있었다[Fig. 6]. 이러한 인자들의 발현증가는 앞선 결과들과 유사하게 FS 보다 FYA를 처리하였을 때 더욱더 확연히 증가하였으며, 이는 AGS 세포 FS 및 FYA에 의한 apoptosis에 death receptor pathway에 연관된 인자들도 관여할 것임을 의미하는 결과이다.
- 따라서 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 DNA flow cytometry를 이용하여 세포주기 중 apoptosis가 일어난 세포군에 해당하는 sub-G1기의 빈도를 조사한 결과, FS 및 FYA 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과는 특히 FYA의 처리군에서의 증가율이 FS보다 높았으며, 최고 농도인 5 mg/ ml에서는 apoptotic cell의 함량이 약 60%까지 증가한 것을 알 수 있었다[Fig. 3]. 이상의 결과를 통하여 FS 및 FYA 처리에 의한 AGS 위암세포의 증식 억제는 apoptosis 유도와 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 5]. 이 때, IAP family 인자들의 발현 억제에도 FS 보다 FYA에서 더 뛰어남이 확연하게 드러났다. 이를 통해 FS 및 FYA의 처리에 의한 apoptosis 유발과정에 IAP family의 발현 변화도 어느 정도 관여하였음을 알 수 있었다.
- 2A]. 이러한 세포의 증식 억제 및 형태적 변형이 apoptosis의 유발과 밀접한 관련이 있을 것임을 확인하기 위하여, 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색 후 형광현미경으로 관찰한 결과 Fig. 2B에서와 같이 FS와 FYA 를 처리함에 따라 점차적으로 세포의 밀도가 감소하였고 전형적으로 apoptosis가 일어난 세포에서 관찰되는 chromatin condensation에 의한 apoptotic body의 형성을 관찰 할 수 있었으며 이러한 현상은 FS에 비해 FYA의 고농도 처리군에서 매우 증가되었다. FS 및 FYA의 처리에 따라 apoptosis가 유발된 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 DNA flow cytometry를 이용하여 세포주기 중 apoptosis가 일어난 집단인 sub-G1기의 빈도를 조사하였다.
- 6]. 이러한 인자들의 발현 증가는 앞선 결과들과 유사하게 FS보다 FYA를 처리하였을 때 더욱 더 증가함을 알 수 있었다. 이로 인체 위암세포인 AGS에서 FS 및 FYA 에 의한 apoptosis에 death receptor pathway에 연관된 인자들이 관여할 것이라는 것을 유추할 수 있었고, 이상의 결과를 통하여 FS 및 FYA 처리에 의한 apoptosis 유발은 death receptor pathway에 관여하는 death receptor 관련 유전자의 발현 증가와 mitochondrial pathway에 관여하는 Bcl-2 family의 pro-apoptosis 인자의 발현 증가 및 anti-apoptosis 인자의 발현 억제, 그리고 IAP family의 억제에 의해 이루어지는 것을 확인하였다.
- 6]. 이러한 인자들의 발현증가는 앞선 결과들과 유사하게 FS 보다 FYA를 처리하였을 때 더욱더 확연히 증가하였으며, 이는 AGS 세포 FS 및 FYA에 의한 apoptosis에 death receptor pathway에 연관된 인자들도 관여할 것임을 의미하는 결과이다.
- 이러한 인자들의 발현 증가는 앞선 결과들과 유사하게 FS보다 FYA를 처리하였을 때 더욱 더 증가함을 알 수 있었다. 이로 인체 위암세포인 AGS에서 FS 및 FYA 에 의한 apoptosis에 death receptor pathway에 연관된 인자들이 관여할 것이라는 것을 유추할 수 있었고, 이상의 결과를 통하여 FS 및 FYA 처리에 의한 apoptosis 유발은 death receptor pathway에 관여하는 death receptor 관련 유전자의 발현 증가와 mitochondrial pathway에 관여하는 Bcl-2 family의 pro-apoptosis 인자의 발현 증가 및 anti-apoptosis 인자의 발현 억제, 그리고 IAP family의 억제에 의해 이루어지는 것을 확인하였다.
- 이 때, IAP family 인자들의 발현 억제에도 FS 보다 FYA에서 더 뛰어남이 확연하게 드러났다. 이를 통해 FS 및 FYA의 처리에 의한 apoptosis 유발과정에 IAP family의 발현 변화도 어느 정도 관여하였음을 알 수 있었다.
- 이를 통해 AGS 인체위암세포에 유발되는 apoptosis에 페놀, 단백질 및 당이 큰 역할을 한다 유추하였고, 이러한 효과는 FS보다 FYA에서 더욱 더 뛰어날 것이란 가정을 하였다. 이를 확인하기 위해 먼저 MTT assay를 수행하였는데, 이는 대사과정이 정상적인 세포가 미토콘드리아의 탈수소효소 작용에 의하여 노란색의 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan crystal로 환원되는 원리를 이용하는 것으로, 그 결과는 Fig. 1과 같이 48 시간 동안 FS 및 FYA를 처리하였을 때 처리 농도가 증가할수록 암세포의 증식이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 FS보다 FYA의 효과가 큰 것을 확인하였으며, 이러한 증식 억제 현상이 세포의 형태에도 변화를 가져올 것이라 판단하여 현미경으로 관찰하였을 때, 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하며 불규칙적인 모양으로 변하는 것을 확인하였다[Fig.
- 3]. 이상의 결과를 통하여 FS 및 FYA 처리에 의한 AGS 위암세포의 증식 억제는 apoptosis 유도와 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 3에서 알수 있듯이 FS 및 FYA 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기의 세포 빈도가 점차 증가하였는데, 특히 FYA의 처리군에서의 증가율이 FS보다 높았으며, 고농도인 5 mg/ml는 대조군에 비하여 약 60 배 가까이 증가한 것으로 나타났다. 이상의 결과를 통하여 FS 및 FYA에 의해 일어나는 AGS 인체위암세포의 증식억제 및 형태적 변화는 apoptosis와 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과에서 FS 및 FYA를 인체 위암세포인 AGS에 처리하였을 경우 농도 의존적으로 세포의 증식을 강하게 억제하였고, 이러한 세포 증식억제는 apoptosis 유도와 관련이 있음을 확인하였다. 이러한 apoptosis는 세포 표면에 존재하는 Fas 에 FasL이 결합하여 일어나는 death receptor pathway 또는 pro-apoptosis 인자인 Bax의 증가와 anti-apoptosis 인자인 Bcl-2의 감소에 의해 일어나는 mitochondrial pathway를 통하여 유발될 것이라 유추된다.
- 1과 같이 48 시간 동안 FS 및 FYA를 처리하였을 때 처리 농도가 증가할수록 암세포의 증식이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 FS보다 FYA의 효과가 큰 것을 확인하였으며, 이러한 증식 억제 현상이 세포의 형태에도 변화를 가져올 것이라 판단하여 현미경으로 관찰하였을 때, 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하며 불규칙적인 모양으로 변하는 것을 확인하였다[Fig. 2A]. 이러한 세포의 증식 억제 및 형태적 변형이 apoptosis의 유발과 밀접한 관련이 있을 것임을 확인하기 위하여, 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색 후 형광현미경으로 관찰한 결과 Fig.
- 4]. 한편, apoptosis 조절에서 caspase와 직접적으로 결합하여 활성을 억제하는 것으로 알려진 IAP family[7,23]에 속하는 인자들 또한 FS 및 FYA의 처리농도가 증가함에 따라 mRNA 상에서나 단백질 수준에서의 발현이 억제되는 것을 확인함으로써 IAP family 인자들 또한 관여를 한다는 사실을 확인하였다[Fig. 5].
후속연구
- 이러한 apoptosis는 세포 표면에 존재하는 Fas 에 FasL이 결합하여 일어나는 death receptor pathway 또는 pro-apoptosis 인자인 Bax의 증가와 anti-apoptosis 인자인 Bcl-2의 감소에 의해 일어나는 mitochondrial pathway를 통하여 유발될 것이라 유추된다. 특히 이러한 결과는 FS보다 FYA 처리군에서 더욱더 탁월한 효과를 가지는 것으로 보아, 노란 아가콩이 효과적인 항암제로서의 가능성을 가지는 것을 제시하며, 이는 노란아가콩에 대한 지속적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.
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