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문제 정의
- 본 연구는 장수버섯 배양 옻나무의 식·의약품 소재화를 위하여 일반성분을 조사하고 기능성을 검토하였다.
- 시험관 내에서의 높은 항산화 활성이 생체 내에서의 동일한 효과로 이어지지는 않는다. 배양물의 항산화 효과를 더욱 자세히 살펴보고자 animal cell line(NIH3T3)을 대상으로 검토하였다. 장수버섯 증식에 의해서 NIH3T3세포에 대한 세포독성이 낮아졌다(Fig.
제안 방법
- 5% CO2 incubator에서 1일 동안 증식시킨 다음 배지를 교환하였으며 일정농도가 되도록 조절된 시료 10 µL를 첨가 후 30분 동안 적응시켰다.
- 농축액은 pH 2.2 sodium citrate buffer에 용해하여 0.2 µm membrane filter(Milliproe Co., Ireland)로 여과한 후 amino acid analysis system(S-4300, Sykam Co., Germany)을 이용하여 분석하였다.
- 강원도 원주산 건조 옻나무 껍질을 2 × 2 cm로 잘라 하룻밤 동안 수침 시키고 850 µm체에서 30분 동안 잉여수분을 제거한 후 800 cc 종균병에 450 g씩 담은 다음 121℃에서 40분간 살균하였다.
- 2)후 동결건조 하였다. 알코올 추출물은 시료무게의 5배 ethanol(70%)을 첨가하고 상온에서 10일동안 추출한 뒤 물 추출물과 동일하게 처리하여 사용하였다.
- )를 첨가한 다음 60℃에서 30분간 반응시켜 유도체를 만들었다. Phenolic acid는 GC/MS로 분석하였다. GC/MS(2010/QP-2010, Shimadzu Co, Japan)는 DB-5HT column(30 m × 0.
- 시료가 첨가된 세포에 365 nm의 UV(VL-6LC, France)를 10 cm 높이에서 30초 동안 조사한 다음 5% CO2 incubator에서 1일 동안 배양한 후 세포생존율을 조사하였다. 생존율은 cell counting kit-8(CCK-8, Dojind℃o.
- Insulin 단독 처리구는 시료대신 PBS 20µL를, 시료 처리구는 시료를 PBS에 녹인 후 10-100µg/well이 되도록 조절하여 첨가하였고 분화촉진제는 0.2 µM dexamethasone, 0.5 mM isobutylmethylxanthin(IBMX)/well이 되도록 조절하여 첨가하였다.
- 분화를 위하여 배양 2일째 insulin(5 µg/mL)이 첨가된 배지로 바꾸었으며 배양 6일째까지 insulin 첨가배지에서 분화를 유도시켰다.
- 분화를 위하여 배양 2일째 insulin(5 µg/mL)이 첨가된 배지로 바꾸었으며 배양 6일째까지 insulin 첨가배지에서 분화를 유도시켰다. 이때 추출물이 지방 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 insulin 단독, insulin + 시료, insulin + 분화촉진제 처리구로 구분하여 실험을 수행하였다. Insulin 단독 처리구는 시료대신 PBS 20µL를, 시료 처리구는 시료를 PBS에 녹인 후 10-100µg/well이 되도록 조절하여 첨가하였고 분화촉진제는 0.
- 분화된 지방세포는 insulin을 포함하지 않는 10% FBS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지로 2일 단위로 교환하면서 6일 동안 배양시켰다.
- 열수 추출물은 시료 무게의 10배 증류수를 첨가하고 환류 냉각장치를 부착한 다음 100℃에서 10시간 동안 추출한 것을 여과(No. 2)후 동결건조 하였다. 알코올 추출물은 시료무게의 5배 ethanol(70%)을 첨가하고 상온에서 10일동안 추출한 뒤 물 추출물과 동일하게 처리하여 사용하였다.
- , USA)을 장착하였다. 컬럼오븐의 온도는 50℃(7분), 5℃/min, 70℃(10분), 10℃/min, 150℃(5분),10℃/min, 300℃(20분)의 program을 사용하였다. Carrier gas는 nitrogen(column flow: 1.
대상 데이터
- (2007)의 방법에 따라 제조한 액체종균을 접종하고 25℃에서 20일간 배양한 다음 회수하여 동결건조 하였다. 균주는 전북대학교 바이오식품공학과에서 분리 보관중인 Fomitella fraxinea IK1을 사용하였다.
- NIH3T3세포는 한국세포주은행으로부터 구입하여 사용하였다. 배지는 RPMI 1640(Gibco BRL)에 10% fetal bovine serum(FBS), P/S(50 units/mL penicillin, 25 mg/mL streptomycin)를 첨가한 것을 이용하였다.
- NIH3T3세포는 한국세포주은행으로부터 구입하여 사용하였다. 배지는 RPMI 1640(Gibco BRL)에 10% fetal bovine serum(FBS), P/S(50 units/mL penicillin, 25 mg/mL streptomycin)를 첨가한 것을 이용하였다. 세포는 5% CO2 incubator(37℃)에서 2일에 한번씩 배지를 교환하면서 배양하였다.
- 전구지방세포 3T3-L1은 한국세포주은행에서 구입하여 10% FBS와 1% P/S가 첨가된 Dulbecco’s modified medium(DMEM, Gibco BRL) 배지를 사용하여 증식시켰다.
이론/모형
- 그리고 Choi et al.(2007)의 방법에 따라 제조한 액체종균을 접종하고 25℃에서 20일간 배양한 다음 회수하여 동결건조 하였다. 균주는 전북대학교 바이오식품공학과에서 분리 보관중인 Fomitella fraxinea IK1을 사용하였다.
- 일반성분은 식품공전(2010)에 준하여 실시하였다.
- 항산화 활성은 Murakami et al.(2002)의 방법에 따라 측정하였다. 추출물 200 µL와 100 mM Tris-HCl(pH 7.
- incubator에서 1일 동안 배양한 후 세포생존율을 조사하였다. 생존율은 cell counting kit-8(CCK-8, Dojind℃o., Japan)을 사용하였으며, 측정법은 제조사의 방법에 따랐다.
성능/효과
- 30%, 불검출로 나타났다. 장수버섯 배양에 의해서 지방, 단백질 그리고 당 함량의 두드러진 감소를 보였는데, 건물량을 기준으로 지방은 2.0배, 단백질은 1.9배 감소하였으며 당류는 모두 소진되었다.
- 항산화 활성을 측정한 결과(Fig. 1, DPPH) 배양물의 IC50값은 28.54µg/54.70µg(알코올/물추출물)로대조구(11.30µg/21.02 µg)에 비하여 약 2.5배 낮은 것으로 나타났다.
- 배양 물의 주요 phenolic acid 성분인 gallic acid의 IC50값은 1.84 µg으로 상용 항산화제로 사용되는 BHA (butylated hydroxy anisole, 4.34 µg) 및 BHT(butylated hydroxy toluene, 6.29 µg) 보다도 낮게 나타나 gallic acid는 항산화 활성에 주요 영향 요소임을 확인하였다.
- 이러한 경향은 배양시료의 추출물에서도 매우 유사하게 나타났는데, syringic acid와 gallic acid가 총 함량의 94% 이상 차지하였으며 장수버섯 배양에 의해서 caffeic acid가 제거되었다. 한편, 물 추출의 phenolic acid함량은 알코올 추출물의 73.8%(생옻) 및 67.1%(배양물)에 해당하는 양으로 일부 감소가 확인되었다.
- 29 µg) 보다도 낮게 나타나 gallic acid는 항산화 활성에 주요 영향 요소임을 확인하였다. 배양물의 항산화활성이 생옻피의 활성보다 감소한 것은 phenolic acid의 감소가 주된 이유인 것으로 판단되나 장수버섯 배양 옻 역시 일정수준 이상의 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
- 배양물의 물 추출물이 전구지방세포 분화에 미치는 영향을 살펴본 결과(Fig. 4) insulin만 첨가하였을 경우에는 전구 지방세포의 분화가 거의 일어나지 않는 반면 insulin과 배양물을 혼합하여 처리하면 전구지방세포의 분화가 현격하게 증가되었다. 분화는 10 µg/200 µL의 농도에서 가장 높았으며 이는 전구지방세포의 분화 촉진제인 IBMX + dexamethasone 보다 높았다.
- 장수버섯 배양 옻나무의 총 유리아미노산 함량(Table 2)은 97.41 mg%으로 대조구(71.91 mg%)에 비하여 35% 증가하였으며 phosphoserine(55.06 mg%), ammonia(17.84 mg%), aspartic acid(6.05 mg%)가 주요 유리아미노산 이었다. 장수 버섯의 증식에 의해서 taurine, ammonia, phosphoserine, aspartic acid는 각각 13.
- 30%, 불검출 이었다. 배양물의 총 유리아미노산 함량은 97.41 mg%으로 대조구(71.91 mg%)에 비하여 35% 증가하였으며 phosphoserine(55.06 mg%), ammonia(17.84 mg%), aspartic acid (6.05 mg%)가 주요 유리아미노산 이었다. 배양물의 총 phenolic acid함량은 422.
- 05 mg%)가 주요 유리아미노산 이었다. 배양물의 총 phenolic acid함량은 422.89 ppm/283.86 ppm(알코올/물 추출물)이었으며 syringic acid와 gallic acid가 주요 성분이었고 vanillic, protocatechuic acid가 소량 함유되어 있었다. 항산화 활성(DPPH, IC50)은 28.
후속연구
- Mantena and Katiyar(2006)는 포도씨에서 추출한 proanthocyanidin화합물이 UV에 의해서 유도된 산화물을 효과적으로 제거시켜 줌으로서 세포내 항산화 효소(glutathione peroxidase, catalase, superoxide dismutase, glutathione)의 고갈을 막아 세포 생존율이 증가된다고 보고하였다. 배양물의 항산화 효과는 에탄올 추출물보다는 물 추출물에서 더욱 좋은 것으로 나타나 기능성 음료 등 건강보조식품의 재료로서 충분히 이용이 가능할 것으로 생각된다.
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