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Kafe 바로가기주관연구기관 | 강원대학교 Kangwon National University |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2016-02 |
과제시작연도 | 2015 |
주관부처 | 농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 | TRKO201600003302 |
과제고유번호 | 1395041515 |
사업명 | 농축산물부가가치향상 |
DB 구축일자 | 2016-06-25 |
DOI | https://doi.org/10.23000/TRKO201600003302 |
Ⅳ. 연구개발결과
1. 발효옻 위건강 관련 물질 분리
가. 발효옻 추출물의 생리활성
○ 발효옻 추출물의 총 페놀함량은 1.0mg/ml의 농도에서 100% 껍질 추출물이 0.037mgGAE/ml, 9:1 혼합물이 0.082mgGAE/ml의 함량을 나타내었음. 항산화활성은 동일농도에서 100% 껍질 추출물의 경우 90.5%, 9:1혼합물의 경우 88.02%의 산화억제능을 나타냄. 한가지 주목할 만 한 것은 앞서 측정한 총페놀함량의 경우 9:1혼합물이 더욱 높은 함량을 나타내었음에도 불구하고, 항산화 활성도의 경우 100
Ⅳ. 연구개발결과
1. 발효옻 위건강 관련 물질 분리
가. 발효옻 추출물의 생리활성
○ 발효옻 추출물의 총 페놀함량은 1.0mg/ml의 농도에서 100% 껍질 추출물이 0.037mgGAE/ml, 9:1 혼합물이 0.082mgGAE/ml의 함량을 나타내었음. 항산화활성은 동일농도에서 100% 껍질 추출물의 경우 90.5%, 9:1혼합물의 경우 88.02%의 산화억제능을 나타냄. 한가지 주목할 만 한 것은 앞서 측정한 총페놀함량의 경우 9:1혼합물이 더욱 높은 함량을 나타내었음에도 불구하고, 항산화 활성도의 경우 100%껍질 추출물과 거의 유사한 활성을 나타낸다는 것임. 이는 페놀성물질만이 항산화능에 영향을 주는 것이 아님을 확인할 수 있음. 또한, 발효옻에서 분리한 PGG의 경우 추출물보다 약 100배 낮은 농도인 0.01mg/ml의 농도로 항산화능을 측정하였을 때, 89.80%의 억제능을 나타내었으며, 이는 동일 농도(0.01mg/ml)로 대조군으로 사용된 합성 항산화제인 BHA(29.9mg/ml)와 비교하였을 때 3배정도 높은 항산화능을 가지고 있음을 확인. 상기 결과로 발효옻 내 함유되어 있는 PGG의 항산화적인 면을 비롯하여 다양한 활용이 기대되며, 후차적으로 진행되는 다양한 생리활성 결과에서도 긍정적인 효과를 기대. 또한, PGG를 함유함에 따라 발효 옻의 이용가능성 또한 높이 평가되는 바임.
○ 각각의 추출물 모두에서 알레르기 유발물질인 urushiol의 함유여부를 측정하였을 때 모두 완전히 제거된 것을 확인하였음.
○ MTT assay를 이용한 위암세포(AGS) 생장억제능을 확인한 결과 100% 껍질 추출물의 경우 뚜렷한 억제활성은 없었으나 실험에 적용한 농도군(0.1~1.0mg/ml)에서 약 70~80%의 생존률을 나타내어 세포 생장에 일부 영향을 주는 것으로 생각되며, 9:1혼합물의 경우 농도별 처리군에서 농도 의존적인 생장억제능이 확인되었음. 특히, 1.0mg/ml의 농도에서는 30%정도의 세포 생존률을 보여 70%정도의 세포사멸을 확인하였음.
나. 발효옻 추출물의 항암 및 항염활성
○ 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법을 이용하여 본 연구에서는 항암 pathway에서 특정 primer를 제작하여 항암활성을 나타내는 부분을 확인. 특히, 위암세포를 대상으로 억제활성을 확인하기 위하여 mRNA 수준에서 PCR로 발현도를 확인함. 100% 껍질의 경우 농도별 처리에 의한 발현차이를 명확하게 확인하기는 어려웠으나, 9:1 혼합 추출물의 경우 고농도(1.0mg/ml)로 처리하였을 경우 c-myc, p53, caspase-9에서 발현도가 감소하는 것을 확인할 수 있음.
○ western-blot법을 이용하여 protein 수준에서도 확인된 바와 같이 AGS 위암세포 상에서 발효옻이 가지는 뚜렷한 억제 활성은 고농도로 갔을 때 band의 발현도가 저해되는 것을 확인 할 수 있었으며, 특히 caspase-9의 cleaved form이 증가됨을 확인하였음. 결과적으로 발효옻은 항암기작 중 일부분의 발현을 억제하지만 전반적인 위암발생억제기전에 있어 뚜렷한 활성을 가지고 있다고 판단하기 어렵다고 간접적으로 확인할 수 있는 결과임.
○ 항염증 활성의 경우 0.1~0.5mg/ml로 설정한 농도 범위 안에서 100%껍질 추출물, 9:1 혼합물, PGG 3종의 No 생성량을 확인하였음. 전반적으로 농도 의존적으로 No 생성량의 감소를 확인 할 수 있었으며, 특히 PGG의 경우 설정농도보다 10희석(0.001~0.05mg/ml)하여 측정한 결과로서 100%에 가까운 No 생성억제능을 확인 할 수 있었음.
○ COX-2와 iNOS primer를 제작하여 항염증 기전에 발효옻이 주는 영향을 확인하고, 분리된 물질인 PGG의 항염증 기전상에서의 효능을 mRNA 수준에서 검정하고자 PCR을 수행. 100% 껍질 추출물의 경우 LPS를 처리한 처리군에서 발현되는 band와 비교하였을 때 iNOS의 경우 250ppm처리군부터 점차적인 감소를 확인할 수 있으며 최종 처리 농도에서는 LPS 비처리군과 유사한 활성을 나타냄으로서 우수한 항염 활성을 확인함.
다. 발효옻 추출물의 H. pylori 성장억제활성
○ 발효옻은 일정농도로 희석한 후 H.pylori균을 도말한 배지에 접종한 후 생성된 억제환을 확인한 결과 100% 껍질의 경우 2.0mg을 접종하였을 때 5.0mm의 억제환을 확인하였으며, PGG의 경우 고농도로 희석할 경우 gel형태로 시료가 변하여 10배 희석하여 0.2mg을 접종하였을 때 9.0mm의 저해환을 0.02mg을 접종하였을 경우 3.0mm의 저해환을 나타냄으로서 높은 H.pylori 성장억제능을 가지고 있음을 확인함.
○ 인체적용시험을 위한 발효옻 첨가 시제품의 경우 1.0 mg의 농도에서 0.07mm의 저해환이 확인되었으며, 농도가 증가함에 따라 저해환의 범위가 증가 최종농도 5.0 mg의 농도에서는 0.37 mm의 저해환이 확인됨.
라. 발효옻 추출물 첨가 장류(된장, 고추장, 간장, 청국장) 기능성 검정
○ 장류 중에서는 청국장(0.51 mg·GAE/ml)에서 가장 높은 함량을 확인하였으며, 그 다음으로 된장, 간장, 고추장 순으로 페놀함량을 나타내었음. 청국장과 된장은 평균적으로 약 3.5배 정도의 함량차이를 나타내었음. 된장과 간장은 0.12~0.15 mg·GAE/ml으로 매우 유사함 함량을 가짐을 확인하였으며, 고추장(0.04~0.05 mg·GAE/ml)의 경우 비교적 함량이 매우 낮음을 확인.
○ 항산화 활성 실험결과 시료농도 1.0 mg/ml에서 15~20% 정도의 뚜렷한 활성 차이를 확인하였음. 첨가구 중 청국장의 경우 1.0 mg/ml의 농도에서 65.9%의 매우 높은 항산화능을 나타내었으며, 된장 37.8%, 간장 35.8%, 고추장 33.2%로 무첨가구.와 비교하였을 때 뚜렷히 높은 항산화 활성을 나타냄.
2. 원료부위별 발효옻 추출물의 특성규명
○ 참옻나무의 줄기전체, 껍질, 목질부위에 함유되어있는 총 phenol 함량은 원주산이 각각 15.73, 13.29, 13.21, 옥천산이 16.14, 16.63, 14.81 mg gallic acid/g db이었다. 총 flavonoid 함량은 원주산이 32.04, 15.16, 31.05, 옥천산이 45.51, 22.09, 43.48 mg quercetin/g db로 나타났다. Flavonoid 성분 중 fustin이 껍질 부위에서는 성분합계양의 98%이상, 줄기와 목질에서는 73.0-86.7%를 차지하는 주요성분이었다. Butein은 부위별로 0.31-2.17, fisetin은 0.27-3.32, sulfuretin은 0.15-0.80 mg/g db 함유되어 있었다.
○ 부위별 urushiol 함량의 합계는 각각 5.09-6.29, 55.05-56.30, 0.38-0.39 mg/100 g dry base로 껍질에 다량함유 되어 있었다. 껍질에 함유된 urushiol congener들의 분포는 C15:3(pentadecatrienyl catechol)이 63%, C15:1(pentadecenyl catechol)이 33-35%, C15:2(pentadecadienyl catechol)가 2-3% 함유되어 있다.
○ 발효옻 제작과정 중 urushiol과 flavonoid함량의 변화를 조사한 결과 urushiol은 수침, 물빼기, 살균공정에 의해서 줄어들지 않았지만 flavonoid함량은 많은 변화를 보였다. 두 성분은 모두 배양과정이 길어지면서 낮아졌다. 따라서 flavonoid함량을 높이면서 urushiol을 제거시킬 수 있는 적정조건을 찾을 필요가 대두되었다.
3. 발효옻 위건강 개선효과 임상
○ 국립농업과학원 발효이용과에서 제공받은 발효 옻 추출물을 사용하여 실험실 실험을 통해 발효 옻 추출물이 H. pylori제균에 효능을 보이는 minimal inhibitory concentration을 확인하였다. H. pylori를 배양하기 위한 Muller-Hinton Blood Agar Plate에 발효 옻 추출물을 농도별로 희석하여 H. pylori의 제균효과가 나타나는 농도를 측정하였다. 추후 기내 실험에서 확인된 생장억제 최적 농도를 동물실험에 적용하여, 마우스 체내에서 H. pylori 제균효과와 H. pylori에 의해 발생한 위 염증을 개선시키는지 여부를 판별하였다.
○ 본 연구팀이 진행한 기내실험에서는 옻나무의 재배지역(원주, 옥천)과 부위(껍질, 목질, 혼합)에 상관없이 2 mg/ml의 농도에서 최적의 제균효능을 확인하였다. 하지만 전임상 연구로 진행한 동물 실험에서는 2 mg/ml의 농도에서는 H. pylori 제균효과나 염증의 개선효과가 나타나지 않았고, 기내 실험에서 확인된 농도보다 높은 6 mg/ml의 농도에서 최상의 H. pylori 제균효과와 염증의 개선효과를 확인하였다.
4. 발효옻 위건강 개선 건강기능성 제품 개발
○ 반응표면분석법에 따른 발효옻의 추출 최적화 공정을 적립하고자하였다. 분석결과 온도가 증가함에 따라 추출수율이 증가함을 확인하였으며, 폴리페놀 함량과 세포증식억제능 또한 추출온도가 증가함에 따라 활성이 증가하였다.
○ 반응표면분석법에 따라 앞선 수율, 폴리페놀 함량, 세포증식억제능의 결과를 종합하였을 때 최적 추출 조건은 89.9 ℃, 9.2 hr and 25 mL/g로 확인되었다.
○ PGG(Penta-O-galloyl beta-D-glucose)의 제조공정을 거치며 원물대비 약 6배로 농축되어 생산되는 것으로 확인하였다.
○ 인체적용시험을 위한 위약 및 시제품을 개발하였으며, 시제품의 경우 발효옻 추출물을 1g/day 용량으로 섭취하도록 제조하였다. 시제품은 1일 2회 파우치(20 ml) 형태로 섭취하도록 하였으며, PGG는 1일 6~9.3 mg/day 섭취 할 수 있도록 함량을 조정하였다. 인체적용시험 시제품은 검사결과 유해성분(잔류농약, 대장균, 수은 등)이 검출되지 않음을 확인하였다.
5. 발효옻 추출물을 이용한 지역특화 상품 개발 및 산업화
가. 발효옻 생산최적화를 위한 분석기술 확립
○ 원료와 배양액의 첨가비율은 원료를 chip 형태로 절단한 다음 원료와 물을 1:1로 혼합하여 일정시간 보관하여 조직 내로 수분이 충분히 흡수되도록 한 다음 버섯 배양액을 첨가하여 발효하는 것이 최적 조건으로 확인되며, 판단된다. 장수버섯 균사체 첨가 후 적정 발효기간은 톱밥과 껍질에서 공통적으로 7∼10일 정도가 적합하며, 발효기간이 그 이상 경과하게 되면 urushiol 제거효과가 크기는 하지만 옻나무 주요 생리활성 성분들인 flavonoid나 phenolic acid 들도 상대적으로 많이 감소되는 경향을 보였다.
○ 다양한 생리활성을 지고고 있는 것으로 보고되어 있고 특히 위건강과 관련하여 H. pylori 생육 억제활성을 강한 것으로 알려져 있는 pentagalloyl glucose (PGG)는 껍질에서만 비교적 고농도 (5.7 mg/g)로 함유되어 있었으며, 발효과정에서의 분해도 gallic acid나 methyl gallate 또는 flavonoid보다 완만하게 일어나는 경향을 보였다.
○ 기능성 성분으로 확인된 PGG는 alcohol 농도에 따른 추출조건에서 30% alcohol 농도 이상에서 우수한 추출율을 확인하였으며, 버섯균발효에 의한 PGG의 분해산물로 기기분석경과 TetraGG, TriGG, DiGG, MonoGG로 그 구조를 확인하였다.
○ 발효 옻나무의 추출 용매로서 80% 에탄올 추출방법과 물 추출방법을 비교했을 때 물 추출방법이 80% 에탄올 추출방법에 비해 수율이 다소 높은 경향을 보였다.또한 추출물 중의 urushiol류와 flavonoid류의 함량을 분석한 결과 80% 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 flavonoid류의 함량이 높았고 동시에 80% 에탄올 추출물에서는 미량이나마 urushiol류가 검출되었으나 물 추출물에서는 거의 검출되지 않았기 때문에 발효 옻 추출을 위한 용매로서 물 추출방법이 보다 적합한 것으로 판단된다.
나. 발효옻 응용 장류 최적 레시피 시제품
○ 발효옻 추출물을 첨가한 간장, 고추장, 된장, 청국장환 등 4종 장류를 개발 완료하였으며 발효옻 추출액 첨가에 따른 장류 최적 혼합비율을 확인하였다.
○ 발효옻 추출물 첨가 장류 제조를 위하여 옻 고추장, 옻 된장 제조, 옻 간장 제시피를 설정하고 옻 고추장, 옻 된장 제조, 옻 간장 발효과정 중 이화학적 특성 조사를 완료하였다.
Rhus verniciflua, also known by the common name Chinese lacquer tree, is an Asian tree species of genus Rhus native to China and the Indian subcontinent, and cultivated in regions of China, Korea and Japan. Other common names include Japanese lacquer tree, Japanese sumac, and varnish tree. The trees
Rhus verniciflua, also known by the common name Chinese lacquer tree, is an Asian tree species of genus Rhus native to China and the Indian subcontinent, and cultivated in regions of China, Korea and Japan. Other common names include Japanese lacquer tree, Japanese sumac, and varnish tree. The trees are cultivated and tapped for their toxic sap, which is used as a highly durable lacquer to make Chinese, Japanese, and Korean lacquerware.
The leaves, seeds, and the resin of the Chinese lacquer tree are sometimes used in Chinese medicine for the treatment of internal parasites and for stopping bleeding. Compounds butein and sulfuretin are antioxidants, and have inhibitory effects on aldose reductase and advanced glycation processes.
A caustic, toxic sap, called urushiol, is tapped from the trunk of the Chinese lacquer tree to produce lacquer. This is done by cutting 5 to 10 horizontal lines on the trunk of a 10-year-old tree, and then collecting the greyish yellow sap that exudes. However, urushiol causes allergic skin rash, inflammation, and irritation on contact, known as urushiol-induced contact dermatitis. Despite of an allergic reaction to urushiol, the lacquer tree has been traditionally used in Korea as a folk remedy for the relief of abdominal discomfort as a form of boiled chicken soup.
Recently, Rhus verniciflua stokes(RVS) has been found to have various biological activites(antioxidant, anti-inflammatory), anti-cancer, anti-platelet etc. But, RVS has a limit to range edible because allergic reactions of the urushiol. We suggest that using mushroom strain(Fomitella fraxinea) can be the detoxification of the stem bark of RVS.
This study is ⅰ) Perform the standardization and characterization of the fermentation process from RVS using Fomitella fraxinea, ⅱ) The impact of gastrointestinal disease, identification and separation mechanism substances of fermented RVS, ⅲ) Identify with development potential to health functional food by using fermented RVS.
1. Identification of bioactive compounds from fermented Rhus verniciflua Stokes(FRVS) for healthy stomach
○ There has been little research on the antioxidant activities of fermented Rhus verniciflua(FRV) Stokes. This study was conducted to assess the effect on using Fomitella fraxinea fermented for nutritional and health-related properties such as total phenolic contents, DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrasyl) free radical scavenging activities and reducing power. Total phenolic content in FRV bark (0.082 ㎎·GAE/㎖) was higher than FRV mixture (0.037 ㎎·GAE/㎖). FRV bark and mixture have similar high antioxidant activities(88.0~90.5 %).
○ AGS(human gastric cancer) cell viability was determined using the MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. To evaluate anti-inflammatory activity, we examined the inhibitory effects on lipopolysaccharide-(LPS)-induced NO production in RAW 264.7 cells. AGS cell has 20~30 % inhibition rate of cell viability in FRV bark 0.1~1.0 mg/ml, but FRV mixture showed 70% inhibition rate in 1.0 mg/ml. The NO inhibition rate was close to 100% at 0.01~0.05 mg/㎖ PGG. Also, FRV bark and mixture showed higher NO production inhibition rate at the 0.25mg/ml. At same concentration, the expression of pro-inflammatory genes such as inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX)-2 also decreased.
2. Determine characteristics of different parts from fermented Rhus verniciflua Stokes(FRVS)
○ Fustin comprised >98 and 73.0–86.7% of the total flavonoid content in the bark, and the stems and lignum of Rhus verniciflua, respectively. The butein, fisetin, and sulfuretin content varied between 0.31–2.17, 0.27–3.32, and 0.15–0.80 mg/g on a dry weight basis, respectively, in different parts of Rhus verniciflua.
○ The urushiol content was 5.09–6.29, 55.05–56.30, and 0.38–0.39 mg/100 g on a dry weight basis in the stems, bark, and lignum, respectively. This showed that the bark of the tree had the highest urushiol content. C15:3 (pentadecatrienyl catechol), C15:1 (pentadecenyl catechol), and C15:2 (pentadecadienyl catechol) comprised 63, 33–35, and 2–3% of urushiol congeners in the tree bark, respectively.
3. Study of the Efficacy from fermented Rhus verniciflua Stokes for healthy stomach
A. Objective.
○ For, Helicobacter pylori (H. pylori ) eradication, standard triple therapy using clarithromycin, proton pump inhibitor and amoxicillin or metronidazole given for 1-2 weeks extensively uses in worldwide and reveals high eradication success rate, while it is have side effect such as antibiotic resistance, relapses.
○ Urushiol is a major component of sap of the R, verniciflua, has anti-inflammation, antimicrobial and antioxidative effect in mice. However, urushiol is the causative agent of allergic contact dermatitis. Fermented Rhus verniciflua extract (FRVE) is an urushiol-free extract. We evaluated minimal inhibitory concentrate of FRVE for H. pylori eradication, compared reduction rate of H. pylori and rate of improving for gastritis.
B. Design.
○ H. pylori Sydney strain 1 (SS1) was cultured in muller-hinton blood agar plate(MH-BAP) mixed with variated concentration of FRVE. Concentration eradicating H. pylori was monitored for use in animal experiments. Specific pathogen free mice infected H. pylori was innoculated checked FRVE in vitro. and was compared with mice treated Standard triple therapy. H. pylori eradication rate and gastritis improving was measured by pathologic analysis. inflammatory cytokines.
C. Results.
○ H. pylori was eradicated in MH-BAP mixed with FRVE of 1.5 - 2 mg/ml concentration. However. this concentration was not affected in viv. Eradication of H. pylori was shown from 3 mg/ml FRVE. The FRVE of 6 mg/ml concentration was significantly decreased H. pylori and improved gastritis at same time. These effect was significantly compared with mice with standard triple therapy However, rate of H. pylori eradication and gastritis improvement was decreased in concentration than higher 6 mg/ml, 8 and 16 mg/ml. The FRVE of 6 mg/ml concentration was not affected to proinflammatory cytokine, interleukin1-β and tumor necrosis factor-α, expression.
4. Development of health functional food by using fermented Rhus verniciflua Stokes(FRVS) for healthy stomach
A. Optimization of extraction process of fermented Rhus verniciflua Stokes by response surface methodology.
○ The yield increased with increasing temperature and the solvent ratio.
○ Polyphenol contents and inhibition effect of cell growth increased with increasing temperature.
○ Predicted levels of optimum conditions by the ridge analysis: 89.9 ℃, 9.2 hr and 25 mL/g.
B. PGG(Penta-O-galloyl beta-D-glucose) exhibited a concentration ratio of about 6 times according to manufacturing processes.
C. Making the investigational products for clinical trials
○ Intake: 1 g/day (20ml liquid, two pouchs a day)
○ Establishment of content criteria of marker compound : PGG 6∼9.2 mg/ day
○ Hazardous components were not detected (pesticide residues, coliforms, mercury, etc.).
5. Development and Industrialization of local specialized products by using fermented Rhus verniciflua Stokes(FRVS)
○ The content of total urushiol (C15:3, C15:2, C15:1) during RVSB fermentation with Fomitella fraxinea was decreased from 1,340 μg/g (dry base) to 177.7 μg/g (86.7%) and 67.0 μg/g (95.0% decreased) after 10-day and 14-day fermentation, respectively. The content of flavonoids (fustin, fisetin, sulfuretin, and butein) in RVSB was decreased from 4,869 μg/g to 1,938 μg/g (60.2%) after 10-day and 1,607μg/g (67.0% decreased) after 14-day fermentation. respectively.
○ On the other hand, a series of mono, di-, tri, and tetragalloyl derivatives were identified in fermented RVSB by HPLC and ESI-LC/MS analysis, and the experimental results using authentic compound showed that these compounds were originated from compound P by the hydrolytic action of tannin acyl hydrolase (tannase) from Fomitella fraxinea. The results suggest that optimal fermentation time to biodegradate urushiols in RVSB using Fomitella fraxinea, with the minimization of the degradation of biologically active compounds such as flavonoids and gallotannins are about 10∼14 days.
○ Application of FRVSB(fermented-Rhus verniciflua stem bark) extract in soybean paste making. The addition of FRVSB extract showed no effluence on the soybean paste making
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