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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 한약재의 미생물학적 안전성 확보를 위한 기초 자료로 활용하고자 서울 경동시장에 위치한 3곳의 약업사에서 임의로 13종의 한약재를 선정해서 이들에 대한 총 호기성 세균과 진균의 정량 평가 및 주요 오염 세균에 대한 분자적 확인을 수행하였다.
제안 방법
- 3곳의 약업사에서 구입한 13종의 한약재에 오염된 총호기성 세균 집락 들 중에서 각각의 한약재 별로 임의로 3개씩의 집락을 선택하여 전체적으로는 117개의 집락을 대상으로 16S rRNA의 염기서열 분석을 통해서 세균의 분자 동정을 실시하였다. PCR방법을 통해서 117개의 집락에서 목적하는 1.
- 5 kb의 목적하는 16S rDNA 밴드를 확인하고 gel extractin kit (Qiagen, Korea)를 사용해서 목적 밴드를 분리하였다. DNA 염기서열은 16S forward primer 와 BigDye v3.1 kit (Applied Biosystens, USA)를 사용해서 direct sequencing 반응을 수행한 한 후, Genetic Analysis 3100 (Applied Biosystens, USA)으로 분석하였다. 염기서열을 이용한 미생물의 동정은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 프로그램을 이용하여 수행하였다.
- PCR반응 조건은 94℃에서 5분간 변성과정을 거친 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 40초, 72℃에서 1분을 1회로 하여 총 35회 반응한 다음, 72℃에서 10분간 최종 증폭(final amplification) 반응을 수행하였다. PCR 산물은 1.5%의 agarose gel을 사용하여 전기영동을 통해서 약 1.5 kb의 목적하는 16S rDNA 밴드를 확인하고 gel extractin kit (Qiagen, Korea)를 사용해서 목적 밴드를 분리하였다. DNA 염기서열은 16S forward primer 와 BigDye v3.
- PCR은 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, USA)을 사용하였다. PCR반응 조건은 94℃에서 5분간 변성과정을 거친 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 40초, 72℃에서 1분을 1회로 하여 총 35회 반응한 다음, 72℃에서 10분간 최종 증폭(final amplification) 반응을 수행하였다. PCR 산물은 1.
- 3곳의 약업사에서 구입한 13종의 한약재에 오염된 총호기성 세균 집락 들 중에서 각각의 한약재 별로 임의로 3개씩의 집락을 선택하여 전체적으로는 117개의 집락을 대상으로 16S rRNA의 염기서열 분석을 통해서 세균의 분자 동정을 실시하였다. PCR방법을 통해서 117개의 집락에서 목적하는 1.5 kb의 16S rRNA 유전자를 확인(그림 1)한 후 BLAST 상동성 분석을 수행하였다.
- 각 단계별 희석액에서 1 ml을 취해서 petri dish에 넣고 45℃ 이하로 미리 보온해 둔 멸균된 tryptic soy agar (Himedia, India) 배지를 15∼20 ml 넣어 잘 혼합한 후 35℃에서 24시간 동안 배양하고 300개 이하의 집락을 보이는 평판배지를 대상으로 계수하였다.
- 본 연구에 사용된 13종의 한약재로부터 분리된 총 호기성 세균들중에서 임의로 각 3개씩의 집락을 선택하여 전체적으로 117개의 집락에 대한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 우선 집락을 이쑤시게를 사용해서 100 ul의 증류수가 첨가되어 있는 1.
- 각 단계별 희석액에서 1 ml을 취해서 petri dish에 넣고 45℃ 이하로 미리 보온해 둔 멸균된 sabouraud dextrose agar (Himedia, India) 배지를 15∼20 ml 넣어 잘 혼합한 후 20∼25℃에서 5일 동안 배양하고 100개 이하의 집락을 보이는 평판배지를 대상으로 계수하였다. 세균의 증식을 억제하기 위해서 sabouraud dextrose agar에 항세균제인 chloramphenicol (Sigma, USA)을 최종농도가 10 ug/ml이 되도록 첨가하였다.
- 5 ml 튜브에 넣고 교반기(Vision, Korea)를 사용하여 잘 혼합한 다음, 95℃의 heating block (FinePCR, Korea)에서 5분간 끓이고 실온에서 천천히 식혔다. 이후 이 용액 1 ul를 premix Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea)에 첨가한 다음, 16S forward primer (16S-F, 5-CGGAGAGTTTGATCCTGG) 와 reverse primer (16S-R, TACGGCTACCTTGTTACGAC) (Bioneer, Korea)를 각각 1 ul (5 pmole/ul)씩 넣었다. 최종 적으로 17 ul의 증류수를 첨가하여 혼합한 다음, PCR을 수행하였다.
- 각 단계별 희석액에서 1 ml을 취해서 petri dish에 넣고 45℃ 이하로 미리 보온해 둔 멸균된 tryptic soy agar (Himedia, India) 배지를 15∼20 ml 넣어 잘 혼합한 후 35℃에서 24시간 동안 배양하고 300개 이하의 집락을 보이는 평판배지를 대상으로 계수하였다. 진균의 증식을 억제하기 위해서 tryptic soy agar에 항진균제인 amphotericin B (Sigma, USA)를 최종농도가 100 ug/ml이되도록 첨가하였다.
- 이후 이 용액 1 ul를 premix Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea)에 첨가한 다음, 16S forward primer (16S-F, 5-CGGAGAGTTTGATCCTGG) 와 reverse primer (16S-R, TACGGCTACCTTGTTACGAC) (Bioneer, Korea)를 각각 1 ul (5 pmole/ul)씩 넣었다. 최종 적으로 17 ul의 증류수를 첨가하여 혼합한 다음, PCR을 수행하였다. PCR은 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, USA)을 사용하였다.
대상 데이터
- 각 단계별 희석액에서 1 ml을 취해서 petri dish에 넣고 45℃ 이하로 미리 보온해 둔 멸균된 sabouraud dextrose agar (Himedia, India) 배지를 15∼20 ml 넣어 잘 혼합한 후 20∼25℃에서 5일 동안 배양하고 100개 이하의 집락을 보이는 평판배지를 대상으로 계수하였다.
- 본 연구에 사용한 한약재는 2010년 6월 1일부터 2010년 7월 30일까지 2개월간 서울 경동시장에 위치한 3곳의 약업사에서 13종을 구매하여 사용하였다. 각 시료는 감마선 조사로 멸균된 밀봉용기에 넣어 운반하였으며 시료의 개봉은 개봉 부위의 바깥쪽을 70% ethanol로 세척 한 후에 멸균된 핀셋을 이용하여 약 10g의 시료를 채취하였다. 이 시료를 더욱 잘게 자른 후 멸균백에 넣고 90ml의 인산완충용액을 첨가한 다음 BagMixer 400 (Interscience, France)를 사용하여 시료를 균질화한 다음 총 호기성균 및 진균 검사를 위한 원액 시료로 사용하였다.
- 하지만 현재 우리나라는 한약재와 한약품에 대한 미생물 허용기준을 준비하기 위한 한약재 별 미생물 오염 실태 조사가 거의 없는 실정이다. 본 연구는 2010년 6월 1일부터 2010년 7월 30일까지 2개월간 서울의 경동시장에 위치한 3곳의 약업사에서 임의로 13종의 한약재를 선정하여 이들에 대한 총 호기성 세균 및 진균에 대한 미생물 오염 실태를 분석한 것으로 한약재 생산지에 따른 미생물 오염 정도는 본 연구에서는 고려하지 않았다.
- 본 연구에 사용한 한약재는 2010년 6월 1일부터 2010년 7월 30일까지 2개월간 서울 경동시장에 위치한 3곳의 약업사에서 13종을 구매하여 사용하였다. 각 시료는 감마선 조사로 멸균된 밀봉용기에 넣어 운반하였으며 시료의 개봉은 개봉 부위의 바깥쪽을 70% ethanol로 세척 한 후에 멸균된 핀셋을 이용하여 약 10g의 시료를 채취하였다.
- 각 시료는 감마선 조사로 멸균된 밀봉용기에 넣어 운반하였으며 시료의 개봉은 개봉 부위의 바깥쪽을 70% ethanol로 세척 한 후에 멸균된 핀셋을 이용하여 약 10g의 시료를 채취하였다. 이 시료를 더욱 잘게 자른 후 멸균백에 넣고 90ml의 인산완충용액을 첨가한 다음 BagMixer 400 (Interscience, France)를 사용하여 시료를 균질화한 다음 총 호기성균 및 진균 검사를 위한 원액 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 1 kit (Applied Biosystens, USA)를 사용해서 direct sequencing 반응을 수행한 한 후, Genetic Analysis 3100 (Applied Biosystens, USA)으로 분석하였다. 염기서열을 이용한 미생물의 동정은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 프로그램을 이용하여 수행하였다.
- 총 호기성 세균 수를 위한 정량시험은 대한약전 제8개정 미생물한도시험법을 기준으로 수행하였다[16]. 원액시료 1 ml을 멸균한 9 ml의 인산완충용액에 넣고 잘 혼합한 다음 다시 1 ml을 취하는 단계별 희석으로 10-9까지 희석하였다.
성능/효과
- 한편, 속단(Phlomisumbrosa)은 3곳의 약업사 모두에서 진균이 검출되지 않은 유일한 한약재임을 알 수 있었다. 3곳의 약업사에 대한 진균 오염 결과를 종합해 보면 맥문동(Liriopeplatyphylla), 방풍(Ledebouriella seseloides), 두충(Eucommia ulmoides), 속단(Phlomisumbrosa), 황정(Polygonatumodoratum), 산조인(Zizyphus jujuba) 등은 진균 오염이 적은 한약재로, 반면에 석창포(Acorusgramineus), 당귀(Angelicagigas), 백출(Atractylodes macrocephala), 우슬(Acyranthesbidentata)등은 진균 오염이 상대적으로 높은 한약재임을 추정할 수 있었다. 약업사 간 진균의 오염 정도는 총 호기성 세균수의 결과와 유사하게 A 약업사보다 B와 C 약업사의 한약재에서 진균의 오염 수준이 높은 것으로 나타났다.
- CFU/g를 기준[17,18]으로 각 약업사에서 샘플링 한 한약재를 비교해 보면 A 약업사의 13개 한약재에서만 모두 기준치 이하로 나타났다. 3곳의 약업사에서 구입한 13종의 한약재 별 총 호기성 세균수 오염 정도를 보면 황기(Astragalusmembranaceus), 방풍(Ledebouriella seseloides), 두충(Eucommia ulmoides), 산조인(Zizyphus jujuba)등은 대체적으로 총 세균수가 적게 나타난 반면에 상대적으로 총 세균수가 많은 한약재는 석창포(Acorusgramineus), 백출(Atractylodes macrocephala), 우슬(Acyranthesbidentata), 맥문동(Liriopeplatyphylla) 등 임을 알 수 있었다. 전체적으로 보면 A 약업사보다 B와 C 약업사가 총 호기성 세균수 오염이 심한 것으로 나타났다.
- 3곳의 약업사에서 한약재를 구입하여 총 호기성 세균수를 평가한 결과를 보면(표 1) B 약업사에서 구입한 한약재 중에서 석창포(Acorusgramineus)가 3.24×107로 가장 오염도가 높았으며 C 약업사의 경우에는 우슬(Acyranthesbidentata)과 맥문동(Liriopeplatyphylla)이 각각 7.30×107과 5.33×108으로 높은 오염도를 보여주었다.
- WHO의 세균 오염 한도인 107 CFU/g과 진균 오염 한도인 104 CFU/g을 기준[17, 18]으로 해서 보면 본 연구의 미생물 오염 실태 조사는 진균이 총 호기성 균보다 높은 오염율을 보였으며 약업사 A보다 B와 C의 약업사에 구입한 한약재의 미생물 오염도가 더 높음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 약업사의 보관 환경과 위생 수준의 차이 또는 한약재의 유통과정에서의 오염 등이 원인인 것으로 추정되지만 직접적인 오염 요인은 확인 할 수 없었다.
- 결과적으로 전체 117개의 총 호기성 세균 중에서 B. cereus가 59개로 50.4%를 차지하였으며, B. megaterium이 12개(10.2%), B. subtilus가 11개(9.4%), B. pumilus가 7개(5.9%), B. mycoides와 E. sakazakii가 각각 6개(5.1%), B. amyloliquefaciens가 4개(3.4%), B. sonorensis가 3개 (2.5%), B. pseudomycodes와 C. dublinensis가 각각 1개 (0.8%)씩 동정되었다(표 3). 한편, 4개 집락은 uncultured enterobacter (1종), uncultured bacterium (2종), uncultured bacillis (1종)으로 동정되었다.
- 본 연구에 사용된 한약재에서 확인된 세균들은 전체적으로 10종으로 확인되었으며 대부분이 B. cereus를 포함한 토양에서 유래하는 Bacillus 속의 세균이었다. 그런데 이들 Bacillus 속 미생물은 대부분이 포자를 형성하는 세균으로 고온에서도 균이 사멸하지 않는 특성을 갖고 있어 한약의 가공과정에 혼입되게 되면 식중독 유발 가능성도 배제하기 어렵다.
- 3곳의 약업사에 대한 진균 오염 결과를 종합해 보면 맥문동(Liriopeplatyphylla), 방풍(Ledebouriella seseloides), 두충(Eucommia ulmoides), 속단(Phlomisumbrosa), 황정(Polygonatumodoratum), 산조인(Zizyphus jujuba) 등은 진균 오염이 적은 한약재로, 반면에 석창포(Acorusgramineus), 당귀(Angelicagigas), 백출(Atractylodes macrocephala), 우슬(Acyranthesbidentata)등은 진균 오염이 상대적으로 높은 한약재임을 추정할 수 있었다. 약업사 간 진균의 오염 정도는 총 호기성 세균수의 결과와 유사하게 A 약업사보다 B와 C 약업사의 한약재에서 진균의 오염 수준이 높은 것으로 나타났다.
- 3곳의 약업사에서 구입한 13종의 한약재 별 총 호기성 세균수 오염 정도를 보면 황기(Astragalusmembranaceus), 방풍(Ledebouriella seseloides), 두충(Eucommia ulmoides), 산조인(Zizyphus jujuba)등은 대체적으로 총 세균수가 적게 나타난 반면에 상대적으로 총 세균수가 많은 한약재는 석창포(Acorusgramineus), 백출(Atractylodes macrocephala), 우슬(Acyranthesbidentata), 맥문동(Liriopeplatyphylla) 등 임을 알 수 있었다. 전체적으로 보면 A 약업사보다 B와 C 약업사가 총 호기성 세균수 오염이 심한 것으로 나타났다.
- 7%)의 한약재가 기준 이상임을 알 수 있었다. 특히 천궁(Cnidiumofficinale)의 경우는 3곳의 약업사 모두에서 진균 오염이 심한 한약재로 나타나 한약재에 따라서 진균의 오염 정도가 다를 수 있음을 추정할 수 있었다. 한편, 속단(Phlomisumbrosa)은 3곳의 약업사 모두에서 진균이 검출되지 않은 유일한 한약재임을 알 수 있었다.
- 13종류의 한약재 별로 특이적인 세균의 오염은 확인되지 않았으나 일반적으로 한약재가 재배 혹은 채취되는 장소가 토양임을 감안할 때 토양 유래의 미생물이 주류를 차지하는 것으로 여겨진다. 하지만, 열 저항성 내생포자를 형성할 수 있는 병원성 세균인 B. cereus등을 포함하는 Bacillus 속 세균[19,20]의 오염과 장내 세균으로서 특히 유제품과 분유를 통해 신생아에게 식중독을 일으키는 E. sakazakii [21]가 한약재에서도 오염될 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 8%)씩 동정되었다(표 3). 한편, 4개 집락은 uncultured enterobacter (1종), uncultured bacterium (2종), uncultured bacillis (1종)으로 동정되었다. 13종류의 한약재 별로 특이적인 세균의 오염은 확인되지 않았으나 일반적으로 한약재가 재배 혹은 채취되는 장소가 토양임을 감안할 때 토양 유래의 미생물이 주류를 차지하는 것으로 여겨진다.
- 특히 천궁(Cnidiumofficinale)의 경우는 3곳의 약업사 모두에서 진균 오염이 심한 한약재로 나타나 한약재에 따라서 진균의 오염 정도가 다를 수 있음을 추정할 수 있었다. 한편, 속단(Phlomisumbrosa)은 3곳의 약업사 모두에서 진균이 검출되지 않은 유일한 한약재임을 알 수 있었다. 3곳의 약업사에 대한 진균 오염 결과를 종합해 보면 맥문동(Liriopeplatyphylla), 방풍(Ledebouriella seseloides), 두충(Eucommia ulmoides), 속단(Phlomisumbrosa), 황정(Polygonatumodoratum), 산조인(Zizyphus jujuba) 등은 진균 오염이 적은 한약재로, 반면에 석창포(Acorusgramineus), 당귀(Angelicagigas), 백출(Atractylodes macrocephala), 우슬(Acyranthesbidentata)등은 진균 오염이 상대적으로 높은 한약재임을 추정할 수 있었다.
후속연구
- 최근 외국으로부터 생약의 수입량이 증가하면서 이에 대한 미생물학적 안전성에 대한 문제인식이 대두되고 있으나 이들 기준 마련을 위한 기초 연구자료 조차도 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서 임의로 선정한 13종의 한약재 별 미생물학적 오염도 평가는 한약재의 채취, 보관 그리고 유통과 관련한 미생물학적 오염 한도의 기준을 마련하는 데에 중요한 기초자료로 제공될 것으로 생각된다.
- 한편, Brown 등[23-28]은 herbal product를 대상으로 한 항생제 저항성 세균의 오염 연구에서 생강, 로즈마리, 마늘, 겨자, 히드라스티스 등에서 ceftriaxone 저항성 세균의 오염을 확인하여 이들 한약재의 생산과 이용에 대한 폭 넓은 평가의 필요성을 제기하기도 하였다. 따라서 향후 한약재의 미생물 오염 한도 기준을 마련하기 위해서는 항생제 내성 세균의 정성 평가 항목도 포함되어야 할 것으로 사료된다.
- 아플라톡신은 완전히 건조되지 않는 생약 등이 환기가 잘 되지 않고 습도와 온도가 높은 장소에서 장기간 저장되거나 홍수, 우기에 수확 시기부터 건조시기까지 저장기간이 길고 환기가 잘 되지 않는 시기에 더욱 잘 생성될 수 있기 때문에 한약재에 대한 보관, 유통, 채취 조건에 관한 세밀한 평가가 필요하다[24,29,30]. 본 연구에서는 진균류를 대상으로 정량적 평가만을 제시하기 때문에 이들 아플라톡신을 생성시키는 곰팡이의 존재 여부는 확인할 수 없었다. 하지만 WHO 기준과 비교해 볼 때 총 호기성 세균수보다 총 진균수의 오염 수준이 비교적 더 높은 것으로 나타나 진균의 오염관리와 함께 아플라톡신 생성 균의 존재여부 그리고 아플라톡신의 함유 정도 등에 관한 세밀하고 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
- 본 연구에서는 진균류를 대상으로 정량적 평가만을 제시하기 때문에 이들 아플라톡신을 생성시키는 곰팡이의 존재 여부는 확인할 수 없었다. 하지만 WHO 기준과 비교해 볼 때 총 호기성 세균수보다 총 진균수의 오염 수준이 비교적 더 높은 것으로 나타나 진균의 오염관리와 함께 아플라톡신 생성 균의 존재여부 그리고 아플라톡신의 함유 정도 등에 관한 세밀하고 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
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