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문제 정의
- 또한, 본 실험에서는 플라보노이드의 적정 농도와 처리 효과를 조사하기 위하여 체세포 핵이식 배아에 적용하기 앞서 단위 발생 배아에 그 사용 여부를 조사하였다. 플라보노이드를 1, 10과 20 pM 농도로 나누어 대조군과 비교 조사하였던 바, 10 pM 농도에서 발달율 및 총 세포수 증가를 확인하였으며, 특히 내부 세포괴수 중가를 확인하였다.
- 본 연구에서는 멸종 위기 제주흑우의 대량 증식을 위한 연구 목적으로 우량 종모우의 체세포를 이용하여 핵이식을 실시하고 여기에서 발생된 배아를 합성 플라보노이드 (3, 4-dihydroxyflavone)가 첨가된 배양액에서 배양하여, 플라보노이드가 체외 배 발달에 미치는 영향 및 여기에서 생산된 7~8일째 배아를 이식한 후 임신과 분만율에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 플라보노이드의 농도 적정화를 위해 단위 발생 배아에서 그 효과를 분석하였다.
제안 방법
- 단위 발생을 위해 체외 성숙된 난자를 lmg/ml hyalu- ronidase(Sigma)를 이용하여 난구세포를 제거하고 중분히세척한 다음 5 iiM Ca-ionophore(Sigma)에 5분 노줄시키고, 이어서 2.0 mM 6"dimefhylaminopurine(DMAP)에 3시간 배양하여 활성화를 유도하였으며, 3 mg/ml FAF-BSA (Sigma)가 들어있는 CRlaa 배양액에 넣어 배양하고 배양 4일 째에 10% FBS가 들어있는 CRlaa 배양액에 옮겨 4일간 추가 배양하였다. 이때에 실험군은 대조군과 플라보노이드 [3z4z-dihydroxyflavone(ICC, INDOFINE Chemical Company, Inc, NJ, USA)]를 1, 10과 20 uM 처리한 군으로 나누어 배 발달을 조사하였고, 플라보노이드는 2일 간격으로 배양액에 첨가하였다.
- 각각의 검사 샘플에서 유전물질인 DNA를 추출하고, 특정 유전자를 동시에 증폭하여, 여러 유전자 좌위에서 체세포와 복제 송아지가 일치하는지와 대리모 소와 복제 송아지가 일치하지 않은지의 여부를 조사하였다. ISAG (International Sodety of Animal Genetics, 국제동물유전학회) 11개의 친자 감별 표지 인자들을 사용하여 TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115Z TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225, BM1824) 각 primer 의 forwrad 에 형광 dye를 labeling하고 PCR을 실시하였다. 검체의 PCR 산물은 형광을 분석하는 3100 genetic analyzer 기기를 이용하여 샘플 별로 peak 크기를 계산하여 각각의 표지 인자들의 반복성을 조사하였다.
- 결과는 DyNAmo SYBR green qPCR 키트를 사용하였다. PCR 과정은 95℃에서 15분간 변성 과정을 거친 다음, 증폭과 정량을 위해 94℃에서 30초간, 50 -56℃ 1분간, 72℃ 1분으로 40회수를 반복하였고, 형광 측정을 했다. 이때의 melting curve는 65~95℃, heating rate는 0.
- 5. STR (난tandem repeat) profile investigated fall DNA fingerprint of cloned calf (Heuk Young Dolee, BK01-10)z somatic cell and surroete mother i诚ng STR marker.
- 본 연구에서는 제주특별자치도 죽산진흥원에서 보유하고 있던 제주 흑우 우량 종모우 2두의 귀 세포를 2007녀에 채취하여 배양 증식한 후 냉동 보관하였디.가, 융해하여 5계대에서 15계대에 해당하는 건강한 체세포를 이용하여 핵이식을 실시하였다. 또한, 플라보노이드 처리와 무처리군으로 나누어 체외배양된 7~8일째 배반포기배는 서울에서 비행기로 제주까지 공수하였고, 배양기에서 꺼내어 대리모 소에 이식하기까지 대략 4시간 소요되었다.
- 각각의 검사 샘플에서 유전물질인 DNA를 추출하고, 특정 유전자를 동시에 증폭하여, 여러 유전자 좌위에서 체세포와 복제 송아지가 일치하는지와 대리모 소와 복제 송아지가 일치하지 않은지의 여부를 조사하였다. ISAG (International Sodety of Animal Genetics, 국제동물유전학회) 11개의 친자 감별 표지 인자들을 사용하여 TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115Z TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225, BM1824) 각 primer 의 forwrad 에 형광 dye를 labeling하고 PCR을 실시하였다.
- ISAG (International Sodety of Animal Genetics, 국제동물유전학회) 11개의 친자 감별 표지 인자들을 사용하여 TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115Z TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225, BM1824) 각 primer 의 forwrad 에 형광 dye를 labeling하고 PCR을 실시하였다. 검체의 PCR 산물은 형광을 분석하는 3100 genetic analyzer 기기를 이용하여 샘플 별로 peak 크기를 계산하여 각각의 표지 인자들의 반복성을 조사하였다. 검사 결과는 검사한 모든 유전자 좌위에서 일치할 경우 친자라고 판명하고, 3개 이상의 유전자 좌위에서 불일치할 경우 친자가 아니라고 판명하였다.
- 또한, 본 연구에서 플라보노이드 처리된 단위 발생 배아의 세포 사멸율을 조사하였던 바, 유의하게 감소되는 경향을 TUNEL 분석 방법을 통하여 확인하였다. 플라보노이드는 앞서 언급한대로 산소 래디컬이나 질소 유리 래디컬을감소시키는 항산화 작용을 하고 산소 래디컬이 생성되는 일차 단계를 막아 연쇄 산화 반응을 억제시키는 것으로 알려져 있으며, 종양 형성 억제 및 사멸, 분화와 세포 주기 조절 등의 항산화 기능이 있는 것으로 알려져 있다(Afanasiev 등, 1989).
- 본 연구에서는 멸종 위기 제주흑우의 대량 증식을 위한 연구 목적으로 우량 종모우의 체세포를 이용하여 핵이식을 실시하고 여기에서 발생된 배아를 합성 플라보노이드 (3, 4-dihydroxyflavone)가 첨가된 배양액에서 배양하여, 플라보노이드가 체외 배 발달에 미치는 영향 및 여기에서 생산된 7~8일째 배아를 이식한 후 임신과 분만율에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 플라보노이드의 농도 적정화를 위해 단위 발생 배아에서 그 효과를 분석하였다.
- 배아는 다시 세척한 다음, 광이 차단된 37℃ 배양기에서 형광물질이 부착된 dUTP와 terminal deoxynucleo tidyl 전환 효소(Roche, Mannheim, Germany) 에 1시간 반응시키고, 40 mg/ml PL와 50 mg/ml RNase A(Takara, Shiga, Japan) 용액에 넣어 1시간 핵 염색을 실시하였다. 반응이 끝난 배아는 충분히 세척하고 슬라이드 글라스에 옮겨 형광현미경의 green 필터 (excitation, 460 —495 nm; emission, 510—550 run)와 red ^^(excitation, 510 —550 nm; emission, 4590 nm) 하에서 관찰하였다. 배아 내 살아 있는 세포 핵은 붉게 염색되는 반면, 사멸 핵은 녹색으로 염색되면서 파편화되는 양상을 나타내므로 두 가지 색을 합쳐 조사함으로써 총세포핵수에서 사멸 핵 수를 백분율로 나타내어 세포 사멸 정도를 계산하였다.
- 반응이 끝난 배아는 충분히 세척하고 슬라이드 글라스에 옮겨 형광현미경의 green 필터 (excitation, 460 —495 nm; emission, 510—550 run)와 red ^^(excitation, 510 —550 nm; emission, 4590 nm) 하에서 관찰하였다. 배아 내 살아 있는 세포 핵은 붉게 염색되는 반면, 사멸 핵은 녹색으로 염색되면서 파편화되는 양상을 나타내므로 두 가지 색을 합쳐 조사함으로써 총세포핵수에서 사멸 핵 수를 백분율로 나타내어 세포 사멸 정도를 계산하였다.
- 수란우의 임신 진단은 수정란 이식 후 2개월에 직장 검사법에 의하여 임신 여부를 진단하였다. 분만 시기가 가까이 올 10~20일 전부터 수란우의 분만 징후를 관찰하고 적절한 시기에 정상적인 분만이 이루어지도록 유도하였다.
- 소 체세포 핵이식 배아를 플라보노이드 첨가 유무에 따라 나누어 배양한 후 체외배양 8일째 생산된 배반 포기 배를 대리모에 이식하였다. Table 4에 나타낸 바와 같이, 대조군의 경우 34두에서 2두(5.
- 1% triton X-100(Sigma)과 100 U g/ml propidium iodide(PI, Sigma)가 첨 가된 TL- HEPES 용액에서 30초간 처리한 후 바로 25 Hoechst 33258(Sigma)가 첨가된 100% ethanol 용액에 넣어 4℃에서 다음날까지 정치시켰다. 염색된 배반포기배는 글리세롤로 세척하여 여분의 형광물질을 제거한 다음 슬라이드 글라스에 올려 형광 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)의 blue 필터(excitation, 330—385 nm; emission, >420 run) 하에서 관찰하여 내부 세포괴와 영양 외배엽 세포수를 분석하.였다.
- 0 mM 6"dimefhylaminopurine(DMAP)에 3시간 배양하여 활성화를 유도하였으며, 3 mg/ml FAF-BSA (Sigma)가 들어있는 CRlaa 배양액에 넣어 배양하고 배양 4일 째에 10% FBS가 들어있는 CRlaa 배양액에 옮겨 4일간 추가 배양하였다. 이때에 실험군은 대조군과 플라보노이드 [3z4z-dihydroxyflavone(ICC, INDOFINE Chemical Company, Inc, NJ, USA)]를 1, 10과 20 uM 처리한 군으로 나누어 배 발달을 조사하였고, 플라보노이드는 2일 간격으로 배양액에 첨가하였다.
- 체세포 핵이식 후 난할된 복제 배아를 배양 2일째부터 나누어 10 uM 플라보노이드 처리 후, 체외 배 발달 율과 이중 형광 염색을 이용한 세포수 분석을 실시하였다. Table 3에 나타낸 바와 같이, 체외 배양 8일째 배반포기배 발달율은 플라보노이드 처리군이 30.
- 체세포 핵이식으로 복제되고 이식되어 태어난 소의 복제 유무를 검정하기 위해 핵이식에 이용된 체세포, 수란 우의 근육세포와 복제 송아지의 귀세포의 유전자 검정을 실시하였다. 각각의 검사 샘플에서 유전물질인 DNA를 추출하고, 특정 유전자를 동시에 증폭하여, 여러 유전자 좌위에서 체세포와 복제 송아지가 일치하는지와 대리모 소와 복제 송아지가 일치하지 않은지의 여부를 조사하였다.
- 25% trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 단일세포로 분리한 후 10% FBS가 첨가된 체세포 배양액으로 한번 세척한 후 다시 PBS로 세척하여 준비하였고, 10-15 pm 크기만을 골라 체세포 주입용 피펫으로 핵이 제거된 수핵 난자의 투명대와 세포질 사이의 공간으로 주입하였다. 체세포가 주입된 난자는 0.3M mannitol(Sigma) 용액 내에서 LF101 Electro Cell Fusion Generator(NEPA GENE, Shio- yaki, Japan)을 사용하여 직류(DC)로 20 volt에서 1 pulse 로 세포 융합을 실시하였으며, 세포 융합 여부는 30분 후에 관찰하였다. 융합이 확인된 핵이식란은 5 pM Ca-iono- phore에 5분 노출시키고 2.
- 체외성숙된 소 수핵 난자는 0.1% hyaluronidase가 첨가된 TL-HEPES 배양액에서 난구세포를 제거한 뒤 제 1극체가 방출된 난자만을 선별하여 사용하였다. 탈핵될 난자는 0.
- 플라보노이드 처리가 소 단위발생란의 체외 배양 시 유전자 발현에 미치는 영향을 real-time PCR 분석을 통해 조사하였다. 대조군과 비교하여 10 pM 플라보노이드 처리 군에서 산화 유전자인 Sox 발현의 감소와 항산화 유전자인Mn-SOD 발현이 증가되어 항산화 효과가 있음을 알 수 있었고, 사멸유전자인 Caspase-3와 Bax의 발현율 감소, 항사멸유전자인 Survivin과 Bax inhibitor의 발현이 유의하게증가되어 세포 사멸 감소 효과가 있음을 예측할 수 있었다.
- 또한, 본 실험에서는 플라보노이드의 적정 농도와 처리 효과를 조사하기 위하여 체세포 핵이식 배아에 적용하기 앞서 단위 발생 배아에 그 사용 여부를 조사하였다. 플라보노이드를 1, 10과 20 pM 농도로 나누어 대조군과 비교 조사하였던 바, 10 pM 농도에서 발달율 및 총 세포수 증가를 확인하였으며, 특히 내부 세포괴수 중가를 확인하였다. 한편, 10 11M 이하의 농도는 효과에 있어서 차이가 없었으나, 20 11M 농도는 유의하게 낮은 발달율을 나타내었던 바, 낮은 농도에서는 항산화 작용을 나타내지만' 이와는 반대로 적정 수준 이상의 높은 농도에서는 산화 작용을 나타낸다는 다른 연구자의 연구 결과와 유사한 결과를 나타내었다 (Wang 등, 2007a).
- 0 mM DMAP에서 3시간 동안 배양하여 난활성을 유도하였다. 핵이식 후 활성화 처리된 난자는 3 mg/ml FAF-BSA가 들어있는 CRlaa 용액에 옮겨 배양하고, 배양 24시간 째 분열된 분할구가 보이는 핵이식 배아는 10% FBS가 들어있는 CRlaa 배양액으로 체세포와 공동 배양을 실시하였으며, 배양 2일째부터 플라보노이드 처리군과 무처리군으로 나누어 배양하였다.
대상 데이터
- 15 M LiCl and 1 mM EDTA]로 1회 세적한 다음 DEPC water 15 ul에 pellet을 녹여 마그네틱 비드로부터 mRNA 시료를 획득하였다. cDNA 합성은 추출한 mRNA로 부터 oligo(dT) 12-18 프라이머와 superscript reverse transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 이루어졌다. Real-time PCR(Bio-Rad, Chromo4)°fl 사용된 프라이머는 Table 1에 나타낸 바와 같다.
- 5 u 잉ml cytochalasin B (Sigma)가 첨가된 TCM-HEPES 용액에서 10분간 염색한 뒤 형광현미경 하에서 제 1극체와 핵을 제거하였다. 공여체 세포는 2008년 제주특별자치도 축산진흥원 소재 제주 흑우 종모우(BK01-10과 BK94T3)의 귀세포를 채취하여 체외에서 배양하여 동결 보관하였던 것으로 필요 시 융해하여 5~15 계대의 세포를 사용하였다. 핵이식 시 공여 체세포는 0.
- 0), 1% LiDS, 5 mM DTT]에 넣어 실온에서 5분간 교반 하면서 반응을 유도하고, 여기에 50 ul oligo(dT)25 마그네틱비드 용액을 넣어 다시 5분간 반응시켰다. 마그네틱 비드에 결합된 mRNA는 세척용 버퍼 A [10 mM Tris-HG (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 1% LiD] 로 2회 세척하고, 버퍼 B [10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.15 M LiCl and 1 mM EDTA]로 1회 세적한 다음 DEPC water 15 ul에 pellet을 녹여 마그네틱 비드로부터 mRNA 시료를 획득하였다. cDNA 합성은 추출한 mRNA로 부터 oligo(dT) 12-18 프라이머와 superscript reverse transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 이루어졌다.
- Real-time PCR(Bio-Rad, Chromo4)°fl 사용된 프라이머는 Table 1에 나타낸 바와 같다. 모든 실험에서 히스톤 2a mRNA를 기준으로 사용하였다. 결과는 DyNAmo SYBR green qPCR 키트를 사용하였다.
- 본 실험에 공시될 소 난자는 도축장에서 채취한 난소를 2~4시간 이내에 32~37℃ 생리 식염수에 유지하여 실험실로 운반한 뒤 직경이 2~6 nun의 난포로부터 채취하여 사용하였다. 실체 현미경하에서 획득된 미성숙난자는 난구 세포가 부착되어 있고, 세포질이 균일한 난자 만을 선별하였으며, TL-HEPESS.
- 지금까지 많은 연구자들에 의해 체세포 핵이식과 복제 수정란의 발달에 대한 다양한 연구들이 계속되어 왔다 (Kato 등 1998: Wells 등, 1999: Kubota 등, 2000). 본 연구에서는 제주특별자치도 죽산진흥원에서 보유하고 있던 제주 흑우 우량 종모우 2두의 귀 세포를 2007녀에 채취하여 배양 증식한 후 냉동 보관하였디.가, 융해하여 5계대에서 15계대에 해당하는 건강한 체세포를 이용하여 핵이식을 실시하였다.
데이터처리
- 단위발생란과 핵이식 배아의 체외 배발달율, 세포수 조사, apoptotic index와 유전자 발현율 비교에 대한 결과는 SAS program을 이용하여 분석하였으며, 처리 간 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 검정하였다.
이론/모형
- 모든 실험에서 히스톤 2a mRNA를 기준으로 사용하였다. 결과는 DyNAmo SYBR green qPCR 키트를 사용하였다. PCR 과정은 95℃에서 15분간 변성 과정을 거친 다음, 증폭과 정량을 위해 94℃에서 30초간, 50 -56℃ 1분간, 72℃ 1분으로 40회수를 반복하였고, 형광 측정을 했다.
- 배반포기배의 세포수 조사는 다음과 같은 간편 이 중 염색 방법을 통해 실시하였다. 1% triton X-100(Sigma)과 100 U g/ml propidium iodide(PI, Sigma)가 첨 가된 TL- HEPES 용액에서 30초간 처리한 후 바로 25 Hoechst 33258(Sigma)가 첨가된 100% ethanol 용액에 넣어 4℃에서 다음날까지 정치시켰다.
성능/효과
- 대조군과 비교하여 10 pM 플라보노이드 처리 군에서 산화 유전자인 Sox 발현의 감소와 항산화 유전자인Mn-SOD 발현이 증가되어 항산화 효과가 있음을 알 수 있었고, 사멸유전자인 Caspase-3와 Bax의 발현율 감소, 항사멸유전자인 Survivin과 Bax inhibitor의 발현이 유의하게증가되어 세포 사멸 감소 효과가 있음을 예측할 수 있었다. 또한, 대사와 관련된 Glut-5와 착상 유전자인 I"-㎛의 발현이 플라보노이드 처리군에서 유의하게 (p<0.05) 증가하는것을 확인하였다(Fig. 3).
- 이러한 기능은 플라보노이드 처리에 따른 유전자 발현 조사에서도 확인되고 있다. Real-time PCR을 이용하여 발현 정도를 무처리군과 비교하였을 때, 플라보노이드 처리군에서 내인성 항산화 유전자인 Mn-SOD의 발현이유의 하게 증가되었으며, Survivin, Bax inhibitor 1과 같은 항 사멸 유전자의 발현도 유의하게 증가됨을 확인하였다. 또한 본 실험에서 사용된 플라보노이드는 사멸인자의 발현억제와 더불어 항산화 및 항사멸 효과로 성장과 관련된 대사 유전자인 Glut-5와 착상유전자인 In-tau 등의 유의한 발현 증가를 가져오게 함으로써 건강한 배아 발생으로 체세포 핵이식 배아의 발생을 가능하게 했을 것으로 사료된다.
- Table 3에 나타낸 바와 같이, 체외 배양 8일째 배반포기배 발달율은 플라보노이드 처리군이 30.7%로 대조군 26.0%보다 더 높았으며, 총 세포 수(164.3±13.5)와 내부 세포괴수(50.0±5.8) 도 대조군의 결과(135.6±6.3, 35.6±6.9)와 비교하여 유의적으로 (P<0.05) 높은 것을 확인하였다.
- 검체의 PCR 산물은 형광을 분석하는 3100 genetic analyzer 기기를 이용하여 샘플 별로 peak 크기를 계산하여 각각의 표지 인자들의 반복성을 조사하였다. 검사 결과는 검사한 모든 유전자 좌위에서 일치할 경우 친자라고 판명하고, 3개 이상의 유전자 좌위에서 불일치할 경우 친자가 아니라고 판명하였다.
- 항사멸 효과는 수정 란의 세포분열을 돕고 발달을 돕는다. 그 결과, 본 연구에서 체세포 핵이식으로 발달된 배아의 세포 수를 살펴보면 종 세포수뿐만 아니라 내부 세포괴수에서도 대조군에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다. 이와 더불어 플라보노이드를 처리한 배양환경에서 자란 체세포 복제 배아는 이식 후 10개월 후에 형태 이상이나 신체 기관 이상 없이 정상적으로 태어났으며, 병적 소인 없이 잘 성장하였다.
- 대조군과 비교하여 10 pM 플라보노이드 처리 군에서 산화 유전자인 Sox 발현의 감소와 항산화 유전자인Mn-SOD 발현이 증가되어 항산화 효과가 있음을 알 수 있었고, 사멸유전자인 Caspase-3와 Bax의 발현율 감소, 항사멸유전자인 Survivin과 Bax inhibitor의 발현이 유의하게증가되어 세포 사멸 감소 효과가 있음을 예측할 수 있었다. 또한, 대사와 관련된 Glut-5와 착상 유전자인 I"-㎛의 발현이 플라보노이드 처리군에서 유의하게 (p<0.
- 2와 같다. 대조군과 처리군 간의 총세포수는 유의한 차이를 나타내지 않으나, 세포 사멸율(apoptotic index)은 대조군(12±3.2)에 비해 10 iiM 플라보노이드 처리군(4±2.5)에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였디(Fig. 2).
- 1). 따라서, 체외발달율과 세포수 조사 결과를 바탕으로 플라보노이드 처리의 최적 농도로 io U M을 선택하였다.
- Real-time PCR을 이용하여 발현 정도를 무처리군과 비교하였을 때, 플라보노이드 처리군에서 내인성 항산화 유전자인 Mn-SOD의 발현이유의 하게 증가되었으며, Survivin, Bax inhibitor 1과 같은 항 사멸 유전자의 발현도 유의하게 증가됨을 확인하였다. 또한 본 실험에서 사용된 플라보노이드는 사멸인자의 발현억제와 더불어 항산화 및 항사멸 효과로 성장과 관련된 대사 유전자인 Glut-5와 착상유전자인 In-tau 등의 유의한 발현 증가를 가져오게 함으로써 건강한 배아 발생으로 체세포 핵이식 배아의 발생을 가능하게 했을 것으로 사료된다.
- 이와 같은 배아 이식 시스템은 이미 본 연구소에서 확립되어 엘리트 체외수정란을 생산하고 이식하여 44%(18/44)의 분만율을 얻은 바 있으며, 체외 발생된 배반포기배를 서울에서 제주까지 공수할 때에 배아 운반용 배양액 내에 플라보노이드를 넣고 4시간 이내에 운반하면 배아의 건강도를 유지할 수 있고 임신율도 감소되지 않는다는 것을 보고한 바 있다(Park 등, 2009). 또한' 본연구에서는 플라보노이드 처리는 체세포 핵이식 배아의 항산화, 항사멸 효과와 더불어 대사 관련 유전자 발현의 증가 그리고 착상 유전자의 발현 증가를 유의하게 가져올 수 있음을 알 수 있었다. 항사멸 효과는 수정 란의 세포분열을 돕고 발달을 돕는다.
- 한편, 10 pM 처리군과 비교하여 1 pM 처리군에서는 유사한 발달율을 나타낸 반면 20 iiM 처리 군은 유의하게 낮은 발달율을 나타내었다. 또한, 이 중 형광염색을 통한 세포수 조사에서도 대조군, 1 pM과 20 pM 처리군의 종세포수와 내부 세포괴수는 유의한 차이가 없었던 반면 10 pM 처리군의 총세포수와 내부 세포괴수는 대조군과 다른 처리군에 비해 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났다(Table 2와 Fig. 1). 따라서, 체외발달율과 세포수 조사 결과를 바탕으로 플라보노이드 처리의 최적 농도로 io U M을 선택하였다.
- 본 연구에서 분만된 소 중 2009년 3월 11일에 태어난 첫 번째 제주흑우 복제 씨수소(“흑영돌이〃 명명' 孔 Fig. 4) 는현존하는 흑우 중 육량 형질이 제일 우수한 종모우(BK 01 ~W)가 복제된 것이며, 2009년 9월 9일에 태어난 두 번째 복제 소(〃흑제돌이〃 명명, 殆)는 육질 형질이 우수하여 근내 지방도가 높고 1등급 이상이 95% 이상 출현율을 보이는 종모우(BK 94-13)7]- 복제되었다. 특히, 두 번째 복제 소는 이미 2008년 도축된 씨수소의 냉동보관된 체세포가 핵이식 기술에 이용된 것으로 공시된 체세포와 핵이식 배아의 유전자가 일치하는지를 첫 번째 복제 소에서 사용된 STR(sh~ ort tandem repeat) 분석으로 조사한 결과, 11개의 국제 공으] 마커와 성별까지 모두 일치함으로써 체세포만 확보되면 언제든지 우수종 복원이 가능함을 확인할 수 있* 었다
- 또한, 복제 소의 생산은 체세포 핵이식 배아로부터 대략 7% 미만이 산자로 태어나는 것으로 알려져 있으며 (Heyman 등, 2002), 임신 초기 착상의 실패에 따른 임신율 저하로 인해 이식 후 90일경에 임신으로 진단된 소의 80%이상이 유산되는 것으로 알려져 있다(Wakayama 등, 1999). 본 연구에서 임신율은 대조군과 플라보노이드 처리군에서 각각 5.9 %(2/34)와 10.2%(6/59)로 나타났고, 대조군에서 2두 중 1두가 분만되어 생후 30일 만에 조기 사망한 반면, 플라보노이드 처리 군에서는 임신 소 6두 중 2두의 복제 소(33.3%)는 임신 282 일(7일 배아+이식 후 275일, BK01-10)4 292일(7일 배아+이식 후 285일, BK94-13)에 각각 태어나 건강하게 성장하였다,
- 본 연구는 제주 흑우 처'!세포 핵이식 배아를 체외 배양함에 있어서 배양액 내에 항산화제인 합성 플라보노이드 (3, 4-dwdn)xyflavonee 처리하였을 때, 체외 배발달율의개선과 배반포기배의 총 세포수 및 내부 세포괴수가 증가하였고, 핵이식 배아의 이식 후 임신율 및 산자 생산율도 유의하게 개선되었던 바, 플라보노이드는 체세포 핵이식 배아의 배양첨가제로 유용하게 이용될 수 있음을 나타낸다. 또한, 본 실험에서는 플라보노이드의 적정 농도와 처리 효과를 조사하기 위하여 체세포 핵이식 배아에 적용하기 앞서 단위 발생 배아에 그 사용 여부를 조사하였다.
- 2%)가 임신되었다. 이식 후 10개월째 대조군에서는 2두 중 1두가 분만되었으나, 생후 30일경에 죽어 살아 있는 복제 소를 기대하기 어려웠던 반면, 플라보노이드 처리군의 경우 임신 소 6두 중 4두는 임신 6개월에 유산되고, 나머지 2두에서 2두의 복제 소(/)가 태어나[2009. 3. 11(생시 체중; 28kg, BK01-10, Fig. 4)과 2009. 9. 9(생시 체주 27kg, BK94-13)], 현재까지 건강하게 자라고 있다.
- 그 결과, 본 연구에서 체세포 핵이식으로 발달된 배아의 세포 수를 살펴보면 종 세포수뿐만 아니라 내부 세포괴수에서도 대조군에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다. 이와 더불어 플라보노이드를 처리한 배양환경에서 자란 체세포 복제 배아는 이식 후 10개월 후에 형태 이상이나 신체 기관 이상 없이 정상적으로 태어났으며, 병적 소인 없이 잘 성장하였다.
- 같다. 체외배양액에 플라보노이드를 0, 1, 10과 20 uM 을 첨가하였을 때 배양 8일 째 배반포기 발달율이 각각 49.5%, 54.2%, 57.1% 및 37.5%로 대조군에 비해 10 11M 플라보노이드 처리군의 배반포기배 발달율에서 유의한 차이를 볼 수 없었다. 한편, 10 pM 처리군과 비교하여 1 pM 처리군에서는 유사한 발달율을 나타낸 반면 20 iiM 처리 군은 유의하게 낮은 발달율을 나타내었다.
- 4) 는현존하는 흑우 중 육량 형질이 제일 우수한 종모우(BK 01 ~W)가 복제된 것이며, 2009년 9월 9일에 태어난 두 번째 복제 소(〃흑제돌이〃 명명, 殆)는 육질 형질이 우수하여 근내 지방도가 높고 1등급 이상이 95% 이상 출현율을 보이는 종모우(BK 94-13)7]- 복제되었다. 특히, 두 번째 복제 소는 이미 2008년 도축된 씨수소의 냉동보관된 체세포가 핵이식 기술에 이용된 것으로 공시된 체세포와 핵이식 배아의 유전자가 일치하는지를 첫 번째 복제 소에서 사용된 STR(sh~ ort tandem repeat) 분석으로 조사한 결과, 11개의 국제 공으] 마커와 성별까지 모두 일치함으로써 체세포만 확보되면 언제든지 우수종 복원이 가능함을 확인할 수 있* 었다
- 플라보노이드 처리군에서 태어난 복제 송아지 2두의 귀세포와 복제용 제주흑우 체세포 및 대리모 소의 근육세포를 11개의 STR 마커로 각각 분석한 결과, 대리모와는 달리 복제 송아지와 공여된 제주흑우 체세포 간에 11 개의 microsatellite loci에서 모두 완벽하게 일치하는 유전자형을 보이고, 성별도 동일한 수컷으로 확인된 바 있으며, Fig. 5 에서는 그 중 [2009. 3. 11, BK01-10]의 친자 감별 유전자 분석이 제시되었다.
후속연구
- 원인으로 지적되고 있다. 하지만 체세포 핵이식 배아의 산자 발생율 개선을 위해서는 장시간 동안 다수의 기계적 처리과정과 화학물 노출에 의해 약해져 있으므로핵이식 후 기능을 빠르게 회복할 수 있는 항 산화제인 플라보노이드의 처리 이외에도 좀 더 효율적인 체외 배양 시스템 개발에 따른 배아 발달의 최적화, 대리모 선정 및 이 식후 사양관리 등 다양한 해결책이 더욱 요구된다고 하겠다.
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