본 연구에서는 참죽나무 새순 추출물의 항산화 효능과 tyrosinase 저해 활성을 측정함으로써 기능성 화장품에서의 이용 가능성을 평가하였다. 참죽나무 새순 추출물의 free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 저해활성($FSC_{50}$)은 ethyl acetate 분획($3.54\;{\mu}g/mL$)과 aglycone 분획($2.15\;{\mu}g/mL$) 모두 지용성 항산화제인 (+)-$\alpha$-tocopherol ($8.98\;{\mu}g/mL$)에 비해 우수한 활성을 나타내었다. 또한 luminol 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 참죽나무 추출물의 총항산화능은 추출물의 ethyl acetate 분획($0.15\;{\mu}g/mL$)과 aglycone 분획($0.12\;{\mu}g/mL$)에서 모두 L-ascorbic acid ($1.50\;{\mu}g/mL$) 보다 약 10배 더 큰 것으로 나타내었다. Rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 참죽나무 새순 추출물의 억제 효과를 측정하였을때 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획 모두 농도 의존적($5{\sim}25\;{\mu}g/mL$)으로 세포보호 효과를 나타내었다. Tyrosinase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 참죽나무 새순 추출물의 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획에서 각각 $48.00\;{\mu}g/mL$, $5.88\;{\mu}g/mL$으로 나타났으며 aglycone 분획의 경우 강력한 미백제인 arbutin ($226.88\;{\mu}g/mL$)에 비해 약 40배정도 더 우수한 활성을 갖는다. 이상의 결과들은 참죽나무 새순 추출물이 활성산소종을 소거하고 활성산소종에 대항하여 세포막을 보호함으로써 생체계, 특히 태양 자외선에 의해 손상된 피부에서 항산화제로서 작용할 수 있음을 가리키며, tyrosinase 저해활성으로부터 미백 기능성 화장품원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
본 연구에서는 참죽나무 새순 추출물의 항산화 효능과 tyrosinase 저해 활성을 측정함으로써 기능성 화장품에서의 이용 가능성을 평가하였다. 참죽나무 새순 추출물의 free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 저해활성($FSC_{50}$)은 ethyl acetate 분획($3.54\;{\mu}g/mL$)과 aglycone 분획($2.15\;{\mu}g/mL$) 모두 지용성 항산화제인 (+)-$\alpha$-tocopherol ($8.98\;{\mu}g/mL$)에 비해 우수한 활성을 나타내었다. 또한 luminol 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 참죽나무 추출물의 총항산화능은 추출물의 ethyl acetate 분획($0.15\;{\mu}g/mL$)과 aglycone 분획($0.12\;{\mu}g/mL$)에서 모두 L-ascorbic acid ($1.50\;{\mu}g/mL$) 보다 약 10배 더 큰 것으로 나타내었다. Rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 참죽나무 새순 추출물의 억제 효과를 측정하였을때 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획 모두 농도 의존적($5{\sim}25\;{\mu}g/mL$)으로 세포보호 효과를 나타내었다. Tyrosinase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 참죽나무 새순 추출물의 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획에서 각각 $48.00\;{\mu}g/mL$, $5.88\;{\mu}g/mL$으로 나타났으며 aglycone 분획의 경우 강력한 미백제인 arbutin ($226.88\;{\mu}g/mL$)에 비해 약 40배정도 더 우수한 활성을 갖는다. 이상의 결과들은 참죽나무 새순 추출물이 활성산소종을 소거하고 활성산소종에 대항하여 세포막을 보호함으로써 생체계, 특히 태양 자외선에 의해 손상된 피부에서 항산화제로서 작용할 수 있음을 가리키며, tyrosinase 저해활성으로부터 미백 기능성 화장품원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
In this study, the antioxidative effects, inhibitory effects on tyrosinase of Cedrela sinensis extracts were investigated. The ethyl acetate fraction of extract ($3.54\;{\mu}g/mL$) and aglycone fraction of extract ($2.15\;{\mu}g/mL$) showed more excellent free radical (1,1-diph...
In this study, the antioxidative effects, inhibitory effects on tyrosinase of Cedrela sinensis extracts were investigated. The ethyl acetate fraction of extract ($3.54\;{\mu}g/mL$) and aglycone fraction of extract ($2.15\;{\mu}g/mL$) showed more excellent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity ($FSC_{50}$) than the activity of (+)-$\alpha$-tocopherol ($8.98\;{\mu}g/mL$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of Cedrela sinensis extracts on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were investigated using the luminol-dependent chemiluminescence assay. The ethyl acetate fraction of extract ($0.15\;{\mu}g/mL$) and aglycone fraction of extract ($0.12\;{\mu}g/mL$) showed 10 times more excellent ROS scavenging activity than activity of L-ascorbic acid ($1.50\;{\mu}g/mL$). The protective effects of fractions of Cedrela sinensis on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The ethyl acetate fraction of extract and aglycone fraction of extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner ($5{\sim}25\;{\mu}g/mL$). The inhibitory effect of Cedrela sinensis extracts on tyrosinase was investigated to assess their whitening efficacy. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on tyrosinase were determined with ethyl acetate fraction of Cedrela sinensis extract ($48.00\;{\mu}g/mL$) and aglycone fraction of extract ($5.88\;{\mu}g/mL$). The aglycone fraction showed 40 times more remarkable tyrosinase inhibitory effect than whitening agent, arbutin ($226.88\;{\mu}g/mL$) These results indicate that fractions of Cedrela sinensis can be used as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging $^1O_2$ and other ROS, and protect cellular membranes against ROS. The fractions of Cedrela sinensis can be applicable to new functional cosmetics for antioxidant and whitening.
In this study, the antioxidative effects, inhibitory effects on tyrosinase of Cedrela sinensis extracts were investigated. The ethyl acetate fraction of extract ($3.54\;{\mu}g/mL$) and aglycone fraction of extract ($2.15\;{\mu}g/mL$) showed more excellent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity ($FSC_{50}$) than the activity of (+)-$\alpha$-tocopherol ($8.98\;{\mu}g/mL$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of Cedrela sinensis extracts on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were investigated using the luminol-dependent chemiluminescence assay. The ethyl acetate fraction of extract ($0.15\;{\mu}g/mL$) and aglycone fraction of extract ($0.12\;{\mu}g/mL$) showed 10 times more excellent ROS scavenging activity than activity of L-ascorbic acid ($1.50\;{\mu}g/mL$). The protective effects of fractions of Cedrela sinensis on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The ethyl acetate fraction of extract and aglycone fraction of extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner ($5{\sim}25\;{\mu}g/mL$). The inhibitory effect of Cedrela sinensis extracts on tyrosinase was investigated to assess their whitening efficacy. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on tyrosinase were determined with ethyl acetate fraction of Cedrela sinensis extract ($48.00\;{\mu}g/mL$) and aglycone fraction of extract ($5.88\;{\mu}g/mL$). The aglycone fraction showed 40 times more remarkable tyrosinase inhibitory effect than whitening agent, arbutin ($226.88\;{\mu}g/mL$) These results indicate that fractions of Cedrela sinensis can be used as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging $^1O_2$ and other ROS, and protect cellular membranes against ROS. The fractions of Cedrela sinensis can be applicable to new functional cosmetics for antioxidant and whitening.
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문제 정의
따라서 참죽나무 새순을 구입하여 참죽나무 새순 추출물과 분획을 제조하고 이들 추출물(혹은 분획)의 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 보호활성과 free radical 소거활성, Fe3+-EDTA/H2O2 계에서 생성된 활성산소에 대한 총항산화능, 그리고 tyrosinase 저해 활성을 측정하여 ROS에 의한 피부 노화를 방지하는데 효과가 있는 항산화 화장품, 그리고 미백 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다.
제안 방법
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 소거 활성은 DPPH의 농도가 50 % 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/ mL)로서 표기하였다.
대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3·6H2O를 첨가하지 않은 것으로 하였다.
참죽나무 새순 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
따라서 이 계를 이용하면 ROS에 대한 총항산화능을 측정할 수 있다. 총항산화능은 luminol이 ROS에 의해 산화되어 나타나는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였다.
추출물을 농도별로 각각 50 µL씩 첨가하고 암소에서 30 min 동안 pre-incubation시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사하였다.
사람 적혈구를 대상으로 활성산소에 의한 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한 점이 많다. 활성산소에 의한 지질 과산화반응, 단백질 산화, 그리고 항산화제의 파괴 및 세포의 파괴 등을 이 실험법을 이용하여 조사할 수 있다. 무엇보다 자외선에 의한 피부노화를 방어할 수 있는 피부 보호물질을 검색하는데 있어서 유익할 것으로 생각된다.
대상 데이터
(+)-α-tocopherol, L-ascorbic acid, arbutin, EDTA, luminol, 증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거 활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다.
50 % 에탄올 추출물은 감압·농축한 후 hexane을 이용하여 엽록소 등 비극성 성분을 제거하고 이후 ethyl acetate로 flavonoid를 추출한 분획을 감압․농축하여 파우더를 얻었다. Ethyl acetate 분획에서 얻은 파우더 일부는 가수분해 반응을 이용하여 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 실험에 사용하였다. Aglycone 분획 제조 방법은 ethyl acetate 가용분 일정량에 H2SO4 및 acetone 용액을 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류·냉각시킨다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia) 사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH meter는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, NaCl, 그리고 ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc), hexane 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 L-tyrosine과 효소로 사용된 tyrosinase (9.3 mg solid, 5,370 units/mg solid)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 참죽나무 새순은 2010년 3월 청량리 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
기타 FeCl3·6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
비교물질은 대표적인 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid를 사용하였으며 L-ascorbic acid의 총항산화능은 1.50µg/mL로 나타났다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/mL이었다.
(USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 참죽나무 새순은 2010년 3월 청량리 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, NaCl, 그리고 ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc), hexane 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student’s t-test를 행하였다.
Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120 min까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 4회 반복하여 평균하였다.
이론/모형
Free radical 소거활성을 측정하는 DPPH 실험법은 매우 간편하고 짧은 시간에 결과를 알 수 있기 때문에, 선정한 식물 추출물의 항산화 물질을 검색하는 경우나 항산화 화장품 원료들의 비교 평가 시에 이용하기 적합하다. 참죽나무 새순 추출물 또한 free radical 소거활성을 DPPH법을 통하여 확인하였다. 실험방법은 methanol에 용해시킨 0.
성능/효과
1) 참죽나무 새순 추출물의 free radical 소거 능력(FSC50)은 ethyl acetate 분획의 경우 3.54 µg/mL, ethyl acetate 분획에서 당 제거시킨 aglycon 분획의 경우 2.15µg/mL으로 모두 (+)-α-tocopherol (8.98 µg/mL)에 비하여 우수한 free radical 소거능력을 나타냈다.
2) 참죽나무 새순 추출물의 활성산소 소거활성(OSC50)은 ethyl acetate 분획 0.15 µg/mL, aglycon 분획 0.12 µg/mL로 나타났으며 이는 L-ascorbic acid (1.50 µg/mL)에 비하여 약 10배 더 우수한 활성산소 소거 능력을 나타냈다.
3) 1O2으로 유도된 적혈구의 광용혈 현상에 있어서, 참죽나무 새순 추출물 ethyl acetate 분획와 aglycone 분 획은 농도 범위(5 ~ 25 µg/mL)에서 농도-의존적으로 1O2에 의해 유도된 용혈을 크게 억제하였다.
4) 참죽나무 새순 추출물 중 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획은 tyrosinase 저해활성(IC50)이 각각 48.00µg/mL, 5.88 µg/mL로 나타났고 aglycone 분획의 경우 arbutin (226.88 µg/mL)에 비해 40배 정도 더 우수한 tyrosinase 저해 활성을 나타냈다.
대조군(control)은 τ50이 32 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
참죽나무 새순 추출물들의 세포보호 효과는 10µg/mL에서 ethyl acetate 분획(65.50 min)에 비하여 aglycon 분획(155.30 min)이 우수하게 나타났고, 비교물질로 사용한 지용성 항산화제 (+)-α-tocopherol의 세포 보호효과는 동일농도 10 µg/mL에서 38.00 min으로 나타났다.
참죽나무 새순 추출물의 ethyl acetate 분획은 (+)-α-tocopherol보다 약 2.5배, aglycone 분획은 약 4배 더 우수한 free radical 소거활성을 나타내었다(Figure 2).
참죽나무 새순(C. sinensis) 추출물들의 free radical 소거활성(FSC50) 측정 결과를 측정하였을 때 참죽나무 새순 ethyl acetate 분획인 경우는 3.54 µg/mL, aglycon 분획(Figure 1)은 2.15 µg/mL으로 나타났으며, 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol의 FSC50는 8.98 µg/mL로 나타났다.
참죽나무 새순추출물의 ethyl acetate 분획 경우는 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ50)이 농도 범위 5, 10,25µg/mL에서 각각 44.70, 65.50, 101.80 min으로, aglycone 분획의 경우 같은 농도 범위에서 각각 96.80, 155.30, 358.40 min으로 농도 의존적인 세포 보호 효과를 나타내었다.
후속연구
활성산소에 의한 지질 과산화반응, 단백질 산화, 그리고 항산화제의 파괴 및 세포의 파괴 등을 이 실험법을 이용하여 조사할 수 있다. 무엇보다 자외선에 의한 피부노화를 방어할 수 있는 피부 보호물질을 검색하는데 있어서 유익할 것으로 생각된다. 따라서 이 실험법을 이용하여 활성산소에 대한 천연물 추출물의 세포보호 효과를 측정할 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소종 중 생체 내에서 처리 가능한 것과 그렇지 않은 것들에는 무엇이 있는가?
이들은 정상적 대사과정을 포함하는 다양한 생체반응, 자외선에 의한 광반응으로 생성될 수 있다[5-7]. O2·-와 H2O2는 반응성이 크지 않기 때문에 실질적으로 생체 내에는 이들을 처리할 수 있는 효소(superoxide dismutase, catalase)가 발달되어 있으나 1O2,과 O2·-를 처리할 수 있는 효소는 생체 내에 존재하지 않는다. 특히 1O2은 수명이 짧은 해로운 분자이며, 주로 광증감반응으로 피부에서 생성되고, 광노화에 있어서 핵심적인 역할을 한다[8].
활성산소종은 무엇인가?
자외선을 통해 생성되는 활성산소종(ROS)과 이로 인한 피부의 광산화적 손상과 광노화는 실질적으로 증가하고 있다. 활성산소종이란 단백질, 지질, DNA와 같은 세포 성분을 산화시키고, 산소장해를 일으키며 삼중항 상태의 산소(3O2)보다도 반응성이 훨씬 큰 산소종을 일컫는다[1-4]. 비라디칼종인 1O2, H2O2와 산소중심의 라디칼인 O2·-, ·OH, 그리고 이들 활성산소종과의 생체성분들과의 반응으로 발생된 ROO·, RO·, ROOH 및 HOCl 등이 활성산소종에 포함된다.
참죽나무 잎에는 어떤 화합물들이 함유되어 있는가?
참죽에는 카로틴 및 비타민 B와 비타민 C가 함유되어 있으며 칼슘과 칼륨도 다량 함유되어 있다고 보고되어 있다[14]. 또한 참죽나무 잎에는 (+)-catechin, quercetin, afzelin, quercitrin, isoquercitrin 등의 페놀성 화합물이 포함되어 있다고 보고되어 있다[15-17]. 참죽나무에 관한 또 다른 연구로는 종자성분 연구, 김치로 가공했을 때의 저장중의 화학성분의 변화, 참죽나무잎의 조리시 quercitrin의 함량 변화[18] 등의 연구가 보고 되어있을 뿐, 참죽나무 새순 추출물을 이용하여 피부 노화 과정에 깊이 관여하는 활성산소인 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 항산화적 보호 작용이나 각종 ROS (H2O2, O2·- , ·OH 등)가 생성되는 계에서의 이들 ROS에 대한 총항산화능 및 미백작용에 관한 연구는 아직 되어있지 않다.
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