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문제 정의
- 본 실험에서 ELL의 아로마 오일이 정상세포에 미치는 영향을 SRB법으로 측정하여 안정성 여부를 관찰하였다. mLFCs을 96well plate에 5x104 세포로 분주하여 subculture한 후 Eucalyptus, lemon, lavender와 이것을 혼합한 ELL을 0.
- 본 실험에서 ELL의 아토피 피부염 억제 작용을 조사하기 위하여 Nc/Nga 생쥐를 이용하여 조사하였다. DNCB를 제모한 피부에 도포하여 피부염을 유발하였으며, 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 ELL 0.
- 그러한 방법들 중의 하나로서 아로마테라피는 그 효능성과 접근성 및 편리성에서 가장 대중적인 대체요법으로 자리 잡고 있다. 이러한 관점에서 본 연구에서도 아로마를 이용한 아토피 질환 억제효과를 규명하고자 하였다. 구체적으로 아토피질환환자의 피부발진과 유사하게 항원에 의하여 피부질환을 유도하는 동물실험 모델을 사용하여 ELL을 도포하여 효능을 알아보았다 피부질환환자와 같은 발진유발을 위하여 DNCB를 알러젠으로 반복 도포하여 NC/Nga 생쥐를 아토피피부발진동물모델로 사용하여 ELL의 피부발진억제 효과를 관찰하였다.
- 이러한 기존 지식에 근거하여 본 연구에서는 라벤더, 레몬, 유칼립투스 등 3종류의 에센셜 오일을 혼합하여 아토피 피부염이 유발된 쥐를 대상으로 소양증 등 아토피 치료 가능성을 검중하기위해 이들 세 가지 에센셜 오일들을 캐리어 오일인 조조바 오일(Jojoba Oil)과 섞어 혼합 오일을 만든 다음 12주령의 발진된 NC/Nga 생쥐의 등 부위에 도포하여 임상적 변화, 혈청 중 IgE, clinical score, IgG1, 싸이토카인(IL-4, IL-13 및 IFN-γ) 발현 등을 분석하여 아토피 발진 억제에 미치는 영향을 살펴보았다.
제안 방법
- 11주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후 제모가 끝나면 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 그리고 1% Dinitrochlorobenzene (DNCB) 용액 (아세톤:올리브오일=3:1) 200㎕를 등 부위에 도포하였고, 4일 후, 1주일에 2-3번씩 0.
- DNCB를 도포하여 피부염이 유발된 생쥐를 2개의 그룹으로 나누고, 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 ELL을 (0.025%/100㎕/day)을 8주간 (12주에서 20주까지) 도포하였다. 도포한 후 일반적으로 사용되어지는 임상육안적 방법으로 관능 평가를 4주 간격으로 실시하였다25).
- 본 실험에서 ELL의 아토피 피부염 억제 작용을 조사하기 위하여 Nc/Nga 생쥐를 이용하여 조사하였다. DNCB를 제모한 피부에 도포하여 피부염을 유발하였으며, 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 ELL 0.025%의 농도로 매일 도포하여 피부염 지수를 측정하였다. Fig.
- 15min at 95℃, 1min at 60℃에서 수행하였다. ELL 투여군과 대조군은 internal standard로는 G3PDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR로 계산하여 RQ (relative quantitative)을 측정하였다.
- Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 염증 사이토카인 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard를 G3PDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 200nM이 되게 반응시켰다.
- Spleen cell (2x 106/mL)을 anti-CD28 (1μg/mL)과 anti-CD3 (1μg/mL)으로 24-well Costar 접시 (Corning Inc, Cambridge, Mass)에서 coating하여 48시간 동안 동시 배양 한 후, Interleukin-4(IL-4), Interleukin-13(IL-13), Interferon-γ(IFN-γ) 생성량을 ELISA kit로 측정하였다.
- BALB/c 생쥐의 폐 조직을 cool D-PBS로 3회 세척한 후 작은 조각으로 절단한 다음, conical tube (15㎖)에 넣어 1,400rpm에서 5분간 원심분리하였다. Tube에 다시 DMEM {containing collagenase A (5mg/㎖, BM, indianapoilis, IN, U.S.A.)와 DNase type Ⅰ(0.15 mg/㎖, Sigma), antibiotics(penicillinm 104U/㎖, streptomycin 10mg/㎖, amphotericin B 25㎍/㎖)}를 넣고 37℃ CO2 배양기에서 2시간 동안 배양한 후 0.5% trypsin-0.2% EDTA를 첨가하여 30분간 계속 배양하였다. 배양 후 인산완충생리식염수로 약 2회 1,500rpm에서 원심분리한 후 DMEM-10% FBS에서 1주일 동안 배양하였다.
- 세포 독성 측정 방법은 SRB assay법을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. mLFCs 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 배양한 후 ELL을 D-PBS에 현탁하여 최종 농도 0.025, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10%를 48시간 동안 처리하였다. 배양 종료 후에 배양액을 버리고 D-PBS로 2회 세척하였다.
- 이러한 관점에서 본 연구에서도 아로마를 이용한 아토피 질환 억제효과를 규명하고자 하였다. 구체적으로 아토피질환환자의 피부발진과 유사하게 항원에 의하여 피부질환을 유도하는 동물실험 모델을 사용하여 ELL을 도포하여 효능을 알아보았다 피부질환환자와 같은 발진유발을 위하여 DNCB를 알러젠으로 반복 도포하여 NC/Nga 생쥐를 아토피피부발진동물모델로 사용하여 ELL의 피부발진억제 효과를 관찰하였다. 우선 아로마 오일의 독성검사를 실시하였다.
- 11주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후 제모가 끝나면 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 그리고 1% Dinitrochlorobenzene (DNCB) 용액 (아세톤:올리브오일=3:1) 200㎕를 등 부위에 도포하였고, 4일 후, 1주일에 2-3번씩 0.2% DNCB 용액 150㎕를 등 부위에 도포하였다 (12주부터 20주).
- 025%/100㎕/day)을 8주간 (12주에서 20주까지) 도포하였다. 도포한 후 일반적으로 사용되어지는 임상육안적 방법으로 관능 평가를 4주 간격으로 실시하였다25). 육안 평가 결과는 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타내었다.
- 세포 독성 측정 방법은 SRB assay법을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. mLFCs 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 배양한 후 ELL을 D-PBS에 현탁하여 최종 농도 0.
- 시료 투여 시점인 8주와 12주, 16주, 그리고 20주에 생쥐의 눈에서 capillary tube를 이용하여 약 100㎕의 혈액을 채혈한 후 원심분리기 6,500rpm에서 20분간 원심분리한 후 30㎕의 혈청을 분리하였다(IgG1은 IgE 상승을 확인한 것으로 20주차에 단회만 측정함). 혈청은 취하여 실험에 이용할 때 까지 -70℃에 냉동 보관하였다.
- 아토피질환 환자의 피부발진을 DNCB의 항원을 반복 도포하여 동물실험모델을 만들어 ELL의 효능검사를 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이를 1시간 동안 실온에서 방치한 후 washing 완충 용액으로 2회 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugeted 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 50㎕의 stop 용액을 처리하고 ELISA reader 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 염증 사이토카인 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard를 G3PDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 200nM이 되게 반응시켰다.
- 구체적으로 아토피질환환자의 피부발진과 유사하게 항원에 의하여 피부질환을 유도하는 동물실험 모델을 사용하여 ELL을 도포하여 효능을 알아보았다 피부질환환자와 같은 발진유발을 위하여 DNCB를 알러젠으로 반복 도포하여 NC/Nga 생쥐를 아토피피부발진동물모델로 사용하여 ELL의 피부발진억제 효과를 관찰하였다. 우선 아로마 오일의 독성검사를 실시하였다. 독성이 있는 물질은 세포의 증식 · 분화 · 기능을 저해하고, 세포분열을 할 때 염색체 복제 이전 단계에서 염색체의 활성을 억제한다고 알려져 있다13).
- 이렇게 8주 처리한 다음 피부염이 충분히 유발되어 등 부위의 가피가 모두 벗겨지고, 이 부위에 새로운 피부염이 형성되면서 긁는 행동이 심화되면 DNCB 처리를 중단하고, 관능 평가를 실시하였다.
- 평가 항목은 홍반 (erythema), 가려움과 건조 피부 (Pruritus & Dry Skin), 부종과 혈종 (Edema & escoriation), 짓무름 (Erosion), 그리고 태선화 (Lichenification)로 나누었다.
- 혈청내 IgE, IgG 측정은 Enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA, Endogen, USA)와 ELISA kit (R&D system)를 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 시약 중 dinitrochlorobenzene (DNCB), collagenase, trichloroacetic acid, trypsin-EDTA, SRB, acetic acid, tris-base, aceton, olive oil, ethanol, DNase-1, dNTPs, RNase inhibitor, tris-HCL, RPMI-1640 배양액, 적혈구 용혈액 (RBC lysis solution), ethidium bromide (EtBr), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), formaldehyde는 Sigma사 (U.S.A.) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone사 (U.S.A.) 제품을, Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-13 (IL-13), Interferon-γ(IFN-γ)는 R & D system사 (U.S.A.) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 실험동물로써 6주령의 수컷 NC/Nga mice는 Japan SLC사에서 공급 받아 실험당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 22±2℃, 55±15%, 12시간-12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 에센셜 오일들은 Eucalyptus (Eucalyptus globulus), Lemon (citrus limon), Lavender (lavandula angustifolia)이며 캐리어 오일(Carrier Oil)로 조조바 (Jojoba Oil)를 사용하였다. 오일 배합 비율은 통상 사람의 경우 (60kg 기준으로 사용시) 1.
- 025%) 배합한 후 실험에 사용하였다. 실험에 쓰인 오일은 Essenjoy(네이쳐- 프러스, 한국)가 생산한 것들이다.
- 에센셜 오일은 Eucalyptus (Eucalyptus globulus), lemon (Citrus limon), lavender (Lavandula angustifolia) 오일을 1:2:2 방울로 배합하여 캐리어 오일인 조조바 오일 50ml에 희석하여 100㎕ (0.025%)를 사용하였다. 오일은 차광병에 넣어 상온에서 빛이 통하지 않게 보관하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 에센셜 오일들은 Eucalyptus (Eucalyptus globulus), Lemon (citrus limon), Lavender (lavandula angustifolia)이며 캐리어 오일(Carrier Oil)로 조조바 (Jojoba Oil)를 사용하였다. 오일 배합 비율은 통상 사람의 경우 (60kg 기준으로 사용시) 1.5%인 것을 감안하여 쥐의 무게를 환산하여(20g 기준으로, 0.025%) 배합한 후 실험에 사용하였다. 실험에 쓰인 오일은 Essenjoy(네이쳐- 프러스, 한국)가 생산한 것들이다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- Mouse lung fibroblast cells (mLFCs) were cultured with various concentration of eucalyptus, lemon and lavender, ELL for 48 hr and the cell viability was measured by SRB method. The results were presented by the mean ± S.
성능/효과
- 1. ELL의 아로마 오일은 0.5%이하의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
- 2. ELL이 아토피 피부염 억제 작용에서 임상스코어상 피부염을 대조군에 비하여 유의성 있게 감소시켰다.
- 3. ELL이 혈청 면역글로불린 IgE와 IgG1 생성량을 대조군에 비하여 유의성 있게 감소시켰다.
- 4. ELL이 Th2 사이토카인인 IL-4와 IL-13 생성량을 유의성 있게 억제시켰고 Th1 사이토카인인 IFN-γ생성량을 유의성 있게 증가시켰다.
- Fig.2에서 보는 바와 같이 DNCB를 NC/Nga mouse에 8주간 도포하고 최종 등피부에 나타난 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 단계를 0(none), 1(mild), 2(moderate), 3(severe)로 개체마다 평가 기록하여 피부발진 점수로 평가한 결과 대조군의 skin clinical score는 DNCB를 도포하지 않은 정상군 (NC/Nga-Nr)에 비하여 10배 이상 skin clinical score 값이 증가하였고 ELL 도포군은 대조군에 비해 3배 이상 유의성 있게(p<0.001) 감소하였다(Fig. 2).
- mLFCs을 96well plate에 5x104 세포로 분주하여 subculture한 후 Eucalyptus, lemon, lavender와 이것을 혼합한 ELL을 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10%의 농도로 48시간 동시 배양한 후 SRB법으로 세포독성을 분석한 결과, 시료를 처리하지 않은 상태인 대조군의 세포생존율은 100.0±5.2(%)로 나타났다.
- 본 실험에서 ELL의 사이토카인 생성 조절 작용을 보면, Th2 사이토카인에 대하여는 비장 세포 배양액 중의 IL-4와 IL-13 생성이 억제 된 것을 확인할 수 있었다. Th1 사이토카인에 대하여는 비장 세포 배양액 중의 IFN-γ생성이 유의성 있는 증가를 확인할 수 있었다
- 본 실험에서 ELL이 Th2 cell에 관여하는 IgE와 IgG1의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 NC/Nga 생쥐의 눈에서 혈액을 채혈한 후 혈청을 분리하여 생성량을 측정한 결과, IgE와 IgG1 생성량은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소를 나타내었다(Fig . 3).
- 이상의 결과에서 라벤더, 레몬, 유칼립투스 혼합 에센셜오일은 Th2 관련인자의 조절을 통해 아토피 피부염 유발 동물모형에 대해 효과가 있을 것으로 추정된다.
후속연구
- 이상의 결과로 미루어 ELL은 인체에서도 Th1세포와 Th2 세포의 조절 및 IgE 생성량 억제를 통하여 항아토피 효능을 발휘할 수 있을 것으로 추측되며 이를 위한 임상연구가 활발히 이루어져야 할 것으로 생각된다. 또 이를 위하여 에센셜 오일들 간의 최적 배합에 대한 보다 심도 있는 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 또한 B 세포를 자극하여 IgM, IgG2a, IgfG2b와 같은 항체를 특이적으로 생산하도록 유도한다고 알려져 있고21), ELL의 Th1세포와 Th2 세포는 각기 특징적인 싸이토카인의 발현을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 ELL은 인체에서도 Th1세포와 Th2 세포의 조절 및 IgE 생성량 억제를 통하여 항아토피 효능을 발휘할 수 있을 것으로 추측되며 이를 위한 임상연구가 활발히 이루어져야 할 것으로 생각된다. 또 이를 위하여 에센셜 오일들 간의 최적 배합에 대한 보다 심도 있는 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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