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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 산초 열매(종자와 종피) 추출물을 이용하여 항산화 및 항염증 효능을 확인하여 산초 열매에 대한 생리활성 효과를 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- 배양 후, 20 µL의 MTT solution을 첨가한 후 CO2 배양기(37℃ 5% CO2)에서 4시간 반응시킨 후, 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- 각 추출물을 일정한 농도로 희석하고 1 mL을 취한 뒤 2 mM ferrous chloride(FeCl2·4H2O)와 5 mM ferrozine(3-(2-pyridyl)-5,6- bis-(4-phenyl sulfonic acid)-1,2,4-triazian)을 각각 100 µL씩 첨가한 후 10분간 상온에서 반응 시킨 후 UV/VIS 분광광도계 (Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 562 nm 에서 반응액의 흡광도를 측정하여 시료첨가구와 비첨가구의 흡광도 차를 백분율로 표시하였다.
- 7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였으며, 세포는 CO2 배양기(37℃, 5% CO2, MCO-15AC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다. NO의 생성을 위해서 RAW264.7 세포주에 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 자극하였다. 즉, 96-well plate에 RAW264.
- 1A). 금속이온 제거능에서 높은 효과를 보인 70% 에탄올과 70% 메탄올 추출물을 대상으로 농도별로 금속이온 제거능에 대한 효과를 측정하였다. 각각의 추출물을 125, 250, 500, 1000 µg/mL의 농도로 수행한 결과 Fig.
- 28) NO의 생체 내 합성과정을 살펴보면 NO 합성 효소인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)에 의해서 L-arginine이 L-citrulline으로 전환될 때 생성된다고 알려져 있으며, 이 중 대식세포에 의한 iNOS의 활성은 외부 감염이나 다양한 염증 상태일 때 높아져 대량의 NO를 생성하게 되고 이러한 대식세포에서 대량 생성된 NO 는 염증성 질환이나 자가 면역질환을 발생 할 수 있어 NO 의 생성 억제는 중요하다.29) RAW264.7 세포주를 이용하여 NO 생성을 유도하기 위하여 LPS를 처리하였다. LPS만 처리한 군에서는 대조군과 비교하여 높은 NO 생성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig.
- Cytotoxicity 평가 − MTT assay를 이용하여 산초열매 추출물에 대한 Raw 264.7 세포에 대한 세포독성을 확인하였다 (Fig. 4).
- 산초나무 열매(종자와 종피) 추출물을 이용하여 생리활성을 검정하였다. 산초나무 열매 추출물을 1 mg/mL의 농도로 금속이온 제거능을 측정한 결과 70% 에탄올과 70% 메탄올 추출물에서 각각 68%, 67%로 나타났으며, 두 개군 모두 농도의존적인 활성을 보였다.
대상 데이터
- 실험재료 −본 실험에 사용된 산초(Zanthoxylum schnifolium) 열매(종자와 종피)는 충북 단양군에서 2009년 가을에 채취하여 10시간동안 열풍건조 한 뒤 분쇄하여 시료 중량 대비 20배의 물(water), 100% 에탄올(EtOH), 100% 메탄올(MeOH), 70% EtOH, 70% MeOH의 추출용매를 이용하여 24시간 2회 추출 후 여과 한 뒤 감압 농축하여 시료로 사용하였다.
- RAW 264.7 cell을 이용한 NO 생성 저해 능력 측정 − 실험에 사용한 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였으며, 세포는 CO2 배양기(37℃, 5% CO2, MCO-15AC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
데이터처리
- 통계분석 − 실험결과는 3차 반복 실험을 수행하였으며, 그 값을 SPSS Ver. 10.0 package program (SPSS, Chicago, USA)을 이용하여 각 시험군의 평균과 표준편차를 산출하고 Tukey 법을 이용하여 각 시험구간의 유의차를 5% (p<0.05) 유의 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- Cytotoxicity 측정 − 각각 추출물의 세포에 대한 독성은 Desai 등25)의 방법에 준하여 측정하였다.
- Superoxide dismutase (SOD) 유사활성 측정 − SOD 유사활성은 Marklund의 방법을 변형한 Kim 등24)의 방법을 이용하여 실험하였다.
- Metal chelating capacity 측정 − 금속이온 제거능은 Yena 등23)의 방법을 이용하여 측정 하였다.
성능/효과
- 각각의 추출물을 125, 250, 500, 1000 µg/mL의 농도로 수행한 결과 Fig. 1B처럼 농도 의존적으로 금속이온 제거능에 대한 효과가 증가하는 것을 확인 하였다.
- Metal chelating capacity − 산초 열매(종자와 종피) 추출물에 대한 금속이온 제거 효과를 측정한 결과 70% 에탄올 추출물과 70% 메탄올 추출물을 1 mg/mL의 농도로 첨가하였을 때 각각 68%와 67%로 비교적 높게 나왔으며, 100% 에탄올, 100% 메탄올 물 추출물 순으로 금속이온 제거능 효과가 있는 것으로 나타났다 (Fig. 1A).
- 항산화물질의 중요한 특징 중 하나는 바로 금속이온 제거능을 가지고 있다는 것이며, 이는 항산화 물질을 함유하고 있는 추출물이 금속이온의 산화를 억제하여 항산화 효과를 나타내기 때문이다.26) 산초열매에 대한 금속이온 제거능은 대조군으로 사용한 EDTA와 비교 하여볼 때 비록 농도는 높지만 금속이온 제거효과는 있는 것으로 확인 되었다.
- 2는 산초열매 추출물의 SOD유사 활성을 측정한 결과이다. 각각의 추출물은 농도가 증가함에 따라 SOD유사 활성도 증가 하는 농도의존적인 관계를 보였으며, 100% 에탄올, 100%메탄올이 가장 높은 활성을 보였으며, 대조군으로 사용된 gallic acid와 대조하여 볼 때 SOD 유사활성이 높은 것으로 나타났다. 추출물의 농도가 4 mg/mL일 때 SOD 유사활성은 100% 에탄올, 100 메탄올, gallic acid, 70% 에탄올, 70% 메탄올, 물 추출물이 각각 약 51%, 48%, 46%, 31%, 29%, 20%의 SOD 활성을 보이는 것으로 나타났다.
- 각각의 추출물은 농도가 증가함에 따라 SOD유사 활성도 증가 하는 농도의존적인 관계를 보였으며, 100% 에탄올, 100%메탄올이 가장 높은 활성을 보였으며, 대조군으로 사용된 gallic acid와 대조하여 볼 때 SOD 유사활성이 높은 것으로 나타났다. 추출물의 농도가 4 mg/mL일 때 SOD 유사활성은 100% 에탄올, 100 메탄올, gallic acid, 70% 에탄올, 70% 메탄올, 물 추출물이 각각 약 51%, 48%, 46%, 31%, 29%, 20%의 SOD 활성을 보이는 것으로 나타났다. 생체 내에 superoxide를 정상상태의 산소로 환원시켜 주는 역할을 하는 SOD는 superoxide가 일으키는 여러 질병이나 노화를 억제 할 수 있는 효소로 알려져 있으며, SOD유사 활성물질은 생체 내에 존재하는 SOD와 유사한 역할을 하는 저분자 물질이며, superoxide의 반응을 억제하여 superoxide의 발생을 줄임으로써27) 산화적 장애를 방어하고 노화 억제의 효과를 기대 할 수 있을 것으로 보고 있다.
- 그러나 대량 생성된 NO는 염증, 퇴행성 신경질환, 당뇨병 및 패혈성 쇼크를 발생시킨다고 알려져 있다.28) NO의 생체 내 합성과정을 살펴보면 NO 합성 효소인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)에 의해서 L-arginine이 L-citrulline으로 전환될 때 생성된다고 알려져 있으며, 이 중 대식세포에 의한 iNOS의 활성은 외부 감염이나 다양한 염증 상태일 때 높아져 대량의 NO를 생성하게 되고 이러한 대식세포에서 대량 생성된 NO 는 염증성 질환이나 자가 면역질환을 발생 할 수 있어 NO 의 생성 억제는 중요하다.29) RAW264.
- 7 세포주를 이용하여 NO 생성을 유도하기 위하여 LPS를 처리하였다. LPS만 처리한 군에서는 대조군과 비교하여 높은 NO 생성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 3). 그러나 산초열매 추출물을 처리한 군에서는 물 추출물을 제외한 다머지 추출물에서 LPS로 유도된 NO의 생성이 감소함을 알 수 있었다.
- 4). 흥미롭게도 각각의 추출물의 농도가 증가 할수록 물 추출물, 100% 에탄올, 100% 메탄올 추출줄을 첨가한 군에서 세포의 생존율이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 이와는 대조적으로 70% 에탄올과 70% 메탄올 추출물을 첨가한 군에서는 세포 생존율의 감소는 거의 없는 것으로 나타났다.
- 이와는 대조적으로 70% 에탄올과 70% 메탄올 추출물을 첨가한 군에서는 세포 생존율의 감소는 거의 없는 것으로 나타났다. 즉 앞선 NO생성량을 측정하였을 때에 100%에탄올과 100% 메탄올에 높은 효과를 보였지만 이는 NO의 생성량의 감소가 추출물에 대한 NO의 감소 효과도 있지만 세포 생존율이 떨어져 결과적으로 NO의 생성량이 감소하였다고 볼 수 있으며, 두개의 결과를 토대로 NO의 생성량을 가장 효과적으로 감소하는 것은 70% 에탄올 추출물로 나타났다.
- 산초나무 열매(종자와 종피) 추출물을 이용하여 생리활성을 검정하였다. 산초나무 열매 추출물을 1 mg/mL의 농도로 금속이온 제거능을 측정한 결과 70% 에탄올과 70% 메탄올 추출물에서 각각 68%, 67%로 나타났으며, 두 개군 모두 농도의존적인 활성을 보였다. SOD유사 활성을 측정한 결과 추출물을 4 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 대조군으로 사용된 gallic acid보다 100% 에탄올과 100% 메탄올 추출물에서 가장 높은 SOD유사 활성을 보였다.
- 산초나무 열매 추출물을 1 mg/mL의 농도로 금속이온 제거능을 측정한 결과 70% 에탄올과 70% 메탄올 추출물에서 각각 68%, 67%로 나타났으며, 두 개군 모두 농도의존적인 활성을 보였다. SOD유사 활성을 측정한 결과 추출물을 4 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 대조군으로 사용된 gallic acid보다 100% 에탄올과 100% 메탄올 추출물에서 가장 높은 SOD유사 활성을 보였다. 항염증 효능을 평가하기 위하여 Raw 264.
- SOD유사 활성을 측정한 결과 추출물을 4 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 대조군으로 사용된 gallic acid보다 100% 에탄올과 100% 메탄올 추출물에서 가장 높은 SOD유사 활성을 보였다. 항염증 효능을 평가하기 위하여 Raw 264.7세포를 이용하여 NO생성량을 측정한 결과 100% 에탄올, 100% 메탄올, 70% 에탄올 추출물이 가장 높은 효과를 보였으나 세포독성 실험 결과 100% 에탄올과 100% 메탄올 추출물에서 세포 생존율이 감소한 것으로 보아 70% 에탄올 추출물이 NO생성 억제에 효과적인 것으로 나타났다. 본 연구 결과를 바탕으로 볼 때 산초열매 추출물은 생리활성에 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 7세포를 이용하여 NO생성량을 측정한 결과 100% 에탄올, 100% 메탄올, 70% 에탄올 추출물이 가장 높은 효과를 보였으나 세포독성 실험 결과 100% 에탄올과 100% 메탄올 추출물에서 세포 생존율이 감소한 것으로 보아 70% 에탄올 추출물이 NO생성 억제에 효과적인 것으로 나타났다. 본 연구 결과를 바탕으로 볼 때 산초열매 추출물은 생리활성에 효과가 있는 것으로 나타났다.
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