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문제 정의
- 본 연구에서는 산초 열매(종자와 과피) 추출물을 이용하여 항산화 및 항당뇨의 효능탐색을 체계적으로 수행하여 활성산소에 의한 질병 치료와 항당뇨 치료제로서의 개발을 타진하기 위하여 수행하였다.
제안 방법
- 1 ml을 가하고 Vortexing 후 30℃의 Dark chamber에 30분간 반응하여 515 nm에서 흡광도(Multiplater spectrophotometer ELx800TM, BioTek, USA)를 측정하여 농도에 따른 DPPH radical 소거능을 확인하였다.21) 시료를 첨가하지 않은 Negative control과 비교하여 자유라디칼 소거활성은 백분율로 나타내고, Positive control로는 Vitamin C의 한 종류인 ascobic acid와 BHT를 사용하였다.
- 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)소거능 − DPPH는 안정한 free-radical 분자를 구성하는 어두운 색의 염료이며, 520 nm에서 가장 큰 파장을 흡수하는데 이는 solution상태에서 진한 보라빛을 나타내고 중성화 되었을 때 색을 잃거나 옅은 노란빛을 나타내는 특성을 이용하여 최초 radical의 수를 측정할 수 있게 한다.21) 이를 이용하여 산초 열매 추출물에 대한 radical 소거 능력을 측정하였다. 그 결과 water추출물에서 농도 의존적으로 가장 높은 수치를 나타내었고 70% MeOH, 70% EtOH, 100% EtOH, 100% MeOH추출물의 순서대로 높은 활성을 보였다.
- 26) Hydroxyl radical 소거활성은 Fenton reaction에 의해 생성된 Hydroxyl radical이 deoxyribose를 분해하고 이 때 생성된 MDA(malondialdehyde)양을 확인함으로써 측정하였다. 그 결과, 70% MeOH추출물에서 가장 높은 활성을 보였으나 오차범위 내에서 water추출물에서 가장 높은 활성을 보였으며, 그 다음으로 70% EtOH, 100% EtOH, 100% MeOH추출물의 순으로 높은 수치를 나타냈다 (Fig.
- DPPH 라디칼(1.1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)소거능 측정 − 산초 열매 추출물을 각 농도별 (10, 50, 100, 500 µg/ml)로 물(water)추출물만을 물에 녹이고 나머지 70% EtOH, 70% MeOH, 100% EtOH, 100% MeOH추출물은 모두 MeOH에 녹여 제조한 시료 0.1 ml에 0.2 mM의 MeOH에 녹인 DPPH 0.1 ml을 가하고 Vortexing 후 30℃의 Dark chamber에 30분간 반응하여 515 nm에서 흡광도(Multiplater spectrophotometer ELx800TM, BioTek, USA)를 측정하여 농도에 따른 DPPH radical 소거능을 확인하였다.
- 2 ml을 가한다. 그리고 37℃ incubator에서 4시간 반응시킨 뒤 2.8 % TCA (Trichloroacetic acid)용액과 1 % TBA (Thiobarbituric acid)용액을 순서대로 1 ml씩 첨가하여 100℃ 탕욕상에 10분간 놓아둔 뒤 Cooling하여 UV/VIS 분광광도계 (Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로써 gallic acid를 같은 농도로 사용하였다.
- 산초나무 열매 추출물을 이용하여 항산화 활성 및 항당뇨 활성을 확인하기 위해 5가지의 각각 다른 용매에 녹인 시료를 사용하여 분석하였다. 산초나무 열매 추출물에 대한 총 페놀성 화합물의 함량은 92.
- 산초나무 열매 추출물의 수율 − 산초 열매(종자와 과피) 추출물은 열풍건조 후 분쇄한 뒤 시료 중량 대비 20배의 추출용매로 침지한 뒤 감압 농축하여 추출 수율을 구하였다.
- 총 플라보노이드 화합물 함량 측정 − 1 mg/ml의 농도로 추출물을 제조하여, 10% Aluminum chloride (AlCl3)을 녹인 MeOH 용액과 Potassium acetate (CH3COOH)를 1 M의 농도가 되도록 혼합하여 40분 간 실온에서 보관한 뒤 UV/VIS 분광광도계 (Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 5 ml 넣어준 다음 실온에서 30분 간 보관한 뒤 UV/VIS 분광광도계 (Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 Vitamin A의 한 종류인 탄닌산 (Tannic acid)를 이용하여 작성된 표준곡선을 이용하여 검량선을 작성한 뒤 각 용매에 녹인 산초 열매 추출물의 총 페놀성 화합물의 함량을 계산하였다.
대상 데이터
- 실험재료 − 본 실험에 쓰인 산초(Zanthoxylum schnifolium) 열매(종자와 과피)는 충북 단양군에서 2009년 10월에 채취하여 10시간 열풍건조 시킨 후 분쇄하여 시료 중량 대비 20배의 물(water), 100% 에탄올(EtOH), 100% 메탄올(MeOH), 70% EtOH, 70% MeOH의 추출용매를 이용하여 24시간 동안 실온에서 1차 침지 한 뒤 상층액을 회수 후 동량의 추출 용매로 다시 24시간 추출 후 여과한 뒤 감압 농축하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- a-bvalues in the same row not sharing the same superscript are significantly different by Tukey’s multiple range test (p<0.05).
- a-dvalues in the same row not sharing the same superscript are significantly different by Tukey’s multiple range test (p<0.05).
- 통계분석 − 실험결과는 3차 반복 실험을 수행하였으며, 그 값을 SPSS Ver. 10.0 package program (SPSS, Chicago, USA)을 이용하여 각 시험구의 평균과 표준편차를 산출하고 Tukey 법을 이용하여 각 시험구간의 유의차를 5% (p<0.05) 유의 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 총 페놀성 화합물 함량 측정 − 총 페놀성 화합물 함량은 페놀성 물질이 phosphomolbdic acid와 반응하여 청색으로 발색되는 것을 이용한 Folin-Denis 방법에 따라 분석하였다.
- 하이드록시 라디칼(Hydroxyl radical, ·OH)소거능 측정 − Hydroxyl radical 소거능 측정은 Fenton 반응으로 생성된 ·OH에 의해 핵산의 구성당인 deoxyribose가 분해되는 정도를 TBA 발색법을 이용하여 측정하였다.
- 환원력(Reducing power)의 측정 − Moreni 등 방법에 의거하여 시료의 reducing power를 측정하였다.
성능/효과
- 17) 본 실험의 대조구로 사용된 acarbose는 당뇨병 치료약으로 시판되고 있는 약물로서 식후 혈당을 효과적으로 낮추기 때문에 전반적인 혈당 조절 상태를 향상시키는 작용이 있고, β-세포의 기능 저하를 억제하며 고 인슐린 혈증 및 인슐린 저항성을 개선시키는 효과를 지니고 있다.
- Hydroxyl radical 소거능 역시 water추출물에서 가장 높은 수치를 보였다. DPPH radical 소거능 측정 결과에서도 water추출물이 가장 높은 수치를 나타내었고 환원력 측정에서도 다른 실험 결과와 동일하게 water추출물에서 가장 높은 수치를 나타내었다. 항당뇨 활성 측정을 위한 α-Glucosidase 저해 활성 실험에서는 100% EtOH, 100% MeOH추출물이 활성을 보이기는 했으나 대조구로 사용된 acarbose의 값과 비교해보았을 때 큰 효능을 가지지는 않는 것으로 판단되었다.
- 21) 이를 이용하여 산초 열매 추출물에 대한 radical 소거 능력을 측정하였다. 그 결과 water추출물에서 농도 의존적으로 가장 높은 수치를 나타내었고 70% MeOH, 70% EtOH, 100% EtOH, 100% MeOH추출물의 순서대로 높은 활성을 보였다. water 추출물은 500 µg/ml 농도에서 약 90%의 수치를 나타내며 높은 활성을 보였다(Fig.
- 26) Hydroxyl radical 소거활성은 Fenton reaction에 의해 생성된 Hydroxyl radical이 deoxyribose를 분해하고 이 때 생성된 MDA(malondialdehyde)양을 확인함으로써 측정하였다. 그 결과, 70% MeOH추출물에서 가장 높은 활성을 보였으나 오차범위 내에서 water추출물에서 가장 높은 활성을 보였으며, 그 다음으로 70% EtOH, 100% EtOH, 100% MeOH추출물의 순으로 높은 수치를 나타냈다 (Fig. 1). Positive control로는 같은 농도의 gallic acid를 사용하였는데 산초열매 추출물이 대체적으로 낮은 수치를 보이기는 했으나 가장 높은 활성을 보인 warer추출물이 26.
- 산초 열매추출물의 환원력을 측정한 결과 Positive control로 사용한 αtocopherol은 0.14를 나타내었고 가장 높은 활성을 보였던 water추출물은 0.05를 나타내어 α-tocopherol에 비해 약 35%의 활성을 나타냈다.
- 산초나무 열매 추출물에 대한 총 페놀성 화합물의 함량은 92.16 µg/mg으로 water추출물에서 가장 높은 수치를 나타내었고, 총 플라보노이드 화합물의 함량은 196.48 µg/mg으로 100% MeOH추출물에서 가장 높은 수치를 나타내었다.
- 산초나무 열매 추출물의 수율 − 산초 열매(종자와 과피) 추출물은 열풍건조 후 분쇄한 뒤 시료 중량 대비 20배의 추출용매로 침지한 뒤 감압 농축하여 추출 수율을 구하였다. 실험결과 water를 용매로 한 추출물이 가장 적은 수율을 보였고 100% MeOH, 70% EtOH, 70% MeOH, 100% EtOH의 순서로 높은 추출수율을 보였다 (Table I). Water, 70% EtOH, 70% MeOH를 용매로 하였을 때는 진한 갈색의 고체상태 추출물이 얻어졌으며 100% MeOH, 100% EtOH를 용매로 하였을 때는 진한 초록빛의 액체상태 추출물을 얻을 수 있었다.
- 항당뇨 활성 측정을 위한 α-Glucosidase 저해 활성 실험에서는 100% EtOH, 100% MeOH추출물이 활성을 보이기는 했으나 대조구로 사용된 acarbose의 값과 비교해보았을 때 큰 효능을 가지지는 않는 것으로 판단되었다.
후속연구
- 항당뇨 활성 측정을 위한 α-Glucosidase 저해 활성 실험에서는 100% EtOH, 100% MeOH추출물이 활성을 보이기는 했으나 대조구로 사용된 acarbose의 값과 비교해보았을 때 큰 효능을 가지지는 않는 것으로 판단되었다. 본 연구 결과를 바탕으로 산초열매 water추출물은 항산화제로의 개발에 효과적일 것으로 판단된다.
- 환원력(Reducing power)측정 − 환원력이 강한 물질은 생성된 활성산소를 다시 환원시켜 항산화제로서의 역할을 할 수 있으며, 이는 활성산소에 의해 발생되는 많은 질병의 치료에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
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