청국장 메탄올 추출물의 $H_2O_2$로 유도된 신경세포 독성에 대한 보호 효과를 조사하였다. 청국장 분말의 일반성분을 분석한 결과 조단백질 40.95%, 조지방 22.49%, 가용성 무질소물 15.99%, 수분 7.91%, 조회분 6.74% 및 조섬유 5.92% 순으로 나타났으며, 총 페놀성 화합물 함량은 28.43 mg/g이었다. $H_2O_2$로 유발된 산화적 손상에 의한 ROS 축적량을 조사한 결과 $H_2O_2$ 단독 처리구보다 청국장 메탄올 추출물 처리구에서 낮은 ROS 축적량을 보였다. $H_2O_2$로 유도된 PC12 신경세포에 대한 보호효과를 MTT 방법을 이용하여 측정한 결과 모든 시료에서 40%정도의 신경세포 보호효과를 보였고, LDHrelease 실험 결과 5 mg/mL 농도에서 15%정도의 LDH 방출량 저해 효과를 나타내었다. 청국장 메탄올추출물의 아세틸콜린에스터레이스 저해활성은 농도 의존적인 경향이었다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, 청국장 메탄올 추출물은 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과 및 아세틸콜린에 스터레이스 저해활성을 나타내어 알츠하이머성 신경질환의 예방을 위한 식품으로서의 활용 가능성이 높다고 판단된다.
청국장 메탄올 추출물의 $H_2O_2$로 유도된 신경세포 독성에 대한 보호 효과를 조사하였다. 청국장 분말의 일반성분을 분석한 결과 조단백질 40.95%, 조지방 22.49%, 가용성 무질소물 15.99%, 수분 7.91%, 조회분 6.74% 및 조섬유 5.92% 순으로 나타났으며, 총 페놀성 화합물 함량은 28.43 mg/g이었다. $H_2O_2$로 유발된 산화적 손상에 의한 ROS 축적량을 조사한 결과 $H_2O_2$ 단독 처리구보다 청국장 메탄올 추출물 처리구에서 낮은 ROS 축적량을 보였다. $H_2O_2$로 유도된 PC12 신경세포에 대한 보호효과를 MTT 방법을 이용하여 측정한 결과 모든 시료에서 40%정도의 신경세포 보호효과를 보였고, LDH release 실험 결과 5 mg/mL 농도에서 15%정도의 LDH 방출량 저해 효과를 나타내었다. 청국장 메탄올추출물의 아세틸콜린에스터레이스 저해활성은 농도 의존적인 경향이었다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, 청국장 메탄올 추출물은 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과 및 아세틸콜린에 스터레이스 저해활성을 나타내어 알츠하이머성 신경질환의 예방을 위한 식품으로서의 활용 가능성이 높다고 판단된다.
In this study, the neuronal cell protective effects of methanol extract from cheonggukjang were evaluated. The proximate composition and total phenolics of the methanol extract were 40.95% crude protein, 22.49% crude fat, 15.99% nitrogen free extract, 7.91% moisture, 6.74% crude ash, 5.92% crude fib...
In this study, the neuronal cell protective effects of methanol extract from cheonggukjang were evaluated. The proximate composition and total phenolics of the methanol extract were 40.95% crude protein, 22.49% crude fat, 15.99% nitrogen free extract, 7.91% moisture, 6.74% crude ash, 5.92% crude fiber, and 28.43 mg/g of total phenolics. Intracellular ROS accumulation resulting from $H_2O_2$ treatment of PC12 cells was significantly reduced when methanol extract was present in the media compared to PC12 cells treated with $H_2O_2$ only. In a cell viability assay using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromide (MTT), the methanol extract showed protective effects against $H_2O_2$-induced neurotoxicity, and lactate dehydrogenase (LDH) release into the medium was also inhibited. Furthermore, the inhibitory effect of the methanol extract against acetylcholinesterase was dose-dependent.
In this study, the neuronal cell protective effects of methanol extract from cheonggukjang were evaluated. The proximate composition and total phenolics of the methanol extract were 40.95% crude protein, 22.49% crude fat, 15.99% nitrogen free extract, 7.91% moisture, 6.74% crude ash, 5.92% crude fiber, and 28.43 mg/g of total phenolics. Intracellular ROS accumulation resulting from $H_2O_2$ treatment of PC12 cells was significantly reduced when methanol extract was present in the media compared to PC12 cells treated with $H_2O_2$ only. In a cell viability assay using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromide (MTT), the methanol extract showed protective effects against $H_2O_2$-induced neurotoxicity, and lactate dehydrogenase (LDH) release into the medium was also inhibited. Furthermore, the inhibitory effect of the methanol extract against acetylcholinesterase was dose-dependent.
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문제 정의
지금까지 청국장의 생리활성에 대한 연구로는 항암성 및 면역기능개선(15,16), 지질대사 개선(17), 고혈압 예방(18), 심장병 및 콜레스테롤 저감 효과(19,20), 골다공증 예방 또는 치료(21,22), 항산화 및 tyrosinase 저해(23) 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 청국장 추출물의 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보효효과와 같은 퇴행성 뇌신경질환에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 산화적 스트레스로부터 유도되는 신경세포의 사멸을 보호할 수 있는 생리활성물질을 탐색하기 위한 목적으로, 청국장 메탄올 추출물을 이용하여 H2O2와 같은 산화적 스트레스에 의해 손상된 PC12 신경세포에 대한 보호효과를 조사하고자 하였다.
신경세포의 경우 상대적으로 많은 지방성분을 함유하고 있고 이는 산화적인 스트레스에 매우 취약하기 때문에 이러한 구조적 특성을 이용하여 상기의 신경세포 보호효과와 신경세포막 손상과의 관계를 알아보고자 다음의 연구를 진행하였다. H2O2로 유도된 신경세포막 손상에 대한 청국장 메탄올 추출물의 보호효과를 확인하기 위하여 신경세포 중에 함유되어 있는 세포질 성분의 LDH 방출량을 측정한 결과는 Fig.
제안 방법
H2O2에 의한 PC12 세포의 산화적 손상을 보호하는 효과를 DCF-DA assay를 통하여 검토하였다. 먼저 PC12 세포에 농도별 청국장 메탄올 추출물을 전처리한 다음, H2O2로 세포의 산화적 손상을 유도하여 DCF 형광강도를 관찰한 결과는 Fig.
에 의한 PC12 세포의 산화적 손상을 보호하는 효과를 DCF-DA assay를 통하여 검토하였다. 먼저 PC12 세포에 농도별 청국장 메탄올 추출물을 전처리한 다음, H2O2로 세포의 산화적 손상을 유도하여 DCF 형광강도를 관찰한 결과는 Fig. 1과 같다. 그 결과 H2O2를 단독 처리한 군에서는 148.
2로 조정) 5 mL를 첨가하여 Glass-Col homogenizer로 균질화한 후 균질화 된 세포배양액을 15,000 g에서 30분 동안 원심 분리하였으며, 그 상징액을 효소실험을 위하여 사용하였다. 모든 추출공정은 4℃에서 수행하였으며, 추출한 효소액의 단백질함량을 측정하기 위하여 Quant-iTTM protein assay kit(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하였고, bovine serum albumin으로 작성한 검량곡선에 준하여 함량을 환산하였다. 정제효소(단백질 함량: 2.
배양 후 배지를 제거한 다음, phosphate buffered saline(PBS) buffer로 세척한 다음 200 µM H2O2를 가하고, 3시간 배양한 후 50 µM DCFH-DA를 가하고, fluorescence microplate reader(Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)를 사용하여 excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다(26).
청국장 메탄올 추출물을 48시간동안 전 배양시킨 후, 200 µM H2O2를 처리하여 3시간 배양한 후, 5분간 원심분리(250×g)하여 100 µL의 상등액을 새로운 well로 옮긴 후 LDH assay kit(Sigma Chemical Co.)를 사용하여 측정하였다.
청국장 메탄올 추출물의 H2O2로 유도된 신경세포 독성에 대한 보호 효과를 조사하였다. 청국장 분말의 일반성분을 분석한 결과 조단백질 40.
대상 데이터
본 실험에 사용된 청국장 분말은 진주시에 위치한 대형마트에서 구입하여 냉장보관(4)하면서 실험에 사용하였다. 신경세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 hydrogen peroxide(H2O2) solution, 3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay kit, lactate dehydrogenase(LDH) assay kit, penicillin, streptomycin, sodium bicarbonate, HEPES, 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA) 및 나머지 시약은 Sigma사(St.
본 실험에서 사용한 PC12 세포는 흰쥐 부신의 갈색세포종 (pheochromocytoma)에서 분리하여 신경세포주로 확립된 것으로 Korean cell line bank(KCLB 21721, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. PC12 세포를 25 mM HEPES, 25 mM sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum, 50 units/mL penicillin 및 100µg/mL steptomycin이 포함된 RPMI 1640배지에 접종하여 37℃,5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
신경세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 hydrogen peroxide(H2O2) solution, 3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay kit, lactate dehydrogenase(LDH) assay kit, penicillin, streptomycin, sodium bicarbonate, HEPES, 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA) 및 나머지 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였다.
양성대조군은 vitamin C(200 µM)를 사용하였고, 세포생존율은 대조군에 대한 %concentration으로 나타냈다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복 실시하여 mean±SD로 나타내었으며, 각 평균값에 대한 검증은 SAS(Statistical Analysis System, ver. 6.12)를 이용하여 평균과 표준오차, Newman-Keul’s multiple range tests로 평균값들에 대해 유의성을 검정하였다.
이론/모형
Acetylcholinesterase저해 활성 측정은 acetylcholine iodide를 기질로 사용하는 Ellman법으로 측정하였다(28). 효소는 PC12 세포배양액 1 mL에 균질화를 위한 buffer(1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1% Triton X-100 혼합액에 10 mM Tris-HCl로 pH 7.
H2O2에 의해 유도된 PC12 세포에 대한 보호효과는 MTT 방법으로 측정하였다(27). 청국장 메탄올 추출물을 PC12 세포에 처리 하여 48시간동안 전 배양시킨 후, 200 µM H2O2를 각각 3시간 동안 처리하였다.
The cells were then treated with 200 µM H2O2 for 3 h. Levels of cell viability were measured using the MTT assay as described under materials and methods. Vitamin C (200 µM) was applied as positive control.
청국장 메탄올 추출물이 H2O2에 의한 PC12 세포의 산화적 스트레스 손상을 보호하는 효과를 측정하기 위하여 DCF-DA 방법으로 실시하였다. 먼저 세포를 96 well plate에 2×106 cells/well로 분주하고, 청국장 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
청국장의 일반성분은 AOAC 방법으로 측정하였고(24), 메탄올 추출물에 함유되어 있는 총 페놀화합물 함량을 측정하기 위하여 Folin-Ciocalteu’s 방법을 이용하였다(25).
성능/효과
H2O2로 유발된 산화적 손상에 의한 ROS 축적량을 조사한 결과 H2O2 단독 처리구보다 청국장 메탄올 추출물 처리구에서 낮은 ROS 축적량을 보였다. H2O2로 유도된 PC12 신경세포에 대한 보호효과를 MTT 방법을 이용하여 측정한 결과 모든 시료에서 40%정도의 신경세포보호효과를 보였고, LDH release 실험 결과 5 mg/mL 농도에서 15%정도의 LDH 방출량 저해 효과를 나타내었다. 청국장 메탄올 추출물의 아세틸콜린에스터레이스 저해활성은 농도 의존적인 경향이었다.
43 mg/g이었다. H2O2로 유발된 산화적 손상에 의한 ROS 축적량을 조사한 결과 H2O2 단독 처리구보다 청국장 메탄올 추출물 처리구에서 낮은 ROS 축적량을 보였다. H2O2로 유도된 PC12 신경세포에 대한 보호효과를 MTT 방법을 이용하여 측정한 결과 모든 시료에서 40%정도의 신경세포보호효과를 보였고, LDH release 실험 결과 5 mg/mL 농도에서 15%정도의 LDH 방출량 저해 효과를 나타내었다.
Vitamin C 200 µM 처리군은 37%의 LDH 방출량을 보였고, 청국장 메탄올 추출물 1 mg/mL의 농도로 처리했을 때는 72%의 LDH 방출량을 나타내어 H2O2 단독 처리구와 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않았으나 2.5, 5 및 10 mg/mL의 농도로 처리하였을 때는 56, 55 및 54%의 LDH 방출량을 나타내어 농도 의존적으로 신경세포막의 손상 정도가 점차적으로 감소하는 경향을 볼 수 있었다.
1과 같다. 그 결과 H2O2를 단독 처리한 군에서는 148.65%로 대조구 100%대비 약 50%의 형광강도 증가를 보인 반면, 청국장 메탄올 추출물 1 mg/mL를 처리한 시료에서는 125.53%, 10 mg/mL를 처리한 시료에서는 120.59%로 농도 의존적인 산화적 손상 보호 효과를 보였다. Choi 등(28)은 가시오가피 80% 메탄올 추출물을 이용하여 PC12 세포에 H2O2로 산화적 스트레스를 유발한 후 DCF-DA 방법으로 산화적 손상 보호효과를 측정한 결과 H2O2 단독 처리구에서는 407.
3과 같다. 대조군의 방출량은 52% 정도인데 반해 H2O2 처리한 구에서는 70%의 방출량을 보여 H2O2로 인해 LDH 방출량이 18%정도 증가하였다. Vitamin C 200 µM 처리군은 37%의 LDH 방출량을 보였고, 청국장 메탄올 추출물 1 mg/mL의 농도로 처리했을 때는 72%의 LDH 방출량을 나타내어 H2O2 단독 처리구와 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않았으나 2.
3%의 활성을 보여 scopolamine에 의해 유도한 기억력 감퇴 모델을 이용한 실험에서 기억력 개선 및 인지능력 향상 효과가 있다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 보여주는 AChE의 저해활성도 역시 청국장 추출물에 함유되어 있는 폴리페놀성 화합물과 그 연계성이 높을 것으로 판단된다. 다만 상대적으로 높은 농도에서 in vitro AChE 저해활성을 나타내고 있으므로, 향후 청국장 내에 함유되어 있는 개별 폴리페놀성 화합물에 의한 실험과 함께 Y-maze task 및 수동회피 실험과 같은 in vivo 실험의 병행으로 생리적인 효과의 직접적인 상관관계 정립이 필요할 것으로 판단된다.
2와 같다. 세포 생존율은 H2O2를 처리한 처리구에서는 대조군 100% 대비 67%의 생존율을 나타냈고 H2O2와 vitamin C를 동시에 처리한 처리구에서는 92%의 생존율로 약 25%정도의 신경세포 보호효과를 보였다. 청국장 메탄올 추출물 1 mg/mL를 처리한 시료에서는 107%의 생존율을 보였으며, 2.
세포 생존율은 H2O2를 처리한 처리구에서는 대조군 100% 대비 67%의 생존율을 나타냈고 H2O2와 vitamin C를 동시에 처리한 처리구에서는 92%의 생존율로 약 25%정도의 신경세포 보호효과를 보였다. 청국장 메탄올 추출물 1 mg/mL를 처리한 시료에서는 107%의 생존율을 보였으며, 2.5와 5 mg/mL 처리구에서는 각각 106%와 107%로 청국장 메탄올 추출물의 농도에 따른 신경세포 보호효과의 유의적인 차이는 보이지 않았고, 오히려 10 mg/mL를 처리한 시료에서는 신경세포 보호효과가 상대적으로 감소하는 경향을 보였다. 위와 같은 청국장 메탄올 추출물의 신경세포 보호효과는 Table 1에서 나타낸 청국장 메탄올 추출물에 함유되어 있는 폴리페놀성 화합물 등으로부터 기인한 것으로 생각된다.
5, 5 및 10 mg/mL의 농도로 처리하였을 때는 56, 55 및 54%의 LDH 방출량을 나타내어 농도 의존적으로 신경세포막의 손상 정도가 점차적으로 감소하는 경향을 볼 수 있었다. 청국장 메탄올 추출물 1 mg/mL의 농도 처리구에서는 H2O2단독 처리구와 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않았으나 2.5 mg/mL 이상의 농도에서는 LDH 방출량이 감소하는 경향을 보였는데, 이는 청국장 메탄올 추출물에는 H2O2에 의해 유발된 신경세포손상 보호효과를 보이는 활성물질이 다량 함유되어 있을 것으로 생각된다. 따라서 청국장 메탄올 추출물에 함유되어 있는 특정 페놀성 화합물들의 분리, 동정에 대한 연구가 뒤따라야 할 것이며, 또한 분리된 페놀성 화합물들을 이용한 in vivo 실험을 비롯한 분자생물학적 등의 구체적인 연구도 병행되어야 할 것으로 판단된다.
4와 같다. 청국장 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 AChE에 대한 저해활성도 비례적으로 증가하는 경향을 보였으며, 특히 20 mg/mL의 농도에서 55.07%의 높은 저해활성을 보였으나 양성대조군으로 사용된 BW284c51의 82.22%보다는 낮은 효과를 보였다. Heo 등(34)은 칡꽃에서 분리한 daidzein을 이용하여 in vivo 상에서의 choline acetyltransferase(ChAT) 활성을 측정한 결과 scopolamine을 처리한 시료에서는 7.
따라서 콩 발효식품의 청국장은 우수한 식물성 단백질 공급원과 양질의 불포화지방산을 공급하는 대표적인 식품이라 하겠다. 청국장 메탄올 추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 측정한 결과 28.43 mg/g의 함량을 나타냈다. 페놀성 화합물은 천연물에 많이 함유되어 있는 성분으로 이들의 주요 생리적 역할은 자유 라디칼을 소거하는 것이라는 연구가 많이 보고되고 있으며, 또한 이러한 페놀성 화합물인 플라보노이드나 페놀산 및 안토시아닌 등의 총량인 총 페놀화합물은 DPPH 라디칼 소거활성과 같은 항산화 활성에 매우 중요한 인자로 작용을 한다(30).
로 유도된 신경세포 독성에 대한 보호 효과를 조사하였다. 청국장 분말의 일반성분을 분석한 결과 조단백질 40.95%, 조지방 22.49%, 가용성 무질소물 15.99%, 수분 7.91%, 조회분 6.74% 및 조섬유 5.92% 순으로 나타났으며, 총 페놀성 화합물 함량은 28.43 mg/g이었다. H2O2로 유발된 산화적 손상에 의한 ROS 축적량을 조사한 결과 H2O2 단독 처리구보다 청국장 메탄올 추출물 처리구에서 낮은 ROS 축적량을 보였다.
청국장 분말의 일반성분을 분석한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같이 조단백질 40.95%, 조지방 22.49%, 가용성 무질소물 15.99%, 수분 7.91%, 조회분 6.74% 및 조섬유 5.92% 순으로 나타났다. Song과 Jung은(29) 분말청국장의 일반성분을 분석한 결과 단백질이 43.
후속연구
따라서 본 연구에서 보여주는 AChE의 저해활성도 역시 청국장 추출물에 함유되어 있는 폴리페놀성 화합물과 그 연계성이 높을 것으로 판단된다. 다만 상대적으로 높은 농도에서 in vitro AChE 저해활성을 나타내고 있으므로, 향후 청국장 내에 함유되어 있는 개별 폴리페놀성 화합물에 의한 실험과 함께 Y-maze task 및 수동회피 실험과 같은 in vivo 실험의 병행으로 생리적인 효과의 직접적인 상관관계 정립이 필요할 것으로 판단된다. 위의 실험 결과를 종합하여 볼 때 청국장에서는 in vitro 실험을 통하여 나타난 신경 세포 보호효과를 토대로 알츠하이머성 신경질환과 같은 퇴행성 뇌신경질환의 예방을 위한 식품으로서의 활용 가능성을 제시할 수 있을 것으로 판단된다.
5 mg/mL 이상의 농도에서는 LDH 방출량이 감소하는 경향을 보였는데, 이는 청국장 메탄올 추출물에는 H2O2에 의해 유발된 신경세포손상 보호효과를 보이는 활성물질이 다량 함유되어 있을 것으로 생각된다. 따라서 청국장 메탄올 추출물에 함유되어 있는 특정 페놀성 화합물들의 분리, 동정에 대한 연구가 뒤따라야 할 것이며, 또한 분리된 페놀성 화합물들을 이용한 in vivo 실험을 비롯한 분자생물학적 등의 구체적인 연구도 병행되어야 할 것으로 판단된다.
청국장 메탄올 추출물의 아세틸콜린에스터레이스 저해활성은 농도 의존적인 경향이었다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, 청국장 메탄올 추출물은 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과 및 아세틸콜린에스터레이스 저해활성을 나타내어 알츠하이머성 신경질환의 예방을 위한 식품으로서의 활용 가능성이 높다고 판단된다.
다만 상대적으로 높은 농도에서 in vitro AChE 저해활성을 나타내고 있으므로, 향후 청국장 내에 함유되어 있는 개별 폴리페놀성 화합물에 의한 실험과 함께 Y-maze task 및 수동회피 실험과 같은 in vivo 실험의 병행으로 생리적인 효과의 직접적인 상관관계 정립이 필요할 것으로 판단된다. 위의 실험 결과를 종합하여 볼 때 청국장에서는 in vitro 실험을 통하여 나타난 신경 세포 보호효과를 토대로 알츠하이머성 신경질환과 같은 퇴행성 뇌신경질환의 예방을 위한 식품으로서의 활용 가능성을 제시할 수 있을 것으로 판단된다.
위와 같은 청국장 메탄올 추출물의 신경세포 보호효과는 Table 1에서 나타낸 청국장 메탄올 추출물에 함유되어 있는 폴리페놀성 화합물 등으로부터 기인한 것으로 생각된다. 청국장에 함유되어 있는 대표적인 폴리페놀성 성분들은 항산화 및 tyrosinase 저해활성 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고하여(20-23), 본 실험의 결과로 미루어 보아 청국장 메탄올 추출물에 함유되어 있는 신경세포 보호효과를 나타내는 특정 화합물을 찾기 위한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
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