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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 kohlrabi 새싹의 기능성 건강 식품이나 의약품의 소재로서의 활용성을 알아보기 위해 kohlrabi 새싹에서 유舍한 활성을 가지는 이차대사산물을 분리하고자 실험을 진행하였고, 그 결과 3종의 sterol을 분리하였기에 보고하고자 한다.
- 가 입증 된 경우는 극히 일부분이며, 대부분은 성체의 효능을 그대로 적어 놓았거나 아니면 민간에서 전해지고 있는 이야기를 적어 놓은 것이 대부분이다. 이에 아직 까지 연구가 이루어져 있지 않은 kohlrabi의 새싹을 선정하여 kohlrabi 새싹에서 이차대사 산물을 분리 후, 분리 된 성분들의 효능을 통해 kohlrabi 새싹의 기능성 식품으로써의 활용성을 알아보고자 실험을 진행하였다.
제안 방법
- 45] 에 대하여 flash column chromatography(KP-Sil 100 g, »-hexane-EtOAc=20:1 T1O:1T5:1->1:1) 를 실시하여 15개의 분획 (BOGE-2-1 ~ BOGE-2-15)을 얻었다. 이 중에서 BOGE-2-7 분획 (4 g, Ve/Vt 0.44-0.65)에 대하여 다시 flash column chromatography(KP-Sil 100g, "-hexane-EtOAc=10:lT5:lT2:lTl:l)를 실시하여 13개의 분획 (BOGE-2-7-l~BOGE-2-7-13)으로 나누었다. 이 중에서 BOGE-2-7-7 분획(1.
- 콜라비 새싹을 100% MeOH로 추출하였고, 추출물을 극성에 따라 EtOAc, n- BuOH, RO로 분배하였다. 3개의 분획 중 EtOAc 분획에 대하여 SiQ와 ODS를 고정상으로 한 open column chromatography 와 flash column chromatography를 반복 수행하여 화합물 1~3 을 분리하였다.
- 2, MeOH-H2O= 100:1]를 분리하였다. BOGE-2-10 분획 [1.3 g, Ve/Vt 0.78-0.86] 에 대하여 flash column chromatography(KP-Sil 100 g, «-hexane- EtOAc=3:lr2:l )를 실시하여 8개의 분획(BOGE-2-10-1~ BOGE-2-10-8)을 얻었다. 이 중에서 BOGE-2-10-4 분획(230 mg, Ve/Vt 0.
- 5, -hexane-EtOAc=3:l]을 분리하였다. BOGE-2-7-7-11 분획 [80 mg, WVt 0.78-0.85]을 상온의 MeOH 에 녹였을 때 결정이 생기는 것을 확인 하여, 결정을 syringe filter(DISMIC-25HP 0.20 를 이용하여 여과시킨 후 결정을 다시 CHCL에 녹여 3개의 분획(BOGE-2-7-7-11-1 ~BOGE-2-7- 7-11-3)을 얻었다. 그 결과, 화합물 2[BOGE-2-7-7-H-2, 29 mg, Ve/Vt 0.
- "C-NMR spectrum(100 MHz, CDC1* 6c)에서 모두 29개의 signal이 관측되어, stigmastase골격의 sterol임이 확인되었다. DEPT(Distortionless Enhanced by Polarization Transfer) 실험을 통하여 각 탄소의 다중도를 확인하였다. 1개의 olefine quaternary carbon signal[6c 140.
- 얻어진 농축물을 EtOAc (3Lx3)와 HQ(3L)로 분배 추출하였으며, EtOAc층을 제하고 남은 HQ층을 BuOH(3 Lx3)로 추출 하였다. EtOAc 층을 감압 농축하여 EtOAc 분획물(70 g, BOGE)을 얻었다.
- 26]이 관측되었다. HMBC 실험을 통해 이중결합의 위치를 확인 하였다(Fig. 3). 8번 methine proton sigiial[5|| 2.
- NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400(Varian, Palo Alto, CA, USA)으로 측정하였다. IR 스펙트럼은 Pakin model 599B(Perkin-Elmer, Buckinghamshire, England)로 측정하였고, EI/MS는 JMSAX 505-WA(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 녹는점은 Stanrd Research System 융점측정기(SRS, Sunnyvale.
- 49] 1 개가 발견되었다’ 고자장 영역에서 다수의 methyl, methylene, 및 methine signal 이 관측되어 triterpenoid 혹은 steroid로 추정 하였다. Methyl기의 개수는 총 6개로 singlet methyl proton signal[5H 0.98, 0, 65] 2개와, doublet methyl proton signal[6H 0.89, 0.83, 0.79] 3개, triplet methyl proton signal[8H 0.82] 1 개가 관측되었고 이를 통해 sterol화합물 중에서 stigmastane골격의 sterol로 추정하였다. "C-NMR spectrum(100 MHz, CDC1* 6c)에서 모두 29개의 signal이 관측되어, stigmastase골격의 sterol임이 확인되었다.
- Thin layer chromatogmphy(TLC) 는 Kieselgel 60 FeMerck) 와 RP-18 Fs(Merck)를 사용하였고, TLC 상의 물질 검출에는 UV lamp (Spectroline, Model ENF-240 C/F, Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA)로 확인 후, 10% H2SO> 분무한 후 가열하여 발색양상을 조사하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400(Varian, Palo Alto, CA, USA)으로 측정하였다. IR 스펙트럼은 Pakin model 599B(Perkin-Elmer, Buckinghamshire, England)로 측정하였고, EI/MS는 JMSAX 505-WA(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.
- Open column chromatography용 silica gete Kiesel gel 60(Merck, Darmstadt, Germany)을, octadecylsilica gel(ODS)은 LiChroprep RP-18(Merck)의 제품을 사용하였다. Thin layer chromatogmphy(TLC) 는 Kieselgel 60 FeMerck) 와 RP-18 Fs(Merck)를 사용하였고, TLC 상의 물질 검출에는 UV lamp (Spectroline, Model ENF-240 C/F, Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA)로 확인 후, 10% H2SO> 분무한 후 가열하여 발색양상을 조사하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400(Varian, Palo Alto, CA, USA)으로 측정하였다.
- IR 스펙트럼은 Pakin model 599B(Perkin-Elmer, Buckinghamshire, England)로 측정하였고, EI/MS는 JMSAX 505-WA(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 녹는점은 Stanrd Research System 융점측정기(SRS, Sunnyvale. CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 비선광도는 Polarimeter P-1020(JASCO, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다.
- 79] 4개가 관측되었다. 따라서 sterol화합물 중에서 ergostane 골격의 sterol로 주정하였다. l3C- NMR spectrum(100 MHz, CDC13, 8C) 및 DEPT 실험에서 모두 28개의 signal이 존재하는 것을 통해 ergostane골격의 sterol 임을 확인하였다.
- 확인하여 유사한 부분들을 함께 모으고 농축하여 19개의 분획물(BOGE- 1~BOGE-19)을 얻었다. 얻어진 BOGE-2 분획[25g, Ve/Vt (elution volume/total volume) 0.10-0.45] 에 대하여 flash column chromatography(KP-Sil 100 g, »-hexane-EtOAc=20:1 T1O:1T5:1->1:1) 를 실시하여 15개의 분획 (BOGE-2-1 ~ BOGE-2-15)을 얻었다. 이 중에서 BOGE-2-7 분획 (4 g, Ve/Vt 0.
- 얻어진 여액을 모두 합치고 45에서 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 EtOAc (3Lx3)와 HQ(3L)로 분배 추출하였으며, EtOAc층을 제하고 남은 HQ층을 BuOH(3 Lx3)로 추출 하였다. EtOAc 층을 감압 농축하여 EtOAc 분획물(70 g, BOGE)을 얻었다.
- 86] 에 대하여 flash column chromatography(KP-Sil 100 g, «-hexane- EtOAc=3:lr2:l )를 실시하여 8개의 분획(BOGE-2-10-1~ BOGE-2-10-8)을 얻었다. 이 중에서 BOGE-2-10-4 분획(230 mg, Ve/Vt 0.55-0.66)에 대하여 다시 ODS c.c.((p 3.5x7.5 cm, MeOH-H2O=10:l)를 실시하여 10개의 분획(BOGE-2-1041~ BOGE-2-10-4-10)으로 나누었다. 그 결과, 화합물 3[BOGE-2- 10-4-5, 44 mg, VeM 0.
- 이 중에서 BOGE-2-7-7 분획(1.44 g, VeM 0.44-0.60)에 대하여 ODS c.c. (100:l)f- 실시하여 16 개의 분획(BOGE.2-7.7-l~BOGE-2-7-716)으로 나누었다.
- Kohlrabi 새싹으로부터 sterol 화합물의 분리. 콜라비 새싹을 100% MeOH로 추출하였고, 추출물을 극성에 따라 EtOAc, n- BuOH, RO로 분배하였다. 3개의 분획 중 EtOAc 분획에 대하여 SiQ와 ODS를 고정상으로 한 open column chromatography 와 flash column chromatography를 반복 수행하여 화합물 1~3 을 분리하였다.
대상 데이터
- 및 시약. 시료의 추출과 분획에 사용한 유기 용매는 대정화학주식회사(Siheung, Korea)에서 생산한 1급 시약을 사용하" 였다. Open column chromatography용 silica gete Kiesel gel 60(Merck, Darmstadt, Germany)을, octadecylsilica gel(ODS)은 LiChroprep RP-18(Merck)의 제품을 사용하였다.
- Kohlrabi 새싹의 용매 추출 및 분획. Kohlrabi 새싹(생체중 10 kg)을 100% MeOH 용액(40 L)으로 24시간 실온에서 추출하였다. 얻어진 추출물을 여과지로 여과하고, 남은 잔사를 100% MeOH 용액(40 L)으로 2회 더 추출하였다.
- 시료의 추출과 분획에 사용한 유기 용매는 대정화학주식회사(Siheung, Korea)에서 생산한 1급 시약을 사용하" 였다. Open column chromatography용 silica gete Kiesel gel 60(Merck, Darmstadt, Germany)을, octadecylsilica gel(ODS)은 LiChroprep RP-18(Merck)의 제품을 사용하였다. Thin layer chromatogmphy(TLC) 는 Kieselgel 60 FeMerck) 와 RP-18 Fs(Merck)를 사용하였고, TLC 상의 물질 검출에는 UV lamp (Spectroline, Model ENF-240 C/F, Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA)로 확인 후, 10% H2SO> 분무한 후 가열하여 발색양상을 조사하였다.
- 공시재료. 본 실험에 사용한 kohlrabi 새싹은 최아 후 7일 차 새싹으로, 서울 강북구 수유동에 소재한 새싹채소 판매 회사인 새싹 동산에서 구입하였다. 구입한 새싹은 4 아이스박스에 넣어 가급적 빠른 시간 내에 실험실로 운반한 후 실험에 사용하였다.
- 각 분취액을 TLC (CHCl3-MeOH=10:l, CHCl3-MeOH-H2O=6:3:1)5. 확인하여 유사한 부분들을 함께 모으고 농축하여 19개의 분획물(BOGE- 1~BOGE-19)을 얻었다. 얻어진 BOGE-2 분획[25g, Ve/Vt (elution volume/total volume) 0.
성능/효과
- 82] 1 개가 관측되었고 이를 통해 sterol화합물 중에서 stigmastane골격의 sterol로 추정하였다. "C-NMR spectrum(100 MHz, CDC1* 6c)에서 모두 29개의 signal이 관측되어, stigmastase골격의 sterol임이 확인되었다. DEPT(Distortionless Enhanced by Polarization Transfer) 실험을 통하여 각 탄소의 다중도를 확인하였다.
- l3C- NMR spectrum(100 MHz, CDC13, 8C) 및 DEPT 실험에서 모두 28개의 signal이 존재하는 것을 통해 ergostane골격의 sterol 임을 확인하였다. 1개의 olefine quaternary cai'bon signal[ac 140.88]과 3개의 olefine methine carbon signal[3c 121.87(C-6), 131.86 (C-23), 135.97 (C22)]이 관측되어 이중결합이 2개 존재함이 확인되었다. 또한 1개의 oxygenated-methine carbon signal[5c 72.
- DEPT(Distortionless Enhanced by Polarization Transfer) 실험을 통하여 각 탄소의 다중도를 확인하였다. 1개의 olefine quaternary carbon signal[6c 140.63]과 1 개의 olefine methine carbon signal[ac 121.61]°] 관측되어 이중결합이 존재함이 확인되었다. 또한 1개의 oxygenated-methine carbon signal[8c 71.
- 3). 8번 methine proton sigiial[5|| 2.15]이 carbonyl carbon signal[5c 202.12]과 correlation 을 보이는 것을 통해 7번 carbon에 ketone기가 있음을 확인하였다. H-19 singlet methyl proton signal[5 1.
- 12]과 correlation 을 보이는 것을 통해 7번 carbon에 ketone기가 있음을 확인하였다. H-19 singlet methyl proton signal[5 1.18] 과 olefine quaternary carbon signal[8c 165.09 (C-5)] 1개가 correlation을 보이는 것을 통해 5번과 6번에 이중결합이 있음을 확인하였다, 또한 H-21과 H-28 doublet methyl proton signal 2개1.00, 0.9이 와 oleline methine carbon signal 2 개가[6c 131.82 (C- 23), 135.52 (C-22)] 각각 correlation을 보이는 것을 통해 22번과 23번에 이중결합이 있음을 확인하였다. 따라서 화합물 3은 (245)-Methylcholest-5, 22-dien-3|3-ol-7-one(7-ketobrassicasterol) £.
- EI/MS에서의 분자이온 피크( 412 [M]*)로부터 분자량이 412로 결정되었다. IR 스펙트럼에서 3349(O-H stretching), 1712(C=O stret산g), 1677(C=C stretching), 그리고 1045(C-O stretching)의 작용기를 갖는 것으로 확인하였다. !H-NMR spectrum(400 MHz, CDC13, S)을 살펴보면 화합물 2와 유사한 양상을 보였다.
- E1/MS에서의 분자 이온 피크(14 [M]*)로부터 분자량이 414로 결정되었다. IR 스펙트럼에서 3400(0-H stretching), 1640(C=C stretching), 그리고 1050(C-0 stretching)의 작용기를 갖는 것으로 확인하였다. 1H-NMR spectrum(400MHz, CDC13,)을 살펴보면 저 자장 영역에서 olefine methine proton signal[8H 5.
- 65] 1 개가 발견되었고, 고자장 영역에서 다수의 methyl, methylene, 및 mettiine signal이 관측되어 ttiterpenoid 혹은 steroid로 추정할 수 있었다. Methyl 기의 개수는 총 6개로 sinf methyl proton signal[8 1.18, 0.68] 2개와, doublet methyl proton signal[8 1.00, 0.90, 0.82, 0.80] 4 개가 관측되었고, nC-NMR spectrum(l(X) MHz, CDC13, 5C) 및 DEPT 실험에서 모두 28개의 signal이 존재하는 것을 통해 ergostane 골격임을 확인하였다. 저자장 영역에서 1개의 carbonyl carbon signal[ac 202J2]이 관측되어 1개의 ketone group이 존재함을 확인하였다* 1개의 olefine quaternary carbon signal[6c 165.
- 따라서 sterol화합물 중에서 ergostane 골격의 sterol로 주정하였다. l3C- NMR spectrum(100 MHz, CDC13, 8C) 및 DEPT 실험에서 모두 28개의 signal이 존재하는 것을 통해 ergostane골격의 sterol 임을 확인하였다. 1개의 olefine quaternary cai'bon signal[ac 140.
- 20 를 이용하여 여과시킨 후 결정을 다시 CHCL에 녹여 3개의 분획(BOGE-2-7-7-11-1 ~BOGE-2-7- 7-11-3)을 얻었다. 그 결과, 화합물 2[BOGE-2-7-7-H-2, 29 mg, Ve/Vt 0.50-0.70, TLC(ODS F254s) Rf 0.2, MeOH-H2O= 100:1]를 분리하였다. BOGE-2-10 분획 [1.
- 5 cm, MeOH-H2O=10:l)를 실시하여 10개의 분획(BOGE-2-1041~ BOGE-2-10-4-10)으로 나누었다. 그 결과, 화합물 3[BOGE-2- 10-4-5, 44 mg, VeM 0.44-0.63, TLQODS F254s) Rf 0.25, MeOH-H20=30:l]을 분리하였다.
- 7-l~BOGE-2-7-716)으로 나누었다. 그 결과, 화합물 l[BOGE-2-7-7-13, 500 mg, WVt 0.93-0.99, TLC (SiO2 F254) Rf 0.5, -hexane-EtOAc=3:l]을 분리하였다. BOGE-2-7-7-11 분획 [80 mg, WVt 0.
- 97 (C22)]이 관측되어 이중결합이 2개 존재함이 확인되었다. 또한 1개의 oxygenated-methine carbon signal[5c 72.04]이 관측되어 hydroxyl기가 하나 존재하는 것을 확인하였다. 고자장 영역에서는 6개의 methyl carbon signal[ 12.
- 82, 13552]이 관측되어 이중결합이 2개 존재함을 확인하였다. 또한 1개의 oxygenated-methine carbon signal[8c 72.04] 이관측되어 hydroxyl기가 하나 존재하는 것을 확인하였다. 고자장 영역에서는 6개의 methyl carbon signal[8c 12.
후속연구
- 7-Ketobsicasterole 해면류인 Clzona copzosa 에서 처음 분리된 물질로[Notaro 등, 1992], brassicasterol과 구조가 유사하고 공역 ketone기가 존재하는 것으로 보아 좋은 활성이 기대되는 물질이다. 따라서 well-being 식품으로 주목 받고 있는 새싹 채소 중 하나인 kohlrabi 새싹을 이용하여 건강 기능성 식품 및 의약품의 개발이 이루어질 수 있을 것으로 기대한다.
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