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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 황벽나무 부위별 추출물을 포함한 열매 추출물 및 분획물을 이용하여 문화재 열 화원 중의 하나인 곰팡이에 대한 항진균 활성 조사 및 항산화 효과를 보존 과학적으로 증명하고, 나아가 황벽나무 부위별 추출물 및 분획물에 대한 생물방제 보존 처리제로서의 가능성 여부를 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- 대조군으로는 에탄올을 동일한 방식으로 흡수시켜 사용하였다. 4~5일 후 disc 주위에 생성되는 투명환의 유무와 크기를 측정하였다.
- ABTS (2,2-azinobis-3-ethylbenzthiazoline 6-sulfonic acid)를 7 M 농도로 용해시킨 후 ABTS 양이온 radical을 만들기 위해 2.45 M의 potassium persulfate를 첨가하여 12시간 동안 실온의 암실에서 보관하여 녹청색의 발색단을 생성시켰다. ABTS 양이온 radical은 증류수에 희석하여 734 nm에서 흡광도가 약 0.
- 5%)를 사용하였다. CMC와 xylan 배지는 congo red test를 실시하였으며 lignin 배지에는 균주의 생육여부와 균주 주위의 배지의 투명도를 관찰하여 알아보았다13).
- 사부 (Phloem; Ph) 및 목부 (Xylem; Xy), 잎 (Leaf; Le), 열매 (Fruit; Fr)로 분리하여 -20℃ 냉동고에 보관하여 실험에 사용하였다. 각 부위별로 3일 동안 음건하였고, 99.95%의 메탄올로 실온에서 1주일 동안 추출한 후 filter paper (Whatman No. 2)로 여과하였다. 여액은 회전식 진공 농축기 (EYELA, Japan)로 감압농축한 후 본 실험의 시료로 사용하였다.
- 을 사용하였다. 농도별로 제조한 황벽 나무 추출물을 멸균된 paper disc (Advantec, 8 ㎜)에 각각 5 ㎎ (in ethanol)씩 흡수시킨 다음, 평판배지 위 중앙에 살짝 올려놓았다. 그런 다음, 전 배양시킨 부후균의 균사 선단부를 8 ㎜ 코르크 보러 (cork borer)를 이용하여 disc위에 올려놓고 28℃에서 배양시켰다.
- 시료를 증류수에 현탁시킨 다음, n-hexane을 1:1 (v:v)의 비율로 혼합한 후 n-hexane (이하 Hex)층을 분리하였다. 동일한 방법으로 methylene chloride(이하 MC), ethylactate (이하 EtOAc)을 순차적으로 가하여 각 용매 층을 획득하였다. 용매별 가용성 추출물은 진공 감압 농축하여 본 실험의 분획물 시료로 사용하였다.
- 황벽나무 사부의 메탄올 추출물은 목부, 잎 및 열매의 메탄올 추출물보다 표면 오염균을 억제하는 활성을 나타내었다. 따라서 사부에서 이러한 항진균 효능을 나타내는 물질이 어떠한 특징을 가지고 있는지 알아보기 위해 유기용매의 극성차이를 이용하여 분획과정을 거쳐 각 분획물들의 활성을 조사하였다. 그 결과, 분획물 중에서 MC와 EtOAc 분획물에서 표면 오염균과 목재 부후균의 성장을 강하게 억제하였다(Table 6~8).
- 본 연구에서는 황벽나무의 메탄올 추출물과 분획물질을 이용하여 다양한 유기질 문화재 가해균에 대한 항진균 활성을 조사하였으며 그 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 선택배지는 유기질의 주 구성성분인 celluose, hemicellulose 및 lignin의 분해능 관찰을 위해 1.2% CMC (carboxy methyl cellulose, sigma), 0.5% Oat spelt xylan (sigma)를 첨가한 PDA 배지, 0.1%의 lignin을 첨가한 최소배지 ((NH4)2SO4 0.2%, K2HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.02%, Agar 1.5%)를 사용하였다.
- 대조군으로는 에탄올을 동일한 방식으로 흡수시켜 사용하였다. 소정의 배양 기간동안 추출물을 함유한 paper disc위에서 성장한 균사의 직경 비교를 통해 균사 생장 억제율 (Hyphal Growth Inhibition Ratio, HGIR %)을 다음 식에 의해 산출하였으며 3회 반복 실험하였다.
- 열매의 추출물 및 분획물질의 항진균 효과 뿐 아니라, 항산화 활성도 알아보았다. 유기질 문화재 특히, 종이류는 산화작용에 의한 열화에 가장 민감할 수 있기 때문에, 이를 방지하는 항산화 작용을 조사하기 위해 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성을 측정하였다.
- 용매별 극성차이를 이용하여 용매분획을 실시하였다. 시료를 증류수에 현탁시킨 다음, n-hexane을 1:1 (v:v)의 비율로 혼합한 후 n-hexane (이하 Hex)층을 분리하였다.
- 유기질 문화재 열화 미생물의 기질별 분해능은 균의 주변에 생기는 투명환의 육안관찰을 통하여 없음 (-), 약함 (w+), 강함 (+), 매우 강함 (++)으로 구분하였다. CMC, xylan 및 lignin과 같은 기질의 분해 여부를 관찰한 결과, 대부분의 곰팡이들이 CMC와 xylan을 강하게 분해하였다 (Table 3).
- 열매의 추출물 및 분획물질의 항진균 효과 뿐 아니라, 항산화 활성도 알아보았다. 유기질 문화재 특히, 종이류는 산화작용에 의한 열화에 가장 민감할 수 있기 때문에, 이를 방지하는 항산화 작용을 조사하기 위해 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성을 측정하였다. 그 결과, DPPH radical 소거활성에서 30 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 항산화 효과가 우수하다고 알려져 있는 Ferulic acid 보다 모두 높은 항산화 활성을 보였다.
- 주요 문화재 보관처로부터 분리한 균주들이 유기질을 분해시키는 효소를 분비하는지 알아보기 위해 다양한 기질 분해능 조사를 하였으며 방법은 서 등12)의 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 선택배지는 유기질의 주 구성성분인 celluose, hemicellulose 및 lignin의 분해능 관찰을 위해 1.
- 배양 후 멸균수를 넣고 유리봉으로 균의 표면을 긁어 나온 액을 2중의 거즈로 여과한 다음, 20% 글리세롤에 현탁하고 -80℃의 온도에 보관하여 사용하였다. 포자수는 haemacytometer (Marienfeld, Germany)를 이용하여 측정하였으며 모든 균주의 포자수를 3x106 spores로 일정하게 맞추어 실험하였다.
- 황벽나무 열매의 메탄올 추출물은 곰팡이의 성장을 억제하는 효과를 보이지 않는 것으로 나타났다. 하지만, 무구정광대다라니경의 보존에 있어서 황벽나무의 열매가 큰 역할을 했을 것 이라는 보고에 대한 검토를 위해서 메탄올 추출물을 다양한 용매로 분획한 다음, 항균 활성을 조사하였다. 그 결과, Hex과 MC 분획물에서 문화재로부터 순수 분리한 균주인 P.
대상 데이터
- 또한 유기질 문화재의 열화원으로 보고되고 있는 11종의 곰팡이를 KACC와 충남대학교 임산공학과로부터 분양받아 사용하였다 (Table 2). PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) 평판배지에서 28℃의 조건으로 계대배양하면서 항진균력 실험에 이용하였다.
- 사용된 균주는 2008년 해인사 장경판전으로부터 분리한 미생물인 표면 오염균들로서 KACC (Korean Agricultural Culture Collection)에 특허 미생물로 기탁되어진 균주들이다 (Table 1). 또한 유기질 문화재의 열화원으로 보고되고 있는 11종의 곰팡이를 KACC와 충남대학교 임산공학과로부터 분양받아 사용하였다 (Table 2). PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) 평판배지에서 28℃의 조건으로 계대배양하면서 항진균력 실험에 이용하였다.
- 본 연구에 사용된 황벽나무는 50년생으로 대전광역시 유성구 금고동의 수목원관리사업소 양묘장에서 2009년 9월에 채취하였다. 사부 (Phloem; Ph) 및 목부 (Xylem; Xy), 잎 (Leaf; Le), 열매 (Fruit; Fr)로 분리하여 -20℃ 냉동고에 보관하여 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 황벽나무는 50년생으로 대전광역시 유성구 금고동의 수목원관리사업소 양묘장에서 2009년 9월에 채취하였다. 사부 (Phloem; Ph) 및 목부 (Xylem; Xy), 잎 (Leaf; Le), 열매 (Fruit; Fr)로 분리하여 -20℃ 냉동고에 보관하여 실험에 사용하였다. 각 부위별로 3일 동안 음건하였고, 99.
- 사용된 균주는 2008년 해인사 장경판전으로부터 분리한 미생물인 표면 오염균들로서 KACC (Korean Agricultural Culture Collection)에 특허 미생물로 기탁되어진 균주들이다 (Table 1). 또한 유기질 문화재의 열화원으로 보고되고 있는 11종의 곰팡이를 KACC와 충남대학교 임산공학과로부터 분양받아 사용하였다 (Table 2).
- 2)로 여과하였다. 여액은 회전식 진공 농축기 (EYELA, Japan)로 감압농축한 후 본 실험의 시료로 사용하였다.
- 2)로 여과하였다. 여액은 회전식 진공농축기 (EYELA, Japan)로 감압농축한 후 본 실험의 조추출물 시료로 사용하였다.
- 동일한 방법으로 methylene chloride(이하 MC), ethylactate (이하 EtOAc)을 순차적으로 가하여 각 용매 층을 획득하였다. 용매별 가용성 추출물은 진공 감압 농축하여 본 실험의 분획물 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 부후균에 대한 항진균 활성 실험은 paper disc soaking 방법14)을 사용하였다. 농도별로 제조한 황벽 나무 추출물을 멸균된 paper disc (Advantec, 8 ㎜)에 각각 5 ㎎ (in ethanol)씩 흡수시킨 다음, 평판배지 위 중앙에 살짝 올려놓았다.
성능/효과
- 1. 황벽나무 사부, 목부, 잎 그리고 열매의 메탄올 추출물중에서 사부의 메탄올 추출물이 문화재로부터 순수 분리된 미생물 (표면 오염균)에 대한 항진균 효과를 나타냈다. 특히, C.
- 2. 사부의 분획물 중에서 MC와 EtOAc 분획물질이 표면 오염균을 억제하는데 우수한 효과를 나타냈으며 특히, 문화재로부터 순수 분리한 곰팡이들을 억제하는 뛰어난 활성을 보였다. 또한, EtOAc 분획물질은 목재 부후균의 성장을 저지하는 데에도 효과적이었다.
- 3. 열매의 분획물 중에서 Hex과 MC 분획물질이 P. toxicarium H4와 P. corylophilu H5에 대한 억제환을 나타냈지만 다소 약한 효과를 나타내었다. 하지만 Hex, MC와 EtOAc 분획물이 G.
- 4. 황벽나무의 우수한 항진균 효과와 열매의 항산화 활성을 조사한 이번 연구 결과로부터 황벽나무의 성분이 미생물의 성장을 억제하고 산화 방지에 높은 효과가 있음을 확인하였다. 황벽나무 추출물 및 분획물질을 이용하여 목재 문화재에 발생하는 생물학적 열화원인인 목재 부후균 및 표면 오염균, 해충의 방제를 위한 보존제의 원료 및 후보 물질로서의 활용 가능성을 확인하였다.
- 8%의 Ferulic acid보다 2배 이상의 높은 항산화 활성을 보여주었다. ABTS radical 소거활성에서는 100 ㎍/㎖의 농도에서 EtOAc 분획물이 82.9%의 소거활성을 보여 Ferulic acid (92.3%) 보다 비록 낮은 소거활성을 보였지만 다른 분획물 보다 비교적 높은 항산화 활성을 갖는 것으로 조사되었다. 또한, ABTS의 농도가 증가함에 따라 Ferulic acid와 함께 MC와 EtOAc 분획물질의 항산화 활성도 함께 증가하는 것을 볼 수 있었다 (Fig.
- 유기질 문화재 특히, 종이류는 산화작용에 의한 열화에 가장 민감할 수 있기 때문에, 이를 방지하는 항산화 작용을 조사하기 위해 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성을 측정하였다. 그 결과, DPPH radical 소거활성에서 30 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 항산화 효과가 우수하다고 알려져 있는 Ferulic acid 보다 모두 높은 항산화 활성을 보였다. 하지만 100 ㎍/㎖의 농도에서는 EtOAc 분획물이 62.
- 하지만, 무구정광대다라니경의 보존에 있어서 황벽나무의 열매가 큰 역할을 했을 것 이라는 보고에 대한 검토를 위해서 메탄올 추출물을 다양한 용매로 분획한 다음, 항균 활성을 조사하였다. 그 결과, Hex과 MC 분획물에서 문화재로부터 순수 분리한 균주인 P. toxicarium H4와 P. corylophilu H5를 억제하.는 효과가 관찰되었지만 (Table 7), 그 외의 균주들에 대한 항진균 활성을 보이지 못했다.
- 따라서 사부에서 이러한 항진균 효능을 나타내는 물질이 어떠한 특징을 가지고 있는지 알아보기 위해 유기용매의 극성차이를 이용하여 분획과정을 거쳐 각 분획물들의 활성을 조사하였다. 그 결과, 분획물 중에서 MC와 EtOAc 분획물에서 표면 오염균과 목재 부후균의 성장을 강하게 억제하였다(Table 6~8). 비록 사부의 메탄올 추출물 자체에서는 목재 부후균을 억제하는데 다소 미흡했지만, EtOAc 분획물은 대부분의 부후균에 대해서 항진균 활성을나타냈으며 P.
- palustris (TP)의 성장을 저지하는 효과를 나타내었다. 그 중에서 T. versicolor (TV)와 T. palustris (TP)에 대한 Hex 분획 물질의 항진균 활성은 사부의 메탄올 추출물 및 분획물에서 보다 우수하였으며 각각 43.53%와 35.29%의 억제활성을 나타내었다 (Table 8). 따라서 황벽나무의 열매는 목재를 부후시키는 균의 성장을 방해하는 효과를 가진 것으로 보여지며, 이러한 결과는 무구정광대다라니경의 보존에 있어서 열매의 역할을 어느 정도 검증한 계기가 되었을 것으로 사료된다.
- 대부분의 사부 분획물들은 문화재로부터 순수 분리된 곰팡이들의 발생을 강하게 억제하였으며, 그 중에서 P. toxicarium H4가 가장 민감한 것으로 나타났다.
- 29%의 억제활성을 나타내었다 (Table 8). 따라서 황벽나무의 열매는 목재를 부후시키는 균의 성장을 방해하는 효과를 가진 것으로 보여지며, 이러한 결과는 무구정광대다라니경의 보존에 있어서 열매의 역할을 어느 정도 검증한 계기가 되었을 것으로 사료된다.
- 3%) 보다 비록 낮은 소거활성을 보였지만 다른 분획물 보다 비교적 높은 항산화 활성을 갖는 것으로 조사되었다. 또한, ABTS의 농도가 증가함에 따라 Ferulic acid와 함께 MC와 EtOAc 분획물질의 항산화 활성도 함께 증가하는 것을 볼 수 있었다 (Fig. 1). 항진균 활성에서 효과적이었던 분획물들이 항산화 활성에서도 비교적 우수한 소거활성을 보임에 따라 종이류와 같은 유기질 문화재의 산화 방지에 효과적일 수 있으며 생물방제 물질의 활용 가능성을 본다면, 자체의 효능 지속 효과를 볼 수 있을 것으로 사료된다.
- 사부의 분획물 중에서 MC와 EtOAc 분획물질이 표면 오염균을 억제하는데 우수한 효과를 나타냈으며 특히, 문화재로부터 순수 분리한 곰팡이들을 억제하는 뛰어난 활성을 보였다. 또한, EtOAc 분획물질은 목재 부후균의 성장을 저지하는 데에도 효과적이었다.
- 이러한 미생물들은 유기질을 분해하는 효소를 분비하는 곰팡이로 확인되었다. 또한, 목재의 섬유소 및 리그닌을 분해하여 문화재에 손상을 끼치는 부후균에 대해서는 다른 추출물에 비해 잎의 메탄올 추출물이 균의 성장을 저지시키는데 효과적이었다.
- palustris와 같은 목재 부후균에 대해서는 우수한 저지 효과를 나타내었다. 또한, 열매의 MC, EtOAc 분획물질들은 뛰어난 항산화 활성을 나타내었다.
- 는 효과가 관찰되었지만 (Table 7), 그 외의 균주들에 대한 항진균 활성을 보이지 못했다. 목재 부후균에 대한 항진균 활성에서는 Hex, MC, EtOAc 분획물질이 G. lucidum (K7), T. versicolor (TV)와 T. palustris (TP)의 성장을 저지하는 효과를 나타내었다. 그 중에서 T.
- 그 결과, 분획물 중에서 MC와 EtOAc 분획물에서 표면 오염균과 목재 부후균의 성장을 강하게 억제하였다(Table 6~8). 비록 사부의 메탄올 추출물 자체에서는 목재 부후균을 억제하는데 다소 미흡했지만, EtOAc 분획물은 대부분의 부후균에 대해서 항진균 활성을나타냈으며 P. osteatus, S. commune와 G. lucidum의 성장을 모두 99.99% 억제하였다. 이러한 결과는 최16)가 황벽나무 사부의 MC 분획물이 목재 부후균인 C.
- 99% 억제하였다. 이러한 결과는 최16)가 황벽나무 사부의 MC 분획물이 목재 부후균인 C. puteana, L. lepideus와 T. versicolor를 100%억제하고 T. palustris, F. pinicola와 P. placenta를 각각 74.6%, 37.4%, 38.5% 억제했다는 결과와 유사하였으며 EtOAc 분획물이 가장 우수한 효과를 보였다는 결과가 일치하였다.
- toxicarium H4에 대해 각각 10, 13, 16 ㎜의 성장 억제환을 형성하여 곰팡이 저해효과를 나타내었다 (Table 5). 잎 (Le) 추출물은 비록 표면 오염균에 대해서는 억제하지 못했지만, 모든 목재 부후균에 대해서는 사부 추출물보다 높은 저지율 (%)을 보였다 (Table 4). 장 등5)은 황벽 나무의 메탄올 추출물이 C.
- 황벽나무의 사부, 목부, 잎 그리고 열매의 메탄올 추출물을 이용해 12점의 표면 오염균과 5종의목재 부후균에 대한 항진균 활성을 조사한 결과, 사부 추출물은 표면 오염균을 강하게 억제하였고 잎 추출물은 목재 부후균의 성장을 저지시키는 각기 다른 효과를 나타내었다. 특히, 사부 (Ph)의 메탄올 추출물은 문화재로부터 순수 분리한 균주인 C. cladosporioides H1, P. citreonigrum H3, P. toxicarium H4에 대해 각각 10, 13, 16 ㎜의 성장 억제환을 형성하여 곰팡이 저해효과를 나타내었다 (Table 5). 잎 (Le) 추출물은 비록 표면 오염균에 대해서는 억제하지 못했지만, 모든 목재 부후균에 대해서는 사부 추출물보다 높은 저지율 (%)을 보였다 (Table 4).
- corylophilu H5에 대한 억제환을 나타냈지만 다소 약한 효과를 나타내었다. 하지만 Hex, MC와 EtOAc 분획물이 G. lucidum, T. versicolor 와 T. palustris와 같은 목재 부후균에 대해서는 우수한 저지 효과를 나타내었다. 또한, 열매의 MC, EtOAc 분획물질들은 뛰어난 항산화 활성을 나타내었다.
- 황벽나무 추출물 및 분획물질을 이용하여 목재 문화재에 발생하는 생물학적 열화원인인 목재 부후균 및 표면 오염균, 해충의 방제를 위한 보존제의 원료 및 후보 물질로서의 활용 가능성을 확인하였다. 황벽나무 사부 추출물 및 분획물은 높은 항진균력을 보였고, 황벽나무 열매의 EtOAc 분획물은 항산화 활성이 높아 황벽나무 추출물의 생물방제 후보 물질로서의 가능성을 보여주었다.
- 황벽나무 사부의 메탄올 추출물은 목부, 잎 및 열매의 메탄올 추출물보다 표면 오염균을 억제하는 활성을 나타내었다. 따라서 사부에서 이러한 항진균 효능을 나타내는 물질이 어떠한 특징을 가지고 있는지 알아보기 위해 유기용매의 극성차이를 이용하여 분획과정을 거쳐 각 분획물들의 활성을 조사하였다.
- 황벽나무 열매의 메탄올 추출물은 곰팡이의 성장을 억제하는 효과를 보이지 않는 것으로 나타났다. 하지만, 무구정광대다라니경의 보존에 있어서 황벽나무의 열매가 큰 역할을 했을 것 이라는 보고에 대한 검토를 위해서 메탄올 추출물을 다양한 용매로 분획한 다음, 항균 활성을 조사하였다.
- 황벽나무의 우수한 항진균 효과와 열매의 항산화 활성을 조사한 이번 연구 결과로부터 황벽나무의 성분이 미생물의 성장을 억제하고 산화 방지에 높은 효과가 있음을 확인하였다. 황벽나무 추출물 및 분획물질을 이용하여 목재 문화재에 발생하는 생물학적 열화원인인 목재 부후균 및 표면 오염균, 해충의 방제를 위한 보존제의 원료 및 후보 물질로서의 활용 가능성을 확인하였다. 황벽나무 사부 추출물 및 분획물은 높은 항진균력을 보였고, 황벽나무 열매의 EtOAc 분획물은 항산화 활성이 높아 황벽나무 추출물의 생물방제 후보 물질로서의 가능성을 보여주었다.
- 황벽나무의 사부, 목부, 잎 그리고 열매의 메탄올 추출물을 이용해 12점의 표면 오염균과 5종의목재 부후균에 대한 항진균 활성을 조사한 결과, 사부 추출물은 표면 오염균을 강하게 억제하였고 잎 추출물은 목재 부후균의 성장을 저지시키는 각기 다른 효과를 나타내었다. 특히, 사부 (Ph)의 메탄올 추출물은 문화재로부터 순수 분리한 균주인 C.
후속연구
- 1). 항진균 활성에서 효과적이었던 분획물들이 항산화 활성에서도 비교적 우수한 소거활성을 보임에 따라 종이류와 같은 유기질 문화재의 산화 방지에 효과적일 수 있으며 생물방제 물질의 활용 가능성을 본다면, 자체의 효능 지속 효과를 볼 수 있을 것으로 사료된다.
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