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문제 정의
- 더욱이 암컷의 생식기관을 대상으로 nesfatin-1 발현을 연구한 결과는 현재까지 보고된 바 없다. 따라서 본 실험에서는 nesfatin-1 단백질이 암컷 생쥐의 생식기관에서 발현되는지, 그리고 그 결합 부위가 생식기관 내에 존재하는지를 확인하고, 아울러 생식선자극호르몬에 의해 nesfatin-1 발현이 조절 받는지를 조사함으로써 nesfatin-1이 생식기관에 미칠 수 있는 가능성을 알아보고자 하였다.
- , 2009b). 이에 본 연구에서는 암컷 생식기관인 난소와 자궁을 대상으로 NUCB2 mRNA의 발현을 확인하고, 난소 내 nesfatin-1 단백질의 발현 위치와 nesfatin-1의 결합 위치를 조사하여 nesfatin-1이 생식기능에 미칠 수 있는 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 6주령 ICR 계열 생쥐에서 대뇌, 시상하부, 뇌하수체, 위, 심장, 비장, 폐, 난소, 자궁 및 근육을 획득한 다음 각 조직에 RNA isoplus(TaKaRa, Japan) 300 μl 를 첨가하여 조직분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.
- 6주령 ICR계열 암컷 생쥐의 복강에 PMSG(Pregnant mare serum gonadotropin, Sigma, USA)를 5 unit(100 ㎕)를 투여하였으며, 대조군으로는 생리식염수 만을 100 ㎕ 투여하였다.
- NUCB2 mRNA 발현 여부를 확인하기 위하여 6X loading dye 2 μl와 DNA 10 μl를 100 V에서 30분간 전기영동한 후 EtBr로 20분 동안 염색한 다음 UV하에서 관찰하였다.
- NUCB2 mRNA 발현이 생식선 자극호르몬의 영향을 받는지 알아보기 위하여 5unit의 PMSG를 복강에 투여하고 24시간 후에 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA 발현을 real-time PCR 방법으로 조사하였다. 생리식염수만을 투여한 대조군과 비교해 볼 때 PMSG를 투여한 실험군의 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- , USA)에 24시간 동안 4℃에서 반응시켰다. PBS 용액으로 세척하고 1:400로 희석된 Alexa fluor 594 antirabbit IgG(Jackson immunoresearch laboratory, USA) 항체와 상온에서 1시간동안 반응시킨 다음, 증류수로 세척하고 DAPI(Sigma, USA)로 대조염색을 수행하였다.
- 즉, 생쥐에서 난소를 획득한 후 난소 주위의 지방을 제거하고 4% paraformaldehyde(Sigma, USA) 용액에서 1시간 동안 고정하였다. 고정한 난소 조직을 70%, 80%, 90%, 100% ethanol에 각각 30분씩 순차적으로 담가둔 후, 깨끗한 100% ethanol에 넣어 약 24시간 동안 보관하였다. 보관된 난소 조직을 1차 xylene, 2차 xylene에각각1시간씩넣고, 이어 xylene와 파라핀(50%:50%) 혼합 용액에 2시간, 100% 파라핀 용액에 2시간 담가두었다.
- 2b, 2e). 난소 내에서 nesfatin-1 단백질이 결합하는 부위가 어디인지를 확인하기 위하여 표식자가 부착된 nesfatin-1을 이용하여 염색을 수행하였다. 염색 결과, 난소 백막 주위의 협막세포와 기질세포에서 nesfatin-1 단백질 결합 부위가 존재함을 확인하였다(Fig.
- 위 방법으로 준비된 난소의 파라핀 절편을 이용하여 면역 조직화학염색법으로 nesfatin-1 단백질의 발현 위치를 조사하였다. 난소 절편이 부착된 슬라이드를 100% xylene와 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol로 3분간 단계적으로 처리한 후 흐르는 물로 세척하였다. 세척된 난소 조직은 PBS 용액에 5분간 처리한 다음, 1:50으로 희석된 anti-rabbit nesfatin-1 항체(PHOENIX Inc.
- , 2007), 아직까지 정확한 nesfatin-1 수용체의 구조와 기능은 밝혀지지 않고 있다. 따라서 nesfatin-1 수용체의 항체를 이용하여 nesfatin-1 수용체 발현 부위를 확인하는 것은 불가능하며, 본 연구에서는 이를 대신해서 biotin conjugated nesfatin-1을 이용한 염색을 수행하였다. 염색 결과, 난소 백막 주위의 협막세포와 기질세포에 nesfatin-1이 결합되는 것을 확인할 수 있었다.
- 체내 다양한 기관에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인하기 위하여 먼저 conventional PCR 방법으로 NUCB2 mRNA 발현 여부를 조사하였다. 분석한 모든 기관, 즉 대뇌, 시상하부, 뇌하수체, 위, 심장, 비장, 폐, 난소, 자궁 및 근육에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인하였다(Fig. 1A). Conventional PCR 방법으로 확인된 NUCB2 mRNA의 발현을 정량적으로 분석하기 위하여 real-time PCR을 수행한 결과, 흥미롭게도 시상하부에서보다 뇌하수체에서 더 많은 발현량을 보였으며, 소화기관인 위에서도 다량의 NUCB2 mRNA가 발현하고 있음을 확인하였다.
- 생쥐 난소에서 nesfatin-1 단백질의 발현 위치와 nesfatin-1 결합 부위를 확인하기 위하여 난소를 고정한 후 파라핀과 냉동 절편을 만들어 면역조직화학염색법으로 염색을 수행하였다. 즉, 생쥐에서 난소를 획득한 후 난소 주위의 지방을 제거하고 4% paraformaldehyde(Sigma, USA) 용액에서 1시간 동안 고정하였다.
- 위 방법으로 준비된 난소의 파라핀 절편을 이용하여 면역 조직화학염색법으로 nesfatin-1 단백질의 발현 위치를 조사하였다. 난소 절편이 부착된 슬라이드를 100% xylene와 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol로 3분간 단계적으로 처리한 후 흐르는 물로 세척하였다.
- 현재까지 생쥐의 난소와 자궁에서 NUCB2의 발현을 보고한 논문은 없으며, nesfatin-1 단백질이 생식 기능에도 중요한 요소로 작용할 수 있음을 시사하고있다. 이에본연구에서확인된난소내NUCB2 mRNA의 발현이 어떤 의미를 가지고 있는지를 알아보기 위하여, 먼저 난소 내 nesfatin-1 단백질의 발현 부위를 조사하였다. Nesfatin-1 항체를 이용하여 난소 내 nesfatin-1 단백질 발현 부위를 확인한 결과, nesfatin-1 단백질은 협막세포, 기질세포, 일부황체세포에서 발현되었다.
- 즉, cDNA에 NUCB2 forward 5'-AAAACCTTGGCCTGTCTGAA-3'; reverse 5'-CATCG ATAGGAACAGCTTCCA-3' primer(BIONICS, Korea)와 SYBR GreenⅠ(Roche, Switzerland)을 넣고 Light Cycler 480(Roche, Switzerland)으로 NUCB2 유전자의 발현량을 분석하였다.
- 생쥐 난소에서 nesfatin-1 단백질의 발현 위치와 nesfatin-1 결합 부위를 확인하기 위하여 난소를 고정한 후 파라핀과 냉동 절편을 만들어 면역조직화학염색법으로 염색을 수행하였다. 즉, 생쥐에서 난소를 획득한 후 난소 주위의 지방을 제거하고 4% paraformaldehyde(Sigma, USA) 용액에서 1시간 동안 고정하였다. 고정한 난소 조직을 70%, 80%, 90%, 100% ethanol에 각각 30분씩 순차적으로 담가둔 후, 깨끗한 100% ethanol에 넣어 약 24시간 동안 보관하였다.
- , USA)와 1시간 동안 상온에서 반응시켰으며, 다시 PBS 용액으로 세척한 후 1:500으로 희석된 Alexa fluor 594 streptavidin(Invitrogen, USA)으로 반응시켰다. 증류수로 세척하고 DAPI(Sigma, USA)로 대조염색을 수행하였으며, 형광 mounting 용액(fluorescent mounting media, Dako, Denmark)으로 봉입한 후 형광 현미경(Axioskop2, Carl Zeiss, Germany) 하에서 난소를 관찰하였다.
- 체내 다양한 기관에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인하기 위하여 먼저 conventional PCR 방법으로 NUCB2 mRNA 발현 여부를 조사하였다. 분석한 모든 기관, 즉 대뇌, 시상하부, 뇌하수체, 위, 심장, 비장, 폐, 난소, 자궁 및 근육에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인하였다(Fig.
- Tube에 남아 있는 75% ethanol을 제거하고 DEPC(TaKaRa, Japan) 물을 넣어준 상태로 약 1분간 섞은 후 냉동 보관하였다. 추출한 total RNA의 양은 Nano-drop(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)을 이용하여 측정하였다. Total RNA 3 μg을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 6주령 ICR계열 암컷 생쥐의 복강에 PMSG(Pregnant mare serum gonadotropin, Sigma, USA)를 5 unit(100μl)를 투여하였으며, 대조군으로는 생리식염수 만을 100 μl 투여하였다. 투여 24시간 후에 난소와 자궁을 획득하여 real-time PCR 방법으로 NUCB2 mRNA 발현을 조사하였다.
- 한편, 난소의 냉동절편을 사용하여 nesfatin-1 단백질의 결합 부위를 조사하였다. 난소의 냉동 절편이 붙어있는 슬라이드를 PBS 용액에 담가 O.
- 합성된 cDNA를 template DNA로 하여 β-actin forward 5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3'; reverse 5'-ATCGTGGGCCGCTCTAGGCACC-3'과 NUCB2 forward 5'-TTTGAACACCTGAACCACCA-3'; reverse 5'-TGGTCTTCGTGCTTCCTCTT-3' primers(BIONICS, Korea)를 이용한 conventional PCR을 실시하였다.
대상 데이터
- 각 실험군 당 다섯 마리의 생쥐를 사용하였으며, 모든 유전자의 발현 정도는 Mean±SEM으로 표시하였다.
- 대조유전자로는 GAPDH forward 5'-TTGATGGCAACAATCTCCAC-3'; reverse 5'-CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3'(BIONICS, Korea) 사용하였고, GAPDH 발현 정도를 기준으로 NUCB2 유전자의 상대적인 발현량을 계산하였다.
데이터처리
- 각 실험군 당 다섯 마리의 생쥐를 사용하였으며, 모든 유전자의 발현 정도는 Mean±SEM으로 표시하였다. 통계학적 유의성 검정은 student t-test 방법을 사용하였으며, 대조군과 실험군을 비교하여 p 값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- 위 방법으로 생쥐의 대뇌, 시상하부, 뇌하수체, 위, 심장, 간, 소장, 비장, 폐, 흉선, 난소, 자궁, 지방 및 근육에서 획득한 cDNA를 이용하여 NUCB2 mRNA 발현 정도를 real-time PCR 방법으로 분석하였다. 즉, cDNA에 NUCB2 forward 5'-AAAACCTTGGCCTGTCTGAA-3'; reverse 5'-CATCG ATAGGAACAGCTTCCA-3' primer(BIONICS, Korea)와 SYBR GreenⅠ(Roche, Switzerland)을 넣고 Light Cycler 480(Roche, Switzerland)으로 NUCB2 유전자의 발현량을 분석하였다.
성능/효과
- 1A). Conventional PCR 방법으로 확인된 NUCB2 mRNA의 발현을 정량적으로 분석하기 위하여 real-time PCR을 수행한 결과, 흥미롭게도 시상하부에서보다 뇌하수체에서 더 많은 발현량을 보였으며, 소화기관인 위에서도 다량의 NUCB2 mRNA가 발현하고 있음을 확인하였다. 특히, 생식기관인 난소와 자궁에서도 시상하부와 위에서 만큼이나 많은 양이 발현하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 이러한 결과는 협막세포와 기능이 비슷한 Leydig 세포에서 nesfatin-1 단백질의 발현을 확인했다는 면에서 본 연구 결과를 뒷받침한다고 할 수 있겠다. Nesfatin-1 염색 결과에서 흥미롭게도 난자에서 nesfatin-1 단백질 발현을 확인할 수 있었는데, 난포의 발달 상태에 따라 염색 정도가 달리 관찰되었다. 즉, 초기 난포에서보다는 성숙된 난포에 존재하는 난자에서 염색되는 경향을 보였다.
- 난소 내 nesfatin-1 단백질 발현 부위를 확인하기 위하여 난소 절편을 이용하여 면역조직화학적 염색을 수행한 결과, nesfatin-1 단백질은 난포를 둘러싸고 있는 협막세포와 대부분의 기질세포에서 발현되는 것을 확인하였다(Fig. 2a, 2b). 아울러 일부 황체세포에서 nesfatin-1 단백질 발현을 확인할 수 있었으나(Fig.
- 본 연구 결과에서 암컷 생쥐의 생식기관인 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA가 다량 발현된다는 것을 확인할 수 있었고, 더욱이 nesfatin-1 단백질과 그 결합 부위가 난소 내에 존재한다는 것을 처음으로 밝혔다. 또한, 생식선자극호르몬이 난소와 자궁에서 발현되는 NUCB2 mRNA의 양을 증가시킬 수 있다는 사실을 밝혔다. 이러한 연구 결과는 nesfatin-1이 시상하부에서 식욕을 조절하는 기능뿐만 아니라 생식기관에서도 생식기능을 조절할 수 있는 국부 조절 인자로써 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
- 먼저 난소와 자궁을 포함한 생쥐 내 다양한 기관에서 conventional PCR 방법으로 NUCB2 유전자의 발현을 확인한결과, 분석한 모든 기관에서 NUCB2 mRNA가 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 각 기관에서 발현되고 있는 NUCB2 mRNA의 양이 어느 정도인지 conventional PCR 방법으로 정확히 분석하기에는 문제가 있었다.
- 본 연구 결과, 위에서 발현되는 NUCB2 mRNA 양이 시상하부에서 발현되는 양보다 많은 것으로 확인됐다. 위에서 NUCB2 mRNA가 발현된다는 것은 이미 잘 알려진 사실로써 본 연구 결과와 일치하고 있으며, 그 기능을 밝히기 위해 현재 다양한 연구들이 진행되고 있다.
- 본 연구 결과에서 암컷 생쥐의 생식기관인 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA가 다량 발현된다는 것을 확인할 수 있었고, 더욱이 nesfatin-1 단백질과 그 결합 부위가 난소 내에 존재한다는 것을 처음으로 밝혔다. 또한, 생식선자극호르몬이 난소와 자궁에서 발현되는 NUCB2 mRNA의 양을 증가시킬 수 있다는 사실을 밝혔다.
- 본 연구에서 기존에 알려진 뇌와 소화기관에서 뿐만 아니라 생식기관인 난소와 자궁에서도 많은 양의 NUCB2 유전자가 발현되고 있음을 확인하였다. 현재까지 생쥐의 난소와 자궁에서 NUCB2의 발현을 보고한 논문은 없으며, nesfatin-1 단백질이 생식 기능에도 중요한 요소로 작용할 수 있음을 시사하고있다.
- NUCB2 mRNA 발현이 생식선 자극호르몬의 영향을 받는지 알아보기 위하여 5unit의 PMSG를 복강에 투여하고 24시간 후에 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA 발현을 real-time PCR 방법으로 조사하였다. 생리식염수만을 투여한 대조군과 비교해 볼 때 PMSG를 투여한 실험군의 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 따라서 nesfatin-1 수용체의 항체를 이용하여 nesfatin-1 수용체 발현 부위를 확인하는 것은 불가능하며, 본 연구에서는 이를 대신해서 biotin conjugated nesfatin-1을 이용한 염색을 수행하였다. 염색 결과, 난소 백막 주위의 협막세포와 기질세포에 nesfatin-1이 결합되는 것을 확인할 수 있었다.
- 난소 내에서 nesfatin-1 단백질이 결합하는 부위가 어디인지를 확인하기 위하여 표식자가 부착된 nesfatin-1을 이용하여 염색을 수행하였다. 염색 결과, 난소 백막 주위의 협막세포와 기질세포에서 nesfatin-1 단백질 결합 부위가 존재함을 확인하였다(Fig. 3).
- , 2009). 이러한 결과는 아마도 시상하부에 의해 뇌하수체의 NUCB2 발현이 조절될 수 있다는 것을 시사하고 있으며, nesfatin-1 단백질은 뇌하수체에 분비되는 다른 호르몬들과 마찬가지로 체내 다양한 기관을 표적으로 작용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이러한 연구 결과는 뇌하수체에서 분비되는 생식선자극호르몬에 의해 난소 내 NUCB2의 발현이 조절 받을 수 있음을 의미하며, 생리주기에 따른 난소와 자궁의 변화와도 연관이 있을 것으로 사료된다.
- 그러나 각 기관에서 발현되고 있는 NUCB2 mRNA의 양이 어느 정도인지 conventional PCR 방법으로 정확히 분석하기에는 문제가 있었다. 이를 해결하기 위하여 real-time PCR 방법으로 각 기관의 NUCB2 mRNA 발현량을 정량적으로 분석한 결과, 여러 기관에서 발현되는 NUCB2 mRNA 양의 차이를 확인할 수 있었다. 현재까지 알려진 바에 의하면 시상하부에 존재하는 여러 신경핵에서 NUCB2가 다량으로 발현되는 것으로 밝혀졌으나(Oh-I et al.
- 이상에 결과에서 NUCB2 유전자와 nesfatin-1 단백질이 난소 내에서 발현된다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 nesfatin-1 단백질이 난소에 작용하기 위해서는 nesfatin-1 수용체와 결합하여야 한다.
- , 2010). 이상의 결과들은 nesfatin-1이 뇌에서 뿐만 아니라 소화기관을 통해서도 섭식과 당대사 조절에 관여할 수 있음을 제시하고 있다.
- Conventional PCR 방법으로 확인된 NUCB2 mRNA의 발현을 정량적으로 분석하기 위하여 real-time PCR을 수행한 결과, 흥미롭게도 시상하부에서보다 뇌하수체에서 더 많은 발현량을 보였으며, 소화기관인 위에서도 다량의 NUCB2 mRNA가 발현하고 있음을 확인하였다. 특히, 생식기관인 난소와 자궁에서도 시상하부와 위에서 만큼이나 많은 양이 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 반면, 근육 조직에서는 거의 발현되지 않는 것으로 나타났다(Fig.
- 한편, 생식기관에서 발현되는 NUCB2 유전자가 생식선자극호르몬에 의해 영향을 받을 수 있는지를 알아보기 위해 PMSG 투여 후 생쥐 난소와 자궁에서의 NUCB2 mRNA 발현량을 조사한 결과, PMSG 투여 후 난소와 자궁에서 NUCB2 mRNA 발현량이 급격히 증가한 것을 알 수 있었다.
- 이를 해결하기 위하여 real-time PCR 방법으로 각 기관의 NUCB2 mRNA 발현량을 정량적으로 분석한 결과, 여러 기관에서 발현되는 NUCB2 mRNA 양의 차이를 확인할 수 있었다. 현재까지 알려진 바에 의하면 시상하부에 존재하는 여러 신경핵에서 NUCB2가 다량으로 발현되는 것으로 밝혀졌으나(Oh-I et al., 2006), 본 연구에서 확인한 결과 시상하부에서보다는 뇌하수체에서 더 많은 양이 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 최근 흰쥐의 시상하부와 뇌하수체를 대상으로 nesfatin-1 단백질과 NUCB2 mRNA의 발현을 조사한 논문에서도 시상하부의 여러 신경핵 부위와 더불어 뇌하수체에서 NUCB2이 다량 발현된다고 보고하고 있다(Foo et al.
후속연구
- 이러한 연구 결과는 nesfatin-1이 시상하부에서 식욕을 조절하는 기능뿐만 아니라 생식기관에서도 생식기능을 조절할 수 있는 국부 조절 인자로써 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 앞으로 난소, 자궁 및 난자를 포함한 생식기관 내에서 발현하고 있는 nesfatin-1 단백질의 기능을 밝히기 위하여 더 많은 연구가 요구된다.
- 또한, 생식선자극호르몬이 난소와 자궁에서 발현되는 NUCB2 mRNA의 양을 증가시킬 수 있다는 사실을 밝혔다. 이러한 연구 결과는 nesfatin-1이 시상하부에서 식욕을 조절하는 기능뿐만 아니라 생식기관에서도 생식기능을 조절할 수 있는 국부 조절 인자로써 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 앞으로 난소, 자궁 및 난자를 포함한 생식기관 내에서 발현하고 있는 nesfatin-1 단백질의 기능을 밝히기 위하여 더 많은 연구가 요구된다.
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