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문제 정의
- 따라서 본 연구는 칡소, 한우, Holstein과 교잡우(한우 × Holstein)에서 아직 시도되지 않은 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위를 품종별로 비교 분석하여 이를 이용한 품종 간 판별이 가능한지를 조사하고, 또한 MC1R mRNA의 발현 수준과 5종류로 분류된 칡소의 호반모색 발현과의 상관관계를 분석하고자 수행되었다.
- 본 연구는 MC1R mRNA 3'-비번역 부위의 변이를 칡소와 다른 품종과 구별에 적용할 수 있도록 하기 위하여 수행하였다.
- 본 연구에서는 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위를 분석하여 품종을 구분하기 위한 연구를 수행하였다.
가설 설정
- (d) Hanwoo × Holstein crossbred with almost black coat color.
제안 방법
- 5 bottom panel-위, d)∼f)). MC1R mRNA의 발현 수준은 RT-PCR을 수행한 후 전기영동을 실시하여 증폭된 단편의 농도로 발현 수준을 비교하였다. 칡소의 다양한 꼬리 모색에 따라, 증폭된 단편의 농도는 연한 정도, 중간 정도, 진한 정도를 포함하여 5단계로 나눌 수 있었다(Fig.
- MC1R 유전자 mRNA의 3'-비번역 부위를 증폭하기 위하여 GenBank에 등록된 MC1R 염기 서열(GenBank accession no. NM_174108.2)을 참고로 primer 쌍(forward primer 1280F: 5'-gca gtc cct tga caa aga gg-3'와 reverse primer 1745R: 5'-gca cca agc atc acg ttt att-3')을 설계하였다.
- 꼬리에서 채취한 모근을 포함한 모발을 5 mg 이내로 1.5 ml Eppendorf tube에 넣은 후, RNeasy Micro Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 RNA를 추출하였으며, Biodrop(Biochrom, England)을 이용하여 RNA의 농도를 측정하였다. 모근에서 추출한 RNA(100 ng/μl)를 template로 하고, one-step RT PCR DyeMIX(Enzynomics, Korea)를 사용하였으며, Veriti thermal cycler(AB, USA)에서 50℃로 30분간 처리하여 cDNA를 합성하였다.
- 염기서열의 분석에는 3쌍의 primer를 사용하였는데, forward primer 1127F: 5'-ctc ttc ctg gcc ctc atc at-3'와 reverse primer 1723R: 5'-ata ctg ctg cac tgc ttc ct-3', forward primer 1280F: 5'-gca gtc cct tga caa aga gg-3'와 reverse primer 1723R: 5'-ata ctg ctg cac tgc ttc ct-3', 그리고 forward primer 1280F: 5'-gca gtc cct tga caa aga gg-3' 와 reverse primer 1745R: 5'-gca cca agc atc acg ttt att-3'을 이용하였다. 또한, 칡소와 각 품종별 소의 꼬리 모색에 따른 MC1R mRNA의 발현 수준을 분석하여 비교하였다.
- 모근에서 추출한 RNA(100 ng/μl)를 template로 하고, one-step RT PCR DyeMIX(Enzynomics, Korea)를 사용하였으며, Veriti thermal cycler(AB, USA)에서 50℃로 30분간 처리하여 cDNA를 합성하였다.
- 실험 재료로 공시된 36두의 칡소를 모색에 따라 전신호반모, 부분호반모, 부분(일부)호반모, 황모, 흑모로 구분하고, 꼬리에서 대표 모색을 반영하는 모발을 모근을 포함하여 채취하였다. 모근에서 추출한 RNA를 template로 cDNA를 합성하고 PCR을 수행하였다. 칡소의 모색에 따른 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위의 변이를 비교하였는데, 칡소는 5종류의 모색에서 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위의 비교 부위는 모두 466 bp로서 길이가 같아, 모색에 따른 3'-비번역 부위의 변이는 없었다(Fig.
- 본 연구에 공시된 한우, 칡소, Holstein, 교잡우(한우 × Holstein)를 포함한 총 54두의 꼬리에서 대표 모색을 반영하는 모발을 모근을 포함하여 채취하고, RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하여 PCR을 수행함으로써 모색 유전자 MC1R mRNA 3'-비번역 부위의 변이를 비교하였다.
- 소의 품종과 칡소의 전신 모색에 따른 모색 관련 유전자 MC1R mRNA 3'-비번역 부위의 변이를 비교하였으며, 꼬리모색에 따른 MC1R mRNA의 발현 수준을 조사하였다.
- 소의 품종별로, 그리고 칡소의 모색 구분에 따라서 모색 유전자 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위의 차이를 분석하였다. 소의 품종별로 모색 유전자 MC1R mRNA의 염기서열을 분석하기 위하여 RT-PCR을 실시하고, 증폭 산물들을 PCR Purification kit(Enzynomics, Korea)를 이용하여 정제한 후 염기서열을 분석하였다(제노텍, 대전, Korea). 염기서열의 분석에는 3쌍의 primer를 사용하였는데, forward primer 1127F: 5'-ctc ttc ctg gcc ctc atc at-3'와 reverse primer 1723R: 5'-ata ctg ctg cac tgc ttc ct-3', forward primer 1280F: 5'-gca gtc cct tga caa aga gg-3'와 reverse primer 1723R: 5'-ata ctg ctg cac tgc ttc ct-3', 그리고 forward primer 1280F: 5'-gca gtc cct tga caa aga gg-3' 와 reverse primer 1745R: 5'-gca cca agc atc acg ttt att-3'을 이용하였다.
- 소의 품종별로, 그리고 칡소의 모색 구분에 따라서 모색 유전자 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위의 차이를 분석하였다.
- PCR 반응조건은 pre-denaturation으로 95℃에서 10분간 가열한 후, (95℃에서 30초간 denaturation, 61℃에서 20초간 annealing, 72℃에서 1분 20초간 extension)을 35 cycle 반복한 후 마지막으로 72℃에서 5분간 finalextension을 실시하고, PCR을 완료하였다. 증폭된 DNA를 확인하기 위해 1X TBE buffer로 2% agarose gel을 제조하여 100 volt에서 50분간 전기영동을 실시하였다.
- 칡소 36두, 한우 7두, Holstein 6두, 교잡우(한우 × Holstein) 5두의 꼬리에서 모근을 포함한 모발을 채취하여 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하여 PCR을 수행하고, 염기서열을 분석하였다.
- 전신호반모는 호반 무늬가 50% 이상인 경우, 부분호반모는 호반 무늬가 10% 이상에서 50% 미만인 경우, 그리고 부분(일부)호반모는 고유의 호반 무늬가 10% 미만으로 있는 경우이며, 황모는 전신의 모색이 한우와 비슷한 황색인 경우이고, 흑모는 전신의 모색이 흑색인 경우로 각각 구분하였다. 칡소의 개체별 모색의 구분과 함께 꼬리 모색도 조사하였다. 한우와 Holstein, 교잡우(한우 × Holstein)는 외관상 대표 모색과 꼬리 모색을 조사하였다.
- 1). 칡소의 개체별 모색의 구분은 한국종축개량협회 공고(2008-2호)를 기본으로 하여 재설정하였으며(한국종축개량협회, 2008), 모색은 6개월령 이상을 대상으로 조사하여 5종류[전신호반모, 부분호반모, 부분(일부)호반모, 황모(칡소인 부모로부터 태어났으나 모색이 황모인 칡소 자손들), 흑모]로 구분하였다. 전신호반모는 호반 무늬가 50% 이상인 경우, 부분호반모는 호반 무늬가 10% 이상에서 50% 미만인 경우, 그리고 부분(일부)호반모는 고유의 호반 무늬가 10% 미만으로 있는 경우이며, 황모는 전신의 모색이 한우와 비슷한 황색인 경우이고, 흑모는 전신의 모색이 흑색인 경우로 각각 구분하였다.
- 한우와 Holstein, 교잡우(한우 × Holstein)는 외관상 대표 모색과 꼬리 모색을 조사하였다.
- 설계된 primer들에 의한 예상 증폭 범위는 위의 MC1R 염기서열 1280부터 1745까지 466 bp였다. 합성된 cDNA와 10 pmol primer를 포함하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건은 pre-denaturation으로 95℃에서 10분간 가열한 후, (95℃에서 30초간 denaturation, 61℃에서 20초간 annealing, 72℃에서 1분 20초간 extension)을 35 cycle 반복한 후 마지막으로 72℃에서 5분간 finalextension을 실시하고, PCR을 완료하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 공시 동물은 칡소 36두, 한우 7두, Holstein 6두, 교잡우(한우 × Holstein) 5두를 포함하여 총 54두였다(Fig. 1).
- 실험 재료로 공시된 36두의 칡소를 모색에 따라 전신호반모, 부분호반모, 부분(일부)호반모, 황모, 흑모로 구분하고, 꼬리에서 대표 모색을 반영하는 모발을 모근을 포함하여 채취하였다. 모근에서 추출한 RNA를 template로 cDNA를 합성하고 PCR을 수행하였다.
- 염기서열의 분석에는 3쌍의 primer를 사용하였는데, forward primer 1127F: 5'-ctc ttc ctg gcc ctc atc at-3'와 reverse primer 1723R: 5'-ata ctg ctg cac tgc ttc ct-3', forward primer 1280F: 5'-gca gtc cct tga caa aga gg-3'와 reverse primer 1723R: 5'-ata ctg ctg cac tgc ttc ct-3', 그리고 forward primer 1280F: 5'-gca gtc cct tga caa aga gg-3' 와 reverse primer 1745R: 5'-gca cca agc atc acg ttt att-3'을 이용하였다.
성능/효과
- MC1R mRNA 3'-비번역 부위의 염기서열을 분석한 결과, 전에 품종 간 차이가 있다고 보고되었던 비교 부위의 염기서열이 네 품종에서 모두 동일하였다(Fig. 3).
- 공시된 Holstein은 전신의 모색이 검정색과 흰색의 얼룩무늬이지만, 꼬리의 모색은 거의 흰색이었고, 교잡우(한우 × Holstein)는 꼬리 모색이 검정색이었다(Fig.
- 그러나 본 연구의 결과에서는 MC1R mRNA 3'-비번역 부위에서 1,591∼1,626 bp(Fig. 3)을 포함한 비교 부위의 염기서열은 칡소를 포함하여 품종 간의 차이가 없었고, 꼬리모색이 흰색인 홀스타인을 비롯한 각 품종들이 모두 1,616 bp 이상의 긴 MC1R mRNA를 갖는 것을 확인하였다.
- 그 이유는 호반모를 가진 칡소들은 E+E+와 E+e 유전자형으로 원래의 MC1R 단백질을 발현할 수 있는 반면, 황모인 칡소의 자손들은 ee 유전자형의 가능성이 있으며, 증폭된 단편의 농도가 진하다고 하더라도 frameshift mutation에 의해 길이가 짧고, C-terminal 아미노산들의 서열이 다른 MC1R 단백질을 만들기 때문에 호반모의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다(Rouzaud 등, 2000; 박 등, 2014). 꼬리모색에 따른 MC1R mRNA의 발현 수준을 비교했을 때, 칡소에서는 꼬리모색이 진할수록 MC1R mRNA의 발현 수준이 증가하는 경향이었다(Fig. 5, top panel). 한우에서는 전신호반모와 교잡우(한우 × Holstein)에 비해 꼬리 모색이 황갈색으로 색상이 연하지만, 증폭된 단편의 농도는 중간 정도를 보였다(Fig.
- 칡소의 모색에 따른 MC1R mRNA의 발현 수준을 비교했을 때, 황모인 칡소의 자손들을 제외하면, 모색이 연할수록 증폭된 단편의 농도가 연하고, 모색이 검정색에 가까울수록 증폭된 단편의 농도가 짙은 경향을 보여, 모색과 mRNA의 발현 차이에 상관관계가 있다고 사료된다. 꼬리모색에 따른 MC1R mRNA의 발현 수준을 비교했을 때, 칡소에서는 모색이 진해질수록 발현 수준이 증가하는 경향을 보였다. 결론적으로 본 연구에 이용된 공시동물에서 품종별로 모색과 MC1R mRNA 3'-비번역 부위의 변이는 상관관계가 없었으나, 칡소에서 호반모의 발현과 MC1R mRNA 발현 수준의 차이는 상관관계가 있다고 사료되어 MC1R mRNA의 발현기작에 관한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 따라서 본 연구에 이용된 칡소를 포함한 각 품종의 공시동물에서는 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위의 변화가 모색의 발현에 관여하지 않는 것으로 판단된다.
- 5 top panel-아래, i(n=1+1), j(n=4)). 따라서 칡소에서는 꼬리 모색이 진해질수록, 증폭된 단편의 농도가 진한 경향을 보였다. 한우는 전신호반모와 교잡우(한우 × Holstein)에 비해 꼬리 모색이 황갈색으로 색상이 연하지만(Fig.
- 따라서 품종 간 3'-비번역 부위의 변이가 없었던 염기서열 분석의 결과는 한우, 칡소, Holstein, 교잡우(한우 × Holstein)에서 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위를 RT-PCR 방법으로 비교했을 때 품종 간의 변이가 없었던 결과(Fig. 2)와 일치하였다.
- 또한 품종별로 MC1R mRNA 3'-비번역 부위의 염기서열을 분석한 결과, 품종 간 염기서열의 변이는 없었다.
- 칡소의 전신 모색을 전신호반모, 부분호반모, 부분(일부)호반모, 황모, 흑모로 구분하여 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위를 비교한 결과, 모색에 따른 3'-비번역 부위의 변이는 없었다. 칡소의 모색에 따른 MC1R mRNA의 발현 수준을 비교했을 때, 황모인 칡소의 자손들을 제외하면, 모색이 연할수록 증폭된 단편의 농도가 연하고, 모색이 검정색에 가까울수록 증폭된 단편의 농도가 짙은 경향을 보여, 모색과 mRNA의 발현 차이에 상관관계가 있다고 사료된다. 꼬리모색에 따른 MC1R mRNA의 발현 수준을 비교했을 때, 칡소에서는 모색이 진해질수록 발현 수준이 증가하는 경향을 보였다.
- 한우, 칡소, Holstein, 교잡우(한우 × Holstein)를 공시동물로 이용하여 품종별로 모근에서 추출한 MC1R mRNA의 3'-비번역 부위 변이를 비교한 결과, MC1R mRNA의 3'-비번역 부위의 비교 부위가 모두 466 bp로서, 길이가 같아 품종에 따른 3'-비번역 부위의 변이는 없었다(Fig. 2).
- 그러나 증폭된 MC1R cDNA 단편의 농도를 전기영동을 실시하여 비교하면, 칡소의 모색에 따라 농도의 차이가 있었다. 호반 무늬가 50% 이상인 전신호반모와 흑모를 가진 칡소는 모두 20두였고, 이들에서는 증폭된 단편의 농도가 가장 진하였다. 그러나 호반 무늬가 10% 이상에서 50% 미만인 부분호반모를 가진 칡소들과 모색이 황모에 가깝고, 호반무늬가 10% 미만인 부분(일부)호반모를 가진 칡소들은 모두 16두였는데, 이들에서는 증폭된 단편의 농도가 연한 경향을 보였다.
후속연구
- 결론적으로 본 연구에 이용된 공시동물에서 품종별로 모색과 MC1R mRNA 3'-비번역 부위의 변이는 상관관계가 없었으나, 칡소에서 호반모의 발현과 MC1R mRNA 발현 수준의 차이는 상관관계가 있다고 사료되어 MC1R mRNA의 발현기작에 관한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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