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문제 정의
- 본 논문에서는 식품공전에 등재된 3종의 Cronobacter sakazakii 분리배지에 대하여 sensitivity, specificity를 측정하였으며 위양성 생성여부 및 식품에서의 회수 효율에 대하여 비교실험을 하였다.
제안 방법
- 식품공전에 Cronobacter sakazakii 분리배지로 등재되어 있는 3종의 분리배지에 대한 평가실험을 실시하였다. Chromogenic Enterobacter sakazakii agar, Enterobacter sakazakii agar가 VRBG agar에 비하여 뚜렷한 색택과 모양의 집락을 생성하였다. 3종의 분리배지 모두 30종의 Cronobacter sakazakii에 대한 sensitivity가 100%로 측정되었지만 Cronobacter sakazakii 이외의 Enterobacteriaceae 균주를 이용한 specificity 실험에서는 Chromogenic Enterobacter sakazakii agar, Enterobacter sakazakii agar가 100%로 측정되었지만 VRBG agar는 0%로 측정되었다.
- Cronobacter sakazakii 접종을 위한 식품의 용량을 1000 mL로 설정하였으며 실험에 공시된 Cronobacter sakazakii 는 ATCC 12868, 29004, 51329의 3종으로서 각각 별도로 배양한 후 연속희석법에 의해 1000 mL에 100 cfu 이상이 접종된 고농도 조건(100 cfu<inoculated cfu), 1000 mL에 10 ~ 100 cfu 이하가 접종된 저농도 조건(inoculated cfu<10 cfu)의 3구간의 농도로 조정하였다.
- 분리배지는 식품에서 직접 목적으로 하는 균을 분리하는 배지이기 때문에 식품에서의 회수율이 높은 것이 바람직하다. Cronobacter sakazakii를 식품에 인위적으로 접종한 후 분리배지를 이용하여 회수율을 평가하였다. 접종할 식품은 Cronobacter sakazakii 식중독이 발생할 가능성이 가장 높은 것으로 판단되는 식품인 조제분유를 대상으로 하였다.
- Sensitivity는 실험에 공시된 배지에서 목적으로 하는 대상균주를 고체배지에 획선 배양하였을 때 분리배지가 나타내는 전형적인 집락이 형성될 경우 양성으로 판단하였으며 그 비율을 측정하였다(19,20). Cronobacter sakazakii 표준 균주 4균주 및 식품에서 분리된 26균주로 총 30균주를 사용하였다.
- Specificity는 실험에 공시된 배지에서 대상균주인 Cronobacter sakazakii 이외의 균주를 획선 도말하였을 경우 위 양성(false positive)이 나타나지 않는 비율을 측정하였다 (19,20). 대상균주로는 Cronobacter sakazakii와 같이 Enterobacteriaceae에 속하는 균주인 E.
- 각 배지에 도말하여 36℃에서 24±2시간 배양한 후 CESA에서 청록색이고, VRBGA에서 자주색의 집락을, ESA에서는 장파장의 자외선(366 nm) 조사 하에 형광을 나타내는 집락을 Cronobacter sakazakii 추정균주로 하였다.
- 선택배지 비교실험에 선정된 3종의 배지에 대하여 sensitivity와 specificity를 측정하였다(Table 1). 먼저 sensitivity는 실험실에 보관중인 30종의 Cronobacter sakazakii를 3종의 분리배지에 획선 도말하여 37℃에서 성장시킨 후 각 분리배지의 특성에 맞게 생성되는 특징적인 집락 모양을 관찰하여 측정하였다. CESA, ESA 및 VRBGA 모두 각각의 분리배지의 선발원리에 맞는 특징적인 집락 색택 및 모양을 나타내었다.
- 선택배지 비교실험에 선정된 3종의 배지에 대하여 sensitivity와 specificity를 측정하였다(Table 1). 먼저 sensitivity는 실험실에 보관중인 30종의 Cronobacter sakazakii를 3종의 분리배지에 획선 도말하여 37℃에서 성장시킨 후 각 분리배지의 특성에 맞게 생성되는 특징적인 집락 모양을 관찰하여 측정하였다.
- 접종할 식품은 Cronobacter sakazakii 식중독이 발생할 가능성이 가장 높은 것으로 판단되는 식품인 조제분유를 대상으로 하였다. 시중에서 구매한 조제분유를 먼저 40℃의 물을 첨가하여 수화시켰으며 이후 생산업체에서 권고하는 방법에 따라 액상분유를 제조하였다. 식품공전에 고시된 Cronobacter sakazakii 분리를 위한 실험방법이 100 g의 조제분유를 1000 mL로 희석하여 제조하기 때문에 Cronobacter sakazakii 접종을 위한 식품 용량을 1000 mL로 설정하였다.
- 식품공전에 Cronobacter sakazakii 분리배지로 등재되어 있는 3종의 분리배지에 대한 평가실험을 실시하였다. Chromogenic Enterobacter sakazakii agar, Enterobacter sakazakii agar가 VRBG agar에 비하여 뚜렷한 색택과 모양의 집락을 생성하였다.
- 실험에 공시된 Cronobacter sakazakii는 ATCC 12868, 29004, 51329의 3종으로서 각각 별도로 배양한 후 연속적인 희석에 의해 가장 시료당 100 cfu 이상이 접종된 고농도 처리구, 시료당 10∼100 cfu 수준이 접종된 중간농도 처리구 및 시료당 10 cfu 이하가 접종된 저농도 처리구의 세 구간의 농도로 조정하였다.
- 인위적으로 조제분유에 접종한 후 식품공전 방법에 따라 실험하였으며 최종적으로 3종의 분리배지에 도말하여 36℃에서 24±2시간 배양한 후 전형적인 집락 생성여부를 파악하여 양성시료로 판별하였다(Table 4).
- 접종은 하나의 처리구당 5개의 서로 다른 처리구를 제조하여 5회 반복실험 중 양성으로 측정된 수를 나타내었다(21). 인위적인 접종 후, 비선택증균 배양 및 선택증균(EE broth) 배양을 실시하고 3종의 분리배지에 도말한 후 전형적인 집락의 생성여부를 판단하여 양성으로 판단하였다. 미생물 집락 모양이 불분명 할 경우는 API 20E biochemical kit를 이용하여 동정하여 판단하였다.
- 인위적으로 조제분유에 접종한 후 식품공전 방법에 따라 실험하였으며 최종적으로 3종의 분리배지에 도말하여 36℃에서 24±2시간 배양한 후 전형적인 집락 생성여부를 파악하여 양성시료로 판별하였다(Table 4). 접종은 하나의 처리구당 5개의 서로 다른 처리구를 설정하여 5번의 반복 실험으로 진행하였으며 5번의 시료중 Cronobacter sakazakii가 회수된 처리구를 계수하였다. ATCC 12868 균주의 경우 저농도에서는 모든 분리배지에서 회수가 되지 않았지만 접종농도가 증가함에 따라 3종의 분리배지 모두 회수율이 증가하는 것으로 나타났다.
대상 데이터
- coli O157:H7 6균주와 Salmonella spp. 24균주 등 Enterobacteriaceae에 속하는 30균주를 사용하여 실험하였다. 한국식품연구원 안전성연구단에 보관중인 미생물은 tryptic soy agar를 이용하여 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다.
- coli O157:H7 6균주(ATCC 35150, ATCC 43889, ATCC 43890, ATCC 43894, ATCC 43895, NCCP 11091)를 사용하였으며 Salmonella spp. 24균주를 사용하여 총 30종의 균주를 사용하였다.
- Sensitivity는 실험에 공시된 배지에서 목적으로 하는 대상균주를 고체배지에 획선 배양하였을 때 분리배지가 나타내는 전형적인 집락이 형성될 경우 양성으로 판단하였으며 그 비율을 측정하였다(19,20). Cronobacter sakazakii 표준 균주 4균주 및 식품에서 분리된 26균주로 총 30균주를 사용하였다. 식품에서 분리된 균주는 식품공전상의 생화학적 실험을 통하여 확인된 균주이었으며 동시에 자동동정시스템인 Vitek® compact에서 90% 이상의 확률로 동정된 균주이다.
- Specificity는 실험에 공시된 배지에서 대상균주인 Cronobacter sakazakii 이외의 균주를 획선 도말하였을 경우 위 양성(false positive)이 나타나지 않는 비율을 측정하였다 (19,20). 대상균주로는 Cronobacter sakazakii와 같이 Enterobacteriaceae에 속하는 균주인 E. coli O157:H7 6균주(ATCC 35150, ATCC 43889, ATCC 43890, ATCC 43894, ATCC 43895, NCCP 11091)를 사용하였으며 Salmonella spp. 24균주를 사용하여 총 30종의 균주를 사용하였다.
- coli O157:H7과 24종의 다양한 serotype의 Salmonella spp.를 대상으로 총 30종에 대한 실험을 실시하였다. 그 결과 CESA와 ESA에서는 Cronobacter sakazakii가 분리배지에서 나타내는 전형적인 색깔과 모양을 나타내는 균이 없는 것으로 측정되어 본 실험 조건에서는 위양성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
- 분리배지의 sensitivity 측정을 위해서 사용된 공인균주로 4종의 Cronobacter sakazakii 균주(ATCC 12868, 29004, 29544, 51329)가 사용되었으며 일반균주로는 식품에서 분리한 26종의 균주를 실험에 사용하였다. 분리배지의 specificity 측정을 위해서는 E.
- 식품에서의 회수실험은 Cronobacter sakazakii ATCC 12868, 29004, 51329 3종을 tryptic soy broth로 배양하여 4℃에서 20분간 원심분리(4,000×g)하여 균주를 회수하고 0.2% peptone water로 3번 수세한 후 사용하였다.
- 실험에 공시된 Cronobacter sakazakii 분리배지는 우리나라 식품공전에 등재된 배지로서 Chromogenic Enterobacter sakazakii agar(CESA), Violet red bile glucose agar(VRBGA), Enterobacter sakazakii agar(ESA)를 사용하였다. 각 배지에 도말하여 36℃에서 24±2시간 배양한 후 CESA에서 청록색이고, VRBGA에서 자주색의 집락을, ESA에서는 장파장의 자외선(366 nm) 조사 하에 형광을 나타내는 집락을 Cronobacter sakazakii 추정균주로 하였다.
- 인위적으로 접종하는 식품은 조제분유를 대상으로 하였다. Cronobacter sakazakii 접종을 위한 식품의 용량을 1000 mL로 설정하였으며 실험에 공시된 Cronobacter sakazakii 는 ATCC 12868, 29004, 51329의 3종으로서 각각 별도로 배양한 후 연속희석법에 의해 1000 mL에 100 cfu 이상이 접종된 고농도 조건(100 cfu<inoculated cfu), 1000 mL에 10 ~ 100 cfu 이하가 접종된 저농도 조건(inoculated cfu<10 cfu)의 3구간의 농도로 조정하였다.
- Cronobacter sakazakii를 식품에 인위적으로 접종한 후 분리배지를 이용하여 회수율을 평가하였다. 접종할 식품은 Cronobacter sakazakii 식중독이 발생할 가능성이 가장 높은 것으로 판단되는 식품인 조제분유를 대상으로 하였다. 시중에서 구매한 조제분유를 먼저 40℃의 물을 첨가하여 수화시켰으며 이후 생산업체에서 권고하는 방법에 따라 액상분유를 제조하였다.
- 24균주 등 Enterobacteriaceae에 속하는 30균주를 사용하여 실험하였다. 한국식품연구원 안전성연구단에 보관중인 미생물은 tryptic soy agar를 이용하여 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다. 식품에서의 회수실험은 Cronobacter sakazakii ATCC 12868, 29004, 51329 3종을 tryptic soy broth로 배양하여 4℃에서 20분간 원심분리(4,000×g)하여 균주를 회수하고 0.
성능/효과
- 2)The number of non-Cronobacter sakazakii strains giving a negative color reaction or failing to grow divided by the total number of non-Cronobacter sakazakii strains tested.
- Chromogenic Enterobacter sakazakii agar, Enterobacter sakazakii agar가 VRBG agar에 비하여 뚜렷한 색택과 모양의 집락을 생성하였다. 3종의 분리배지 모두 30종의 Cronobacter sakazakii에 대한 sensitivity가 100%로 측정되었지만 Cronobacter sakazakii 이외의 Enterobacteriaceae 균주를 이용한 specificity 실험에서는 Chromogenic Enterobacter sakazakii agar, Enterobacter sakazakii agar가 100%로 측정되었지만 VRBG agar는 0%로 측정되었다. 인위적으로 접종한 식품에서의 회수율은 실험에 공시된 3종 배지에서 커다란 차이가 없었다.
- 접종은 하나의 처리구당 5개의 서로 다른 처리구를 설정하여 5번의 반복 실험으로 진행하였으며 5번의 시료중 Cronobacter sakazakii가 회수된 처리구를 계수하였다. ATCC 12868 균주의 경우 저농도에서는 모든 분리배지에서 회수가 되지 않았지만 접종농도가 증가함에 따라 3종의 분리배지 모두 회수율이 증가하는 것으로 나타났다. 실험에 공시된 3종의 분리배지를 이용한 식품에서의 회수실험은 접종하는 Cronobacter sakazakii의 농도가 변수로 작용하는 것으로 나타났지만 조제분유에 인위적으로 접종한 Cronobacter sakazakii에 대한 분리배지간의 회수율 차이는 없는 것으로 판단되었다.
- 먼저 sensitivity는 실험실에 보관중인 30종의 Cronobacter sakazakii를 3종의 분리배지에 획선 도말하여 37℃에서 성장시킨 후 각 분리배지의 특성에 맞게 생성되는 특징적인 집락 모양을 관찰하여 측정하였다. CESA, ESA 및 VRBGA 모두 각각의 분리배지의 선발원리에 맞는 특징적인 집락 색택 및 모양을 나타내었다. 따라서 실험에 공시된 3종의 분리배지는 실험에 공시한 30종의 Cronobacter sakazakii에 대한 sensitivity가 100%인 것으로 판단되었다(Table 2).
- 미국 FDA에서 권고하고 있는 분리배지인 VRBGA는 자주색 집락을 형성하였으며 집락주위에 bile salt가 생성하는 검은색의 침전물이 생성되었다. VRBGA에서 형성된 집락보다는 CESA와 ESA에서 형성된 집락이 더욱 더 뚜렷한 색택과 모양을 나타내는 것으로 판단되었다. 이는 선택배지의 검출 원리가 서로 다르며 첨가되는 선택물질이 다르기 때문으로 보다 정확한 결과를 얻기 위해서는 분리배지에 대한 평가실험이 중요함을 알 수 있었다.
- 를 대상으로 총 30종에 대한 실험을 실시하였다. 그 결과 CESA와 ESA에서는 Cronobacter sakazakii가 분리배지에서 나타내는 전형적인 색깔과 모양을 나타내는 균이 없는 것으로 측정되어 본 실험 조건에서는 위양성을 나타내지 않음을 알 수 있었다. 따라서 2종의 배지에 대해서는 specificity가 100%로 측정되었다.
- 따라서 2종의 배지에 대해서는 specificity가 100%로 측정되었다. 그러나 VRBGA의 경우 실험에 공시된 30균주 모두 전형적인 Cronobacter sakazakii 집락의 색택과 모양을 나타내었으므로 모두 위양성으로 판단되었으며 따라서 specificity는 0%로 측정되었다(Table 3). 이는 CESA와 ESA는 Cronobacter sakazakii만이 가지는 고유한 특성인 α-glucosidase 선택마커로 사용하였기 때문에 specificity가 높은 것으로 나타났지만 VRBGA는 일반적인 coliform의 선발배지로 사용되므로 Citrobacter 속, Escherchia 속, Cronobacter 속, Klebsiella 속 모두에 대한 검출이 가능하기 때문에 specificity가 낮게 나타난 것으로 판단되었다.
- CESA, ESA 및 VRBGA 모두 각각의 분리배지의 선발원리에 맞는 특징적인 집락 색택 및 모양을 나타내었다. 따라서 실험에 공시된 3종의 분리배지는 실험에 공시한 30종의 Cronobacter sakazakii에 대한 sensitivity가 100%인 것으로 판단되었다(Table 2). 분리배지에서 가장 중요한 것이 목적하는 균에 대해서만 특징적인 선택성을 나타내어야 한다는 것이다.
- 식품에서 분리된 균주는 식품공전상의 생화학적 실험을 통하여 확인된 균주이었으며 동시에 자동동정시스템인 Vitek® compact에서 90% 이상의 확률로 동정된 균주이다.
- ATCC 12868 균주의 경우 저농도에서는 모든 분리배지에서 회수가 되지 않았지만 접종농도가 증가함에 따라 3종의 분리배지 모두 회수율이 증가하는 것으로 나타났다. 실험에 공시된 3종의 분리배지를 이용한 식품에서의 회수실험은 접종하는 Cronobacter sakazakii의 농도가 변수로 작용하는 것으로 나타났지만 조제분유에 인위적으로 접종한 Cronobacter sakazakii에 대한 분리배지간의 회수율 차이는 없는 것으로 판단되었다.
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