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문제 정의
- Ye 등(2011)은 α-glucosidase gene을 이용해 PCR로써 2가지의 Cronobacter spp.(ATCC 51329, ATCC 29544)의 검출방법에 대해 기술했다. 이 방법을 이용해 분유 내 103 CFU/mL 수준의 Cronobacter spp.
- 검출방법에 대하여 조사하고 분석함으로써, 보다 향상된 Cronobacter spp.의 신속하고 효율적이며, 정확한 검출을 위한 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 의 신속 검출에 대한 연구를 보고했다. Impedance 측정은BacTrac 4300 Microbiological Analyzer를 사용하였으며, RioboFlowTM Cronobacter kit를 이용하여 최종 검출하였다. 검출에 소요되는 시간은 20시간 이내로 68개의 분유오염샘플에서 Cronobacterspp.
- Xu 등(2014)은 PCR 분석과 자성분리법을 이용하여 검출하는 방법을 개발해서 보고했다. Probe-magnetic beads를 이용해 타겟으로 하는 균을 beads에 부착하여 여러 반응을 거친 후 PCR 증폭을 하여 균을 검출했다(Fig. 2). 이 방법을 이용하였을 때 4시간 정도의 분석시간이 필요했으며, 103 CFU/mL 수준에서 균을 검출할 수 있었으며, 기존의 PCR 기반으로 검출하는 방법들보다 검출시간을 많이 줄일 수 있었다고 보고했다.
- muytjensii IgG (1µg/mL), capture 항체로는 chicken anti-C. muytjensii IgY를 사용해 분석했다. Sandwich ELISA 방법을 이용하여 C.
- 현재, 우리나라 식품의약품안전처 식품공전의 Cronobacterspp. 검출방법은 우선 검체를 무균적으로 채취하여 멸균증류수에서 가한 후, 35~37℃에서 18~24시간 증균배양을 한 후그 배양액을 EE 배지에 첨가하여 35~37℃에서 18~24시간 2차 증균배양을 한다. 다음으로 균의 분리를 위하여 Chromogenic Enterobacter sakazakii(CES) agar, VRBG agar 또는 Enterobactersakazakii(ES) agar에 도말하여 35~37℃에서 24±2시간 배양하여 CES agar에서 청록색, VRBG agar에서 자주색 및 ES agar에서는 장파장의 자외선(366 nm) 조사 하에 형광을 나타내는 전형적인 집락들에 대하여 확인시험을 실시한다.
- FISH 방법은 일반적으로 세균의 확인에 사용되는 방법으로 특정 DNA 또는 RNA를 타겟으로 하는 nucleic acid probe를 특이적으로 결합한 것을 기반으로 한다. 검출하고자 하는 시료를 hybridization하고, 암실에서 반응 후 형광현미경을 이용해 관찰했다고 기술했다. 이 방법을 이용했을 때 분유 10 g에서 1 CFU의 검출한계를 얻을 수 있었으며, Cronobacter spp.
- 다음으로 균의 분리를 위하여 Chromogenic Enterobacter sakazakii(CES) agar, VRBG agar 또는 Enterobactersakazakii(ES) agar에 도말하여 35~37℃에서 24±2시간 배양하여 CES agar에서 청록색, VRBG agar에서 자주색 및 ES agar에서는 장파장의 자외선(366 nm) 조사 하에 형광을 나타내는 전형적인 집락들에 대하여 확인시험을 실시한다.
- 따라서 2002년 미국 식품의약품안전국에서는 분유에서의 Cronobacter spp.를 EE broth, VRBG 배지를 이용해 균을 분리하고, TSA 배지에 순수분리 후 노란색을 발하는 colony를 생화학적 실험을 통해 검출하는 방법을 제시했다. 또한, 우리나라 식품공전에서도 배지를 이용하여 Cronobacter spp.
- Zhou 등(2008)은 Cronobacter spp.를 zirconium hydroxide(Zr(OH)4)를 이용하여 고정화시킨 후, PCR 방법을 이용해 검출하는 방법을 제시하였다. 이 방법을 통해서 10 g 분유 내에서 3×100 CFU/mL의 검출한계를 얻을 수 있었다고 보고했다
- 를 증균하여 real-time PCR을 이용해Cronobacter spp.를 검출하는 방법에 대해서 기술했으며, 또한 internal amplification control(IAC) 방법과 비교 분석하였다. 특히, 다른 식품매개병원균과의 교차반응성 결과는 IAC와 비교하였을 때 real-time PCR 분석법이 증균 후 24시간 이내에 매우 특이적으로 Cronobacter spp.
- Liu 등(2006b)은 특이적 PCR primer와 oligonucleotide probe를 이용하여 Cronobacter spp.를 검출하는 방법을 제시했다. 이 방법을 이용했을 때 분석 소요시간은 48시간이었으며, 검출감도는 분유 100 g에서 1.
- 에 대한 검출을 보고했다. 우선 DNA를 추출하고 서열을 분석 후 primer를 디자인하였으며, PCR로 ropB gene을 증폭 후 PCR 산물을 얻었다. 다음으로 ELISA 방법에 따라 96 well microplate에 streptavidin을 코팅하고, PCR 산물을 처리하여 반응시켜주었다.
- Yu(2009)는 이진희석법을 변형 및 적용하여 균액 및 조제분유에 존재하는 Cronobacterspp.의 오염수준을 정량적으로 추정할 수 있는 간이신속법을 개발했다. 이 방법은 Cronobacter spp.
- Immunochromatographic strip은 nitrocellulose membrane을 사용하였으며, test line은 anti-digoxigenin antibody,control line은 biotin conjugate를 분사하여 immunochromatographicstrip을 제조했다. 제조한 immunochromatographic strip을 PCR 산물과 여러 시약들을 혼합한 반응액에 넣어 10분 정도 시간이 지난 이후 육안으로 직접 결과를 확인한다. 이 검출방법을 이용하였을 때 Cronobacter spp.
- 의 효율적인 검출방법에 대해 보고했다. 첫 번째 방법으로는 polyclonal 항체기반의 간접-ELISA와 polyclonal 및 mono- clonal 항체기반의 sandwich ELISA 방법을 제시했다. 간접-ELISA 방법의 교차반응성 테스트에서는 Cronobacter spp.
이론/모형
- 우선 DNA를 추출하고 서열을 분석 후 primer를 디자인하였으며, PCR로 ropB gene을 증폭 후 PCR 산물을 얻었다. 다음으로 ELISA 방법에 따라 96 well microplate에 streptavidin을 코팅하고, PCR 산물을 처리하여 반응시켜주었다. 반응이 끝나면 세척 후 antidigixigenin-detecting antibodies를 첨가하여 반응시킨다.
성능/효과
- 면역학적 방법에 의한 Cronobacterspp. 검출에 관한 연구를 통해, 분석에 소요되는 상당시간을 단축할 수 있었으며, 민감하고 특이적인 검출이 가능함을 보여주었다. 특히 일부 연구보고에서 면역학적 검출방법은 고가의 장비가 필요 없으며, 간단한 지침에 따라 모니터링 업무의 수행이 가능하다고 하였다.
- 따라서, 개발된 방법은 세균의 농도가 높을 경우(>1,100 MPN)에는 적합하지 않은 방법이라고 기술했다.
- 또한 Bacillus cereus (ATCC 49063) 외 22종의 식품매개병원균과의 교차반응성 테스트에서도 Cronobacter spp.만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
- 를 검출하는 방법을 제시했다. 이 방법을 이용했을 때 분석 소요시간은 48시간이었으며, 검출감도는 분유 100 g에서 1.3 CFU를 검출할 수 있었다. 또한, Cronobacter spp.
- muytjensii를 검출했다고 기술했다. 형광기반 리포좀의 면역분석법에 의해 균을 검출하는데 소요되는 시간은 13시간이었으며, 다른 식품매개병원균과의 교차반응성 테스트에서도 C. muytjensii만을 특이적으로 검출할 수 있었다. C.
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