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문제 정의
- 다음으로 본 연구자들은 짚신나물 추출물의 비만세포에서 탈과립 억제를 유도하는 기전을 알아보았다. 짚신나물 추출물의 비만세포 활성화의 억제기전을 연구하기위해 다양한 초기신호전달물질의 활성화에 대한 짚신나물 추출물의 억제 효과를 측정하였다.
- 본 연구를 요약하면 짚신나물추출물의 in vitro 비만세포 및 제 1형 알레르기동물모델에서 항알레르기 효과와 그 작용기전을 연구하였다. 짚신나물추출물은 RBL-2H3 및 골수유래의 비만세포 (BMMC)에서 항원자극에 대해 농도의존적인 항알레르기 효과 (IC50 = 약 50 ㎍/㎖)를 보였다.
- 본 연구에서는 우선 짚신나물 추출물의 Syk kinase의 인산화에 대한 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 짚신나물 추출물은 비만세포의 신호전달에 중요한 Syk kinase의 항원에 의한 타이로신 잔기 인산화를 농도 의존적으로 억제하였다 (Fig.
- 본 연구에서는 이러한 항원에 의한 탈과립 현상을 측정하기 위해 RBL-2H3 세포 및 골수유래의 비만세포(BMMC)에서 항원 자극에 의해 세포밖으로 분비되는 β-hexosaminidase의 짚신나물 추출물에 의한 억제 효과을 측정하였다.
- , 2006). 이 동물 모델은 생쥐의 귀에 IgE를 피내 주사하여 국소 비만세포를 감작시키고 항원을 꼬리 정맥주사 후 귀에 존재하는 비만세포 활성화에 의한 에반스 블루 색소의 혈관으로부터의 귀 조직으로의 유출정도를 측정하는 실험이다. 항원에 의한 에반스 블루의 혈관으로부터의 유출은 항원자극에 의해 현저히 증가함을 관찰할 수 있었으며 (Fig.
- 왜냐하면 약물의 비가역적인 작용은 인체에 투여 되었을 때 치명적인 부작용을 유발할 가능성이 있기 때문이다. 이에 본 연구자들은 짚신나물 추출물의 비만세포에서의 탈과립 억제 효과의 가역성 시험을 실시하였다. IgE로 감작한 비만세포를 1시간 동안 짚신나물 추출물로 처리한 다음 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 추출물을 PIPES 완충액으로 제거하고 다른 그룹은 제거하지 않은 상태에서 항원으로 자극하여 탈과립 활성의 가역성을 비교 측정하였다.
제안 방법
- 원심분리 후 상등액을 단백질 정량 후 시료로 사용하였다. 2x Laemmli buffer를 넣은 후 95℃에서 5분간 끓인 후 15 ㎕ 의 시료를 SDS-PAGE상에서 분리한 후 nitro-cellulose 막에 이동시키고 5% skim milk를 포함한 TBS-T 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 1시간 동안 처리하였다. 이후 측정하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체를 1 : 1000배로 희석하여 약 4℃에서 하룻밤 처리하였다.
- 1 mM non-essential amino acids, antibiotics 및 10% fetal calf serum)에서 배양하였으며 3주후약 98% 이상의 세포가 BMMC로 분화된 것을 FACS 분석을 통해 확인되었다. BMMCs 및 RBL-2H3 cells을 항원으로 자극하기위해 20 ng/㎖ DNP-specific IgE로 4시간 이상 감작시킨 후 BMMC는 Tyrode-BSA 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.5, 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 0.05% BSA)로 교체후 20 ng/㎖항원 (DNP-BSA)으로 자극하여 짚신나물 추출물의 효능을 짚신나물 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비만세포 활성을 비교하여 확인하였다. RBL-2H3 비만세포는 glutamine, anti-biotics, 15% FBS를 포함한 MEM 배지에서 배양하였으며 항원자극은 PIPES 완충액 (25 mM PIPES, pH 7.
- , 2006)에 의해 4-5주령 웅성 Balb/c 생쥐에서 다음과 같은 과정을 거쳐 추출하였다. BMMC는 10 ng/㎖ IL-3를 함유한 RPMI배지 (RPMI 1640, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, antibiotics 및 10% fetal calf serum)에서 배양하였으며 3주후약 98% 이상의 세포가 BMMC로 분화된 것을 FACS 분석을 통해 확인되었다. BMMCs 및 RBL-2H3 cells을 항원으로 자극하기위해 20 ng/㎖ DNP-specific IgE로 4시간 이상 감작시킨 후 BMMC는 Tyrode-BSA 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.
- BMMC와 RBL-2H3 비만세포를 24-well 배양플라스크(2 × 105 cells/0.4 ㎖/well)에 분주하고 20 ng/㎖ DNP-specific IgE를 포함한 배지에서 4시간 이상 감작시킨 후 비만세포를 PIPES (RBL-2H3 세포) 혹은 Tyrode (BMMCs) 완충액으로 세척 후 well 당 0.2 ㎖의 같은 완충액을 첨가하였다.
- , 2006)에 의해 실험을 실시하였다. DNP-BSA특이 IgE 0.5 ㎍을 마우스의 오른쪽 귀에 피내주사하고 24시간 후 대조군으로 5% arabic gum을 혹은 5% arabic gum에 현탁된 짚신나물추출물을 농도에 따라 경구로 투여한 다음, 1시간 후 4% 에반스블루용액에 녹아있는 250 ㎍ 항원 (DNP-BSA)을 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 항원주사 1시간 후 치사 하여 귀를 제거, 700 ㎕ formamide 용액에 넣은 후 70℃에서 하룻밤 동안 추출한 후 추출된 에반스블루 색소의 양은 620 ㎚에서 미리 작성한 검량선과 비교하여 에반스블루 농도를 측정하였다.
- 이에 본 연구자들은 짚신나물 추출물의 비만세포에서의 탈과립 억제 효과의 가역성 시험을 실시하였다. IgE로 감작한 비만세포를 1시간 동안 짚신나물 추출물로 처리한 다음 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 추출물을 PIPES 완충액으로 제거하고 다른 그룹은 제거하지 않은 상태에서 항원으로 자극하여 탈과립 활성의 가역성을 비교 측정하였다. 그림 2에서 보여지는 바와 같이 짚신나물 추출물의 탈과립 억제 효과는 완충액으로 세척 시 그 억제효과가 대부분 소멸 됨을 알 수 있었다.
- 05% BSA)로 교체후 20 ng/㎖항원 (DNP-BSA)으로 자극하여 짚신나물 추출물의 효능을 짚신나물 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비만세포 활성을 비교하여 확인하였다. RBL-2H3 비만세포는 glutamine, anti-biotics, 15% FBS를 포함한 MEM 배지에서 배양하였으며 항원자극은 PIPES 완충액 (25 mM PIPES, pH 7.2, 159 mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 1mM CaCl2, 5.6mM glucose, 0.1% BSA)에서 BMMC와 동일하게 IgE를 사용하여 감작시키고 항원자극을 시켰다.
- , 2003). 따라서 우리는 이 보조적인 신호전달과정에 대한 짚신나물 추출물의억제효과를 측정하였다. 그 결과, PI3K의 활성화를 표시하는Akt의 인산화도 역시 짚신나물추출물에 의해 억제되는 것을 볼 때 이 신호전달경로 역시 본 추출물에 의해 억제됨을 알 수 있었다 (Fig.
- 이후 측정하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체를 1 : 1000배로 희석하여 약 4℃에서 하룻밤 처리하였다. 막을 TBS-T로 세척 후 HRP에 연결되어있는 2차 항체를 1 : 2000배로 희석하여 1시간 동안 상온에서 처리, 세척 후 목적하는 단백질은 chemiluminescent 시약을 회사에서 권하는 실험절차에 따라 원하는 단백질을 검출 후 LAS3000(Fujifilm, Tokyo, Japan)을 이용하여 nitrocellulose막의 단백질을 확인하였다.
- 사육조건은 온도 22 ± 1℃ 및 습도 55 ± 10%에 12시간 light-dark cycle을 유지하였으며 1주일간 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 짚신나물추출물은 in vitro 비만세포를 이용한 실험에서 우수한 알레르기유발 물질 분비 억제 효과를 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 짚신나물추출물의 IgE/비만세포 의존성 알레르기 동물모델에서 제 1형 알레르기 반응 억제효과를 실험하였다. 본 논문에서는 알레르기 동물모델 중 가장 일반적으로 사용되어지는 IgE 및 비만세포 매개성 국소적 알레르기 동물모델인 passive cutaneous anaphylaxis (PCA)를 사용하였다(Kabu et al.
- 다음으로 본 연구자들은 짚신나물 추출물의 비만세포에서 탈과립 억제를 유도하는 기전을 알아보았다. 짚신나물 추출물의 비만세포 활성화의 억제기전을 연구하기위해 다양한 초기신호전달물질의 활성화에 대한 짚신나물 추출물의 억제 효과를 측정하였다. IgE/항원자극에 의해 비만세포는 FcεRI 수용체의 β-subunit에 결합되어 있던 Lyn이 β 및 γ-subunit의 ITAM을 인산화 시켜 세포질에 존재하는 Syk kinase를 수용체와 결합을 유도하여 하위 세포신호전달 물질을 활성화 시킨다(Gilfillan and Tkaczyk, 2006).
- 탈과립은 비만세포내 과립 속에 포함되어 있다가 세포밖으로 분비되는 β-hexosaminidase의 활성을 측정하여 전체 β-hexosaminidase의 활성에 대한 세포밖 배지로 분비된 그 효소의 활성 비율로 계산하였다.
- 5 ㎍을 마우스의 오른쪽 귀에 피내주사하고 24시간 후 대조군으로 5% arabic gum을 혹은 5% arabic gum에 현탁된 짚신나물추출물을 농도에 따라 경구로 투여한 다음, 1시간 후 4% 에반스블루용액에 녹아있는 250 ㎍ 항원 (DNP-BSA)을 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 항원주사 1시간 후 치사 하여 귀를 제거, 700 ㎕ formamide 용액에 넣은 후 70℃에서 하룻밤 동안 추출한 후 추출된 에반스블루 색소의 양은 620 ㎚에서 미리 작성한 검량선과 비교하여 에반스블루 농도를 측정하였다.
- 항체를 이용한 Immunoblotting 분석은 IgE로 감작된 비만 세포를 6 well 배양용기에서 20 ng/㎖ 항원으로 7분간 자극하고 얼음위에서 반응을 중지시켰다. 자극한 세포를 약 4℃의PBS 완충액으로 3회 세척 후 0.
대상 데이터
- 4주령의 웅성 Balb/c 마우스를 대한 실험동물센터 (음성, 한국)에서 구입하여 덕성여자대학교 약학대학 동물사육시설에서 사육하였다. 사육조건은 온도 22 ± 1℃ 및 습도 55 ± 10%에 12시간 light-dark cycle을 유지하였으며 1주일간 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- DNP-BSA (antigen, Ag), DNP-specific IgE, Arabic gum, diphenylhydramine (DPH) 및 에반스블루는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. PP2 (4-Amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl) pyrazolo[3,4-d]pyrimidine)는 Cal-biochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였고 인산화된 혹은 인산화되지 않은 ERK1/2, Akt, JNK 및 Syk에 대한 항체는Cell Signaling Technology Inc.
- (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. LAT 및 phosphotyrosine (4G10)에 대한 항체는Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA)에서 구입하였다. 비만세포의 배양을 위해 Minimum essential medium (MEM), RPMI (Roswell Park Memorial Institute) media, 글루타민과 다른 세포배양 시약은 GIBCO/Life Technologies Inc.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. PP2 (4-Amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl) pyrazolo[3,4-d]pyrimidine)는 Cal-biochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였고 인산화된 혹은 인산화되지 않은 ERK1/2, Akt, JNK 및 Syk에 대한 항체는Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. LAT 및 phosphotyrosine (4G10)에 대한 항체는Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA)에서 구입하였다.
- 간단히 추출과정을 기술하면 100 g의 건조된 짚신나물 전초를 50℃에서 메탄올 1000 ㎖에서 초음파 추출기를 이용 추출하였으며 추출액은 스피드백을 이용하여 40℃에서 24시간 동안 건조하였다. 건조후의 수득률은 약 15%였으며 추출과정에 따른 품질의 오차를 줄이기 위해 추출물은 비만세포의 항원 자극에 의한 탈과립 억제 효과를 확인한 후 실험에 사용 하였다.
- LAT 및 phosphotyrosine (4G10)에 대한 항체는Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA)에서 구입하였다. 비만세포의 배양을 위해 Minimum essential medium (MEM), RPMI (Roswell Park Memorial Institute) media, 글루타민과 다른 세포배양 시약은 GIBCO/Life Technologies Inc. (Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, 그 외 모든 시약은 시판되는 특급시약을 구입하여 사용하였다.
- 짚신나물 추출물 (013-076)은 한국식물추출물은행 (Plant extract bank)으로부터 입수하여 사용하였다. 간단히 추출과정을 기술하면 100 g의 건조된 짚신나물 전초를 50℃에서 메탄올 1000 ㎖에서 초음파 추출기를 이용 추출하였으며 추출액은 스피드백을 이용하여 40℃에서 24시간 동안 건조하였다.
데이터처리
- Statistical analysis was performed using one-way ANOVA and the Dunnett’s test.
- Statistical analysis was performed using one-way ANOVA and the Dunnett’stest.
- 실험결과는 최소 3번 이상 반복한 실험결과의 평균값 ± 분산으로 표시하고 one-way ANOVA 및 Dunnet's test를 이용통계적 유의성을 검정하였다. 대조군과 실험군과의 유의성 검정은 SigmaStat 프로그램 (Systat Software Inc., Point Richmond, CA)을 이용하여 시행하였다.
- 실험결과는 최소 3번 이상 반복한 실험결과의 평균값 ± 분산으로 표시하고 one-way ANOVA 및 Dunnet's test를 이용통계적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 사육조건은 온도 22 ± 1℃ 및 습도 55 ± 10%에 12시간 light-dark cycle을 유지하였으며 1주일간 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 1주일간 적응기간이 끝난 후 실험동물을 대조군과 짚신나물 추출물 투여군으로 그룹 당 10마리를 사용하여 구분한 후 이전에 보고된 방법 (Kabu et al., 2006)에 의해 실험을 실시하였다. DNP-BSA특이 IgE 0.
- 이러한 결과를 바탕으로 짚신나물추출물의 IgE/비만세포 의존성 알레르기 동물모델에서 제 1형 알레르기 반응 억제효과를 실험하였다. 본 논문에서는 알레르기 동물모델 중 가장 일반적으로 사용되어지는 IgE 및 비만세포 매개성 국소적 알레르기 동물모델인 passive cutaneous anaphylaxis (PCA)를 사용하였다(Kabu et al., 2006). 이 동물 모델은 생쥐의 귀에 IgE를 피내 주사하여 국소 비만세포를 감작시키고 항원을 꼬리 정맥주사 후 귀에 존재하는 비만세포 활성화에 의한 에반스 블루 색소의 혈관으로부터의 귀 조직으로의 유출정도를 측정하는 실험이다.
- 생쥐 골수유래 비만세포 (bone marrow-derived mast cells, BMMC)는 이미 보고된 방법 (Jensen et al., 2006)에 의해 4-5주령 웅성 Balb/c 생쥐에서 다음과 같은 과정을 거쳐 추출하였다. BMMC는 10 ng/㎖ IL-3를 함유한 RPMI배지 (RPMI 1640, 2 mM L-glutamine, 0.
성능/효과
- 본 연구에서는 우선 짚신나물 추출물의 Syk kinase의 인산화에 대한 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 짚신나물 추출물은 비만세포의 신호전달에 중요한 Syk kinase의 항원에 의한 타이로신 잔기 인산화를 농도 의존적으로 억제하였다 (Fig. 3A). 그 억제는 30 ㎍/㎖ 농도에서 현저하였으며 100 ㎍/㎖에서는 인산화가 거의 관찰되지 않았다 (Fig.
- 따라서 우리는 이 보조적인 신호전달과정에 대한 짚신나물 추출물의억제효과를 측정하였다. 그 결과, PI3K의 활성화를 표시하는Akt의 인산화도 역시 짚신나물추출물에 의해 억제되는 것을 볼 때 이 신호전달경로 역시 본 추출물에 의해 억제됨을 알 수 있었다 (Fig. 3B). 이러한 것은 Lyn과 Fyn은 같은 Src-family kinase로서 짚신나물추출물에 의해 모두 억제되는 것으로 생각되었다.
- 이러한 것은 짚신나물 추출물이 Src-family kinase의 활성의 억제를 통해 Syk kinse의 인산화를 억제하는 것을 의미한다. 다음으로 Syk kinase의 직접적인 기질 단백질이며 비만세포 활성화에 주요한 역할을 하는 adaptor 단백질인 LAT (linker for activation of T cells)의 인산화도 Syk kinse의 인산화 억제와 비슷한 정도로 억제되는 결과를 얻었다 (Fig 3A). 이러한 결과는 짚신나물 추출물의 비만세포 억제 효과는 FcεRI 수용체와 근접한 초기 신호전달과정에서의 중요한 역할을 하는 Syk kinase의 활성의 억제를 통해 그 억제효과를 나타나는 것으로 보여진다.
- 본 저자 등은 여러 종류의 천연 식물 추출물의 항알레르기 효과를 검색을 해왔으며, 본 논문에서는 짚신나물 (Agrimonia pilosa Ledeb.) 추출물이 in vitro 비만세포와 IgE 의존성 알레르기 동물모델에서 우수한 항 알레르기 효과가 있고 그 작용기전은 비만세포의 활성화 초기 신호전달물질인 Syk kinase의 활성화의 억제를 통해 약효가 나타남을 확인하였다.
- 1A 및 1B). 비만세포에서 탈과립은 히스타민 등의 알레르기 증상을 유도하는 물질의 분비를 의미하므로 짚신나물 추출물의 탈과립 억제는 제1형 알레르기 반응을 in vivo 동물모델이나 사람에서도 알레르기 반응을 억제할 수 있음을 시사하였다.
- 위의 실험 결과에서 짚신나물추출물을 전 처리했을 때 p38및 JNK MAP kinase의 활성은 변함이 없거나 오히려 증가하는 것으로 봐서 항원이 비만세포의 수용체 결합하는 것을 원천적으로 차단하는 기전은 아닌 것으로 생각되며 그 추출물의 유효성분이 비만세포의 세포막을 통과하여 초기신호전달물질 중 Src-family kinase 억제를 통한 Syk kinase의 활성억제 효과에서 비롯된다는 것을 알 수 있었다.
- 이러한 결과는 짚신나물 추출물의 비만세포 억제 효과는 FcεRI 수용체와 근접한 초기 신호전달과정에서의 중요한 역할을 하는 Syk kinase의 활성의 억제를 통해 그 억제효과를 나타나는 것으로 보여진다.
- 이러한 결과로 볼때 짚신나물 추출물의 Erk1/2 활성화 억제는 비만세포에서 TNF-α 생성을 억제할 가능성이 높은 것으로 생각됐다.
- 그림 2에서 보여지는 바와 같이 짚신나물 추출물의 탈과립 억제 효과는 완충액으로 세척 시 그 억제효과가 대부분 소멸 됨을 알 수 있었다. 이러한 실험결과는 짚신나물 추출물의 비만세포에 대한 탈과립 억제 효과는 가역적임을 보여 주었다 (Fig. 2).
- 4B). 이러한 억제는 1000 ㎎/㎏ 투여군에서 기존 항알레르기 효과를 가진 비교약물인 DPH (대조군대비 약 78% 억제)에 비해 다소 떨어지지만 유의한 효과 (대조군대비 약52% 억제)를 보여주었다.
- 짚신나물추출물은 RBL-2H3 및 골수유래의 비만세포 (BMMC)에서 항원자극에 대해 농도의존적인 항알레르기 효과 (IC50 = 약 50 ㎍/㎖)를 보였다. 이러한 항알레르기 효과는 가역적이었으며, 이에 더해 짚신나물추출물은 항원에 의해 유도된 IgE 및 비만세포 의존성 알레르기 동물모델에서 농도 의존적으로 알레르기 반응을 억제하였다. 작용기전으로 짚신나물추출물은 비만세포 초기 신호전달 활성화에 중요한 Syk kinase의 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 이는 Src-family kinase의 기질인 Syk kinase의 317번 아미노산 잔기인 tyrosine의 인산화를 억제하는 것을 볼 때 Lyn이나 Fyn등 Src-family kinase의 억제를 통해 항 알레르기 효과를 획득하는 것으로 생각되었다.
- 이러한 항알레르기 효과는 가역적이었으며, 이에 더해 짚신나물추출물은 항원에 의해 유도된 IgE 및 비만세포 의존성 알레르기 동물모델에서 농도 의존적으로 알레르기 반응을 억제하였다. 작용기전으로 짚신나물추출물은 비만세포 초기 신호전달 활성화에 중요한 Syk kinase의 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 이는 Src-family kinase의 기질인 Syk kinase의 317번 아미노산 잔기인 tyrosine의 인산화를 억제하는 것을 볼 때 Lyn이나 Fyn등 Src-family kinase의 억제를 통해 항 알레르기 효과를 획득하는 것으로 생각되었다. 현재 연구로는 짚신나물추출물의 어떤 성분이 항알레르기 효과를 나타내는 것에 대한 연구는 진행되어 있지 않으므로 추후 성분에 대한 연구 및 추출물의 독성에 대한 연구가 심층적으로 이루어지면 짚신나물추출물의 기능성식품이나 의약품으로의 개발이 가능하리라 생각된다.
- 본 연구를 요약하면 짚신나물추출물의 in vitro 비만세포 및 제 1형 알레르기동물모델에서 항알레르기 효과와 그 작용기전을 연구하였다. 짚신나물추출물은 RBL-2H3 및 골수유래의 비만세포 (BMMC)에서 항원자극에 대해 농도의존적인 항알레르기 효과 (IC50 = 약 50 ㎍/㎖)를 보였다. 이러한 항알레르기 효과는 가역적이었으며, 이에 더해 짚신나물추출물은 항원에 의해 유도된 IgE 및 비만세포 의존성 알레르기 동물모델에서 농도 의존적으로 알레르기 반응을 억제하였다.
- 짚신나물추출물은 in vitro 비만세포를 이용한 실험에서 우수한 알레르기유발 물질 분비 억제 효과를 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 짚신나물추출물의 IgE/비만세포 의존성 알레르기 동물모델에서 제 1형 알레르기 반응 억제효과를 실험하였다.
- , 2009). 짚신나물추출물은 흥미롭게도 p38 및 JNK의 활성에는 영향이 없었으며 Erk1/2를 특이적으로 억제하는 효과를 보였다 (Fig. 3B). 이러한 결과로 볼때 짚신나물 추출물의 Erk1/2 활성화 억제는 비만세포에서 TNF-α 생성을 억제할 가능성이 높은 것으로 생각됐다.
- 이 동물 모델은 생쥐의 귀에 IgE를 피내 주사하여 국소 비만세포를 감작시키고 항원을 꼬리 정맥주사 후 귀에 존재하는 비만세포 활성화에 의한 에반스 블루 색소의 혈관으로부터의 귀 조직으로의 유출정도를 측정하는 실험이다. 항원에 의한 에반스 블루의 혈관으로부터의 유출은 항원자극에 의해 현저히 증가함을 관찰할 수 있었으며 (Fig. 4A), 항원자극에 의한 귀 조직으로의 에반스 블루의 유출은 짚신나물추출물에 의해 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다(Fig. 4B). 이러한 억제는 1000 ㎎/㎏ 투여군에서 기존 항알레르기 효과를 가진 비교약물인 DPH (대조군대비 약 78% 억제)에 비해 다소 떨어지지만 유의한 효과 (대조군대비 약52% 억제)를 보여주었다.
후속연구
- 따라서 짚신나물추출물의 항알레르기 효과는 IgE/비만세포매개성 알레르기 동물모델에서도 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 현재 아이들에게 빈발하고 있는 아토피성 피부염에도 치료효과가 예상 되는 바 추후 연구가 더 필요할 것으로 생각되었다. 특히 추출물 자체로 바로 인체에 투여하기에는 다소 투여량이 큰 것을 생각할 때 짚신나물 추출물 중 유효성분의 규명 혹은 경구투여 이외의 외피용제 등의 개발을 통해 인체에 적용할 수 있는 방법을 연구하면 우수한 의약품 혹은 기능성식품으로의 개발이 가능하리라 생각되었다.
- 이러한 결과는 현재 아이들에게 빈발하고 있는 아토피성 피부염에도 치료효과가 예상 되는 바 추후 연구가 더 필요할 것으로 생각되었다. 특히 추출물 자체로 바로 인체에 투여하기에는 다소 투여량이 큰 것을 생각할 때 짚신나물 추출물 중 유효성분의 규명 혹은 경구투여 이외의 외피용제 등의 개발을 통해 인체에 적용할 수 있는 방법을 연구하면 우수한 의약품 혹은 기능성식품으로의 개발이 가능하리라 생각되었다.
- 작용기전으로 짚신나물추출물은 비만세포 초기 신호전달 활성화에 중요한 Syk kinase의 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 이는 Src-family kinase의 기질인 Syk kinase의 317번 아미노산 잔기인 tyrosine의 인산화를 억제하는 것을 볼 때 Lyn이나 Fyn등 Src-family kinase의 억제를 통해 항 알레르기 효과를 획득하는 것으로 생각되었다. 현재 연구로는 짚신나물추출물의 어떤 성분이 항알레르기 효과를 나타내는 것에 대한 연구는 진행되어 있지 않으므로 추후 성분에 대한 연구 및 추출물의 독성에 대한 연구가 심층적으로 이루어지면 짚신나물추출물의 기능성식품이나 의약품으로의 개발이 가능하리라 생각된다.
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