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제안 방법
- 즉, MgSO4 · 7H2O, 4.8 g; MgCl2 ·6H2O, 3.5 g; KCl, 1.0 g; CaCl2 · 2H2O, 0.18 g; NaHCO3, 0.03 g; NaBr, 0.013 g을 주요 염성분으로 사용하였고, BactoPeptone (Difco, USA), 2.5 g; Yeast extract (Difco, USA), 5.0 g; Glucose (Sigma, USA), 1.0 g; 증류수 1,000 mL, pH 7.2에 NaCl은 각각 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%와 7%가 첨가된 배지를 사용하여 최적 생장 NaCl 농도를 구하였으며, 당으로부터 산 생성능의 조사는 glucose와 lactose를 최종 농도 1%가 되도록 첨가하여 사용하였다.
- 염기서열의 결정은 16S rDNA 염기서열의 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer 를 사용하였고 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 결정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 염전으로부터 색소 생성능이 우수한 해양미생물 Kocuria sp. K70를 분리하여, 최적 색소생성 조건을 검토하고 식품첨가용 천연색소로서의 개발가능성을 탐색하기 위하여 색소의 온도, 광선, 금속이온에 대한 안정성을 조사하였다.
- 염기서열의 결정은 16S rDNA 염기서열의 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer 를 사용하였고 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 결정하였다. 또한 16S rDNA 염기서열의 상동성은 Gen Bank database에서 정보를 입수하여 Blast 검색에 의해 조사하였다.
- K70 균주를 MB (Marine broth, Difco, USA)배지에서 30℃, 200 rpm으로 48시간 진탕배양하였다. 배양액은 6,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 분리한 후 물, methanol, ethanol, acetone 및 methanol：acetone (7：2, v/v)의 4종류의 용매를 이용하여 각각 3회 반복 추출하였다. 추출한 색소는 spectrophotometer (Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 이용하여 350-900 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 배양액은 6,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 분리한 후 물, methanol, ethanol, acetone 및 methanol：acetone (7：2, v/v)의 4종류의 용매를 이용하여 각각 3회 반복 추출하였다. 추출한 색소는 spectrophotometer (Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 이용하여 350-900 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 색소 생성 최적조건을 조사하기 위한 온도, pH 그리고 NaCl 시험은 MB 배지에 배양액 1% (v/v)를 접종한 후, 배양시간 4시간 마다 균체량은 660 nm, 색소량은 최대 흡광도를 나타낸 469 nm에서 측정하였다. 색소의 최적생성 온도는 25℃, 30℃, 37℃, 45℃에서 조사하였다.
- 색소 생성 최적조건을 조사하기 위한 온도, pH 그리고 NaCl 시험은 MB 배지에 배양액 1% (v/v)를 접종한 후, 배양시간 4시간 마다 균체량은 660 nm, 색소량은 최대 흡광도를 나타낸 469 nm에서 측정하였다. 색소의 최적생성 온도는 25℃, 30℃, 37℃, 45℃에서 조사하였다. 색소 생성 최적 pH는 KOH와 HCl를 사용하여 pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10으로 조정하여 사용하였으며 색소 생성 최적 NaCl 농도는 균주의 최적생장 NaCl 농도를 조사하기 위한 배지와 동일배지를 사용하였으며 NaCl 농도는 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%로 조정하여 사용하였다.
- 색소의 최적생성 온도는 25℃, 30℃, 37℃, 45℃에서 조사하였다. 색소 생성 최적 pH는 KOH와 HCl를 사용하여 pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10으로 조정하여 사용하였으며 색소 생성 최적 NaCl 농도는 균주의 최적생장 NaCl 농도를 조사하기 위한 배지와 동일배지를 사용하였으며 NaCl 농도는 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%로 조정하여 사용하였다.
- 탄소원과 질소원이 Kocuria sp. K70 균주의 색소 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Kim 등 [15]의 배지를 변형 하여 사용하였다. 변형된 배지 조성은 casamino acid 0.
- K70 균주의 색소 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Kim 등 [15]의 배지를 변형 하여 사용하였다. 변형된 배지 조성은 casamino acid 0.75%, yeast extract 1.0%, sodium citrate 3%, potassium chloride 0.2%, magnesium sulfate 2.0%, ferric sulfate (pH 7.4) 0.0023%로 조성하였다. 여기에 NaCl 농도를 2%로 한 배지에 탄소원과 질소원의 최종농도 1%가 되도록 첨가하였다.
- 0023%로 조성하였다. 여기에 NaCl 농도를 2%로 한 배지에 탄소원과 질소원의 최종농도 1%가 되도록 첨가하였다. 단, 질소원에 대한 조사시에는 yeast extract 대신 시험하고자 하는 질소원을 첨가하였다.
- 여기에 NaCl 농도를 2%로 한 배지에 탄소원과 질소원의 최종농도 1%가 되도록 첨가하였다. 단, 질소원에 대한 조사시에는 yeast extract 대신 시험하고자 하는 질소원을 첨가하였다. 탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, manitol, sorbitol, glycerol을 첨가하여 확인하였고, 유기질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone, peptone을 사용하였으며, 무기 질소원으로는 potassium nitrate, ammonium nitrate, sodium nitrate를 사용하였다.
- 단, 질소원에 대한 조사시에는 yeast extract 대신 시험하고자 하는 질소원을 첨가하였다. 탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, manitol, sorbitol, glycerol을 첨가하여 확인하였고, 유기질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone, peptone을 사용하였으며, 무기 질소원으로는 potassium nitrate, ammonium nitrate, sodium nitrate를 사용하였다. 배양조건은 30℃에서 48시간 진탕배양하면서 spectrophotometer (Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 사용하여 균체량은 660 nm, 색소량은 469 nm에서 흡광도를 측정하여 조사하였다.
- 온도에 대한 안정성의 조사는 50 μg/mL의 색소추출물을 3 mL 시험관에 넣은 후 빛이 없는 조건에서 -20℃, 4℃, 25℃, 40℃에서 15일간 보존하면서 24시간 간격으로 색소 추출물의 최대 흡수파장인 469 nm에서 흡광도를 측정하여 조사하였다.
- 금속이온에 대한 안정성은 50 μg/mL의 색소 추출물 3 mL에 1.0 × 102 M 농도의 NaCl, AlCl3, FeCl2, CaCl2, CuCl2, AnCl2, MgCl2와 KCl의 금속이온 용액을 각각 1.0% 첨가하여 [11], 25℃의 암소에서 15일간 보존하면서 24시간 간격으로 469 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 광선에 대한 안정성은 50 μg/mL의 색소 추출물을 3 mL 시험관에 넣은 후 110 V, 30 W의 조명으로부터 30 cm의 거리에 위치시키고, 25℃에서 15일간 보존하면서 24시간 간격으로 469 nm에서 흡광도를 측정하여 조사하였다.
- 탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, manitol, sorbitol, glycerol을 첨가하여 확인하였고, 유기질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone, peptone을 사용하였으며, 무기 질소원으로는 potassium nitrate, ammonium nitrate, sodium nitrate를 사용하였다. 배양조건은 30℃에서 48시간 진탕배양하면서 spectrophotometer (Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 사용하여 균체량은 660 nm, 색소량은 469 nm에서 흡광도를 측정하여 조사하였다.
- 0% 첨가하여 [11], 25℃의 암소에서 15일간 보존하면서 24시간 간격으로 469 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 금속이온을 첨가하지 않고 같은 조건에서 실험을 수행하였다.
- 빛이 색소의 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 25℃의 빛이 있는 조건과 없는 조건에 보관하며 색소의 변화를 관찰하였다. 25℃에서 빛이 없는 조건에서는 14일이 경과한 후 황색 색소가 90% 이상의 잔존율을 나타내었다 (Fig 5).
- 금속이온이 색소에 미치는 영향은 빛이 없는 25℃ 조건에서 AlCl3을 포함하여 8종의 금속에 대하여 조사하고 금속이온을 첨가하지 않은 경우와 비교하였다 (Fig. 6). MgCl2의 경우 색소 잔존율이 96%, CaCl2의 경우 93%를 나타내어 이들 금속이온에 대하여 매우 높은 안정성을 나타내었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 균주는 남해 미조면 구들녀 염전의 해수로부터 분리하였다. 해수는 멸균된 용기에 담아 4℃에서 운반 후, 인공해수를 사용하여 단계희석법으로 희석한 후 MA(Marine agar 2216, Difco, USA) 배지를 이용하여 30℃에서 3일간 배양 후 색소 생성능이 우수한 균주를 1차적으로 선별한 후 최종적으로 황색색소를 생산하는 Kocuria sp.
- 해수는 멸균된 용기에 담아 4℃에서 운반 후, 인공해수를 사용하여 단계희석법으로 희석한 후 MA(Marine agar 2216, Difco, USA) 배지를 이용하여 30℃에서 3일간 배양 후 색소 생성능이 우수한 균주를 1차적으로 선별한 후 최종적으로 황색색소를 생산하는 Kocuria sp. K70균주를 선별하여 본 실험에 사용하였다. 순수 분리된 균주는 20% glycerol을 첨가하여 -80℃에 보관하며 사용하였다.
이론/모형
- 분리된 Kocuria sp. K70 균주는 MA 배지를 이용하여 30℃에서 배양하여 Yeon 등 [24]의 방법에 의해 그람염색, 운동성, 최적생장 pH와 NaCl 농도를 조사하였다. pH는 KOH와 HCl로 pH 5에서 pH 10까지 조정하여 사용하였다.
- DNA 증폭 및 염기서열 결정은 Yeon 등의 방법 [24]을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 결정은 16S rDNA 염기서열의 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer 를 사용하였고 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 결정하였다.
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