아그로박테리움를 이용한 국내개발 국화품종 '무랑루즈'의 형질전환 기술 및 AtSICKLE 유전자를 이용한 엽형 변화 국화 형질전환체 개발 Development of Agrobacterium-mediated Transformation Method for Domestically Bred Chrysanthemum Cultivar 'Moulinrouge' and Genetic Change of Leaf Morphology Using AtSICKLE Gene원문보기
본 연구는 경남 화훼연구소에서 개발 육성된 스프레이형 국화 18 품종들에 대한 재분화율을 각각 조사하고, 그 중에서 '무랑루즈'가 가장 우수한 재분화 능력이 있음을 확인하였다. 특히 BA($0.5mg{\cdot}L^{-1}$)와 NAA($1.0mg{\cdot}L^{-1}$)를 함유한 MS배지를 신초재분화 배지로 이용함으로써 스탠다드형 국화인 신마와 함께 스프레이형 국화인 '무랑루즈'의 잎 절편체부터 효율적으로 신초 형성을 유도하고 완전한 식물체로 재분화시킬 수 있었다. 이러한 신초재분화 조건에서 '무랑루즈'잎 절편에 아그로박테리움을 감염하고 10일 동안 함께 배양한 후에, 선발항생제 kanamycin 농도를 저농도($10mg{\cdot}L^{-1}$)에서 고농도($30mg{\cdot}L^{-1}$)로 단계적으로 선발과정을 강화함으로써 효율적인 국화 형질전환체 제작이 가능하였다. 조사한 kanamycin 저항성 식물체 모두에서 전이유전자 $AtSICKLE$가 존재함을 genomic PCR 방법으로 확인하였다. 비록, 국화에서 그 기능이 비효율적인 CaMV 35S 프로모터를 사용했기 때문에 RT-PCR로 확인한 형질전환체에서의 전이유전자 $AtSICKLE$의 발현율은 상대적으로 낮았으나, 그 발현이 상대적으로 높은 개체에선 잎의 상편생장에 의한 엽형의 변화가 나타났다. 이러한 연구의 결과는 모델 식물체에서 분리되고 연구된 많은 유전자들이 가지는 화훼작물의 분자육종학적 가치를 국화에서 대량으로 조사할 수 있는 기반을 제공 할 것으로 기대된다.
본 연구는 경남 화훼연구소에서 개발 육성된 스프레이형 국화 18 품종들에 대한 재분화율을 각각 조사하고, 그 중에서 '무랑루즈'가 가장 우수한 재분화 능력이 있음을 확인하였다. 특히 BA($0.5mg{\cdot}L^{-1}$)와 NAA($1.0mg{\cdot}L^{-1}$)를 함유한 MS배지를 신초재분화 배지로 이용함으로써 스탠다드형 국화인 신마와 함께 스프레이형 국화인 '무랑루즈'의 잎 절편체부터 효율적으로 신초 형성을 유도하고 완전한 식물체로 재분화시킬 수 있었다. 이러한 신초재분화 조건에서 '무랑루즈'잎 절편에 아그로박테리움을 감염하고 10일 동안 함께 배양한 후에, 선발항생제 kanamycin 농도를 저농도($10mg{\cdot}L^{-1}$)에서 고농도($30mg{\cdot}L^{-1}$)로 단계적으로 선발과정을 강화함으로써 효율적인 국화 형질전환체 제작이 가능하였다. 조사한 kanamycin 저항성 식물체 모두에서 전이유전자 $AtSICKLE$가 존재함을 genomic PCR 방법으로 확인하였다. 비록, 국화에서 그 기능이 비효율적인 CaMV 35S 프로모터를 사용했기 때문에 RT-PCR로 확인한 형질전환체에서의 전이유전자 $AtSICKLE$의 발현율은 상대적으로 낮았으나, 그 발현이 상대적으로 높은 개체에선 잎의 상편생장에 의한 엽형의 변화가 나타났다. 이러한 연구의 결과는 모델 식물체에서 분리되고 연구된 많은 유전자들이 가지는 화훼작물의 분자육종학적 가치를 국화에서 대량으로 조사할 수 있는 기반을 제공 할 것으로 기대된다.
'Moulinrouge' was selected as the best regenerating cultivar among 18 different spray-type chrysanthemum cultivars bred in the Gyeongnam Flowers Breeding Research Institute. When the leaf explants from standard- and spray-type chrysanthemum 'Jinba' and 'Moulinrouge' were incubated on MS basal medium...
'Moulinrouge' was selected as the best regenerating cultivar among 18 different spray-type chrysanthemum cultivars bred in the Gyeongnam Flowers Breeding Research Institute. When the leaf explants from standard- and spray-type chrysanthemum 'Jinba' and 'Moulinrouge' were incubated on MS basal medium supplemented with $0.5mg{\cdot}L^{-1}$ BA and $1.0mg{\cdot}L^{-1}$ NAA, both 'Jinba' and 'Moulinrouge' induced adventitious shoots that can be regenerated into plantlets. Based on these regeneration conditions, we developed an efficient $Agrobacterium$-mediated chrysanthemum 'Moulinrouge' transformation method by using sequential selection of shoots from low ($10mg{\cdot}L^{-1}$) to high ($30mg{\cdot}L^{-1}$) concentrations of kanamycin after co-cultivation of leaf explants with $Agrobacterium$ for 10 days and induction of shoots. All kanamycin resistant plants investigated with genomic PCR analysis carried the report gene, $AtSICKLE$, in their genome. Although expression levels of the report gene in the transgenic plants investigated with RT-PCR were relatively low because of inefficiency of CaMV 35S promoter in chrysanthemum, transgenic lines expressing $AtSICKLE$ efficiently showed leaf epinasty phenotype. We expect that our results will provide a useful method that can perform a high-throughput investigation of genes isolated and studied well in model plants for molecular breeding of chrysanthemum.
'Moulinrouge' was selected as the best regenerating cultivar among 18 different spray-type chrysanthemum cultivars bred in the Gyeongnam Flowers Breeding Research Institute. When the leaf explants from standard- and spray-type chrysanthemum 'Jinba' and 'Moulinrouge' were incubated on MS basal medium supplemented with $0.5mg{\cdot}L^{-1}$ BA and $1.0mg{\cdot}L^{-1}$ NAA, both 'Jinba' and 'Moulinrouge' induced adventitious shoots that can be regenerated into plantlets. Based on these regeneration conditions, we developed an efficient $Agrobacterium$-mediated chrysanthemum 'Moulinrouge' transformation method by using sequential selection of shoots from low ($10mg{\cdot}L^{-1}$) to high ($30mg{\cdot}L^{-1}$) concentrations of kanamycin after co-cultivation of leaf explants with $Agrobacterium$ for 10 days and induction of shoots. All kanamycin resistant plants investigated with genomic PCR analysis carried the report gene, $AtSICKLE$, in their genome. Although expression levels of the report gene in the transgenic plants investigated with RT-PCR were relatively low because of inefficiency of CaMV 35S promoter in chrysanthemum, transgenic lines expressing $AtSICKLE$ efficiently showed leaf epinasty phenotype. We expect that our results will provide a useful method that can perform a high-throughput investigation of genes isolated and studied well in model plants for molecular breeding of chrysanthemum.
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문제 정의
특히 국화는 품종에 따라서 매우 다양한 재분화 능력을 보이기 때문에 품종에 따른 맞춤형 조직배양 조건을 이용하고 있다(Lee 등, 2008; Park 등, 2007). 본 연구는 국내에서 개발 육성된 우수품종을 이용한 분자육종법을 확립하기 위해서 필요한 재분화 능력이 탁월한 품종을 선별하기 위해서 경남 화훼연구소에서 교배 육성한 스프레이형 국화 18 품종에 대한 재분화 능력을 조사하였다. 특히 스탠다드형과 스프레이형 국화 모두에 일반적으로 적용이 가능한 재분화 방법과 형질전환 방법을 확립하기 위해서 스탠다드형 국화인 신마의 신초유도가 양호한 BA(0.
본 연구에서는 국내에서 교배육종 방법으로 개발된 다양한 스프레이형 국화품종들에 대한 재분화 능력을 조사하고 그 중에서 재분화 능력이 탁월한 무랑루즈를 선별하고 아그로박테리움을 이용한 무랑루즈의 효율적인 형질전환법을 확립하였다. 또한 확립한 형질전환 방법을 이용하여서 애기장대에서 분리된 AtSICKE 유전자를 ‘무랑루즈’ 국화에 도입하고 발현시킴으로써 새로운 엽형의 변화를 성공적으로 유도하였다.
제안 방법
식물체의 유지 및 증식을 위해서 2-3장의 잎을 포함한 신초 선단 부위를 절단하고 MS 고체배지에 삽목으로 배양하였다. 5주 간격으로 계대배양하면서 재료를 채취하였다. 발근한 국화 유식물체는 혼합상토(흥농종묘의 바이오프러그 상토 2호와 부농의 수도용 상토의 2:1 혼합)가 담긴 직경 10cm 화분에 정식하고 장일조건의 생장실에서 배양하였다.
식물체 내에서 항상 일정하게 발현되는 국화의 ACTIN1 유전자를 특이적으로 증폭하는 forward primer (5’CTCTCACAATTTCCCGTTCA3’)와 reverse primer(5’AC ATGCTATCTTGCGTTTGG3’)를 이용하여 각 RNA의 상대적인 동량을 조정하였다(Ohmiya 등, 2006). Genomic PCR에서 사용하였던 전이유전자 검출용 primer 조합을 이용하여 선별한 형질전환체에서 애기장대 유래의 AtSICKlE의 발현량을 확인하였다.
형질전환체의 표현형은 도입된 전이유전자의 발현 정도에 의해서 크게 영향을 받으므로 genomic-PCR를 통해서 확인된 30계통의 형질전환체들 중에서 15계통에 대해서 전이 유전자로 사용된 애기장대의 AtSICKLE 유전자의 발현량을 조사하였다. genomic-PCR에서 그 특이성이 확인된 동일한 primer 조합을 이용하였고 RNA의 상대적 양을 보정하기 위해서 항상 일정하게 발현하는 국화의 ACTIN1 유전자를 참고 유전자로 사용하였다. 조사된 15개의 형질전환체 중에서 5개에서 도입된 애기장대 AtSICKLE 유전자의 발현이 확인되었다.
최종 선별된 국화품종 ‘무랑루즈’의 형질전환은 무균상으로 배양된 개체의 잎을 1cm2으로 잘라내어 신초재분화 배지에 치상하고 준비된 아그로박테리움 용액 100μl씩 절편체에 떨어뜨리고 건조시킨 후 10일간 함께 배양하였다. 감염된 절편 체는 kanamycin(10mg･L-1)과 carbenicillin(200mg･L-1)가 함유된 신초재분화 배지로 옮겨서 4주간 배양하면서 kanamycin 에 저항성이 있는 신초를 선별하고 단계별로 kanamycin 농도를 높이면서 신초의 생장 및 발근을 유도함으로써 국화 형질전환체를 제작하였다. 감염용 아그로박테리움 용액의 제조 과정은 다음과 같았다.
) Kitamura) 18 품종(5 품종은 등록, 12 품종은 미등록 상태: SO4-GA, SO4-NA, SO4-DA, SO4-Ma1, SO4-Ma2, SO4-Ma4, SO4-Ma7, SO4-MA8, SO4-172, SO4-181, ‘워터포그’, ‘무랑루즈’, ‘핑키’, ‘세라피나’, SO4-227, SO4-239, ‘아이볼’, SO4-378)과 일본에서 개발된 스탠다드형 국화인 ‘신마’를 사용하였다. 국화의기내배양은 70% 에탄올과 2% 차아염소산나트륨(NaOCl)으로 각각 30초 및 10분씩 표면 살균하고 멸균수로 5회 세척한 신초 선단부를 MS 고체배지(4.5g･L-1 MS medium, 30g･L-1 sucrose, pH 5.8, 0.3% gellan gum)에 치상하여 장일조건의 식물배양상(16h light/8h dark, 25℃)에서 배양하였다. 식물체의 유지 및 증식을 위해서 2-3장의 잎을 포함한 신초 선단 부위를 절단하고 MS 고체배지에 삽목으로 배양하였다.
기내 배양환경은 온도 25℃, 일장주기는 16/8 시간(명/암), 그리고 광도는 30µmol･m-2･sec-1 형광등으로 조명을 유지하면서 실험을 수행하였다.
기내에서 무균 배양한 스탠다드 및 스프레이 국화의 잎 절편체에서 신초의 재분화는 MS 기본배지에 0.5mg･L-1 NAA와 1.0mg･L-1 BA가 첨가된 신초재분화 배지를 사용하였다. 기내 배양환경은 온도 25℃, 일장주기는 16/8 시간(명/암), 그리고 광도는 30µmol･m-2･sec-1 형광등으로 조명을 유지하면서 실험을 수행하였다.
또한 무랑루즈와 같이, 캘러스 과정을 거치지 않고 직접 기관이 형성되는 경우에는 절편체의 상처받지 않은 부위에서 신초 형성이 이루어지고 있기 때문에 재생된 신초들 중에서 상당수가 유전자가 도입되지 않은 비형질전환체로 저농도의 kanamycin 선별배지에서 재생될 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서도 비형질전환체의 재분화율을 줄이고 형질전환체의 선별율을 향상시키기 위해서 1차로 kanamycin 10mg･L-1가 포함된 신초재분화 배지에서 선별된 항생제 저항성 신초들을 kanamycin 30mg･L-1이 함유된 MS 배지에 옮겨서 신초의 생장 및 뿌리발달을 유도하였다(Fig. 2D, E, F). 이렇게 kanamycin 농도를 단계별로 강화한 조건에서 선별한 kanamycin 저항성 국화 형질전환체들 중에서 애기장대 유래의 전이유전자 AtSICKLE가 안정적으로 삽입되어 있는 형질전환체를 확인하기 위해서 단계별 연속 선발배지에서 최종 선별된 독립된 30계통의 형질전환체로부터 DNA를 추출하고 도입된 AtSICKLE 유전자을 특이적 증폭하기 위해서 AtSICKLE 유전자 특이적 forward primer과 벡터의 3’ UTR 영역에 특이적인 reverse primer 조합을 이용하여서 박테리아로부터 전이된 애기장대의 AtSICKLE 유전자가 국화 유전체에 삽입되어 있는 국화 형질전환체를 조사하였다(Fig.
또한 이 조건에서 스탠다드형과 스프레이형 국화들간의 재분화 효율을 비교하기 위해서 조사대상 품종에 ‘신마’를 포함시켜서 대조구로 사용하였다.
또한 확립한 형질전환 방법을 이용하여서 애기장대에서 분리된 AtSICKE 유전자를 ‘무랑루즈’ 국화에 도입하고 발현시킴으로써 새로운 엽형의 변화를 성공적으로 유도하였다.
3% gellan gum)에 치상하여 장일조건의 식물배양상(16h light/8h dark, 25℃)에서 배양하였다. 식물체의 유지 및 증식을 위해서 2-3장의 잎을 포함한 신초 선단 부위를 절단하고 MS 고체배지에 삽목으로 배양하였다. 5주 간격으로 계대배양하면서 재료를 채취하였다.
이렇게 kanamycin 농도를 단계별로 강화한 조건에서 선별한 kanamycin 저항성 국화 형질전환체들 중에서 애기장대 유래의 전이유전자 AtSICKLE가 안정적으로 삽입되어 있는 형질전환체를 확인하기 위해서 단계별 연속 선발배지에서 최종 선별된 독립된 30계통의 형질전환체로부터 DNA를 추출하고 도입된 AtSICKLE 유전자을 특이적 증폭하기 위해서 AtSICKLE 유전자 특이적 forward primer과 벡터의 3’ UTR 영역에 특이적인 reverse primer 조합을 이용하여서 박테리아로부터 전이된 애기장대의 AtSICKLE 유전자가 국화 유전체에 삽입되어 있는 국화 형질전환체를 조사하였다(Fig. 3A).
재분화 능력이 우수한 국화 품종으로 선별된 무랑루즈에 아그로박테리움을 매개로 하는 형질전환 방법을 확립하기 위해서 ‘무랑루즈’의 잎 절편체와 애기장대의 분화발달에 관여하는 새로운 전사조절 유전자인 AtSICLKE(At5g35770)유전자(Byzova 등, 1999)를 CaMV의 35S 프로모터로 과발현하도록 제작된 binary vector를 가진 A. tumefaciens EHA105를 공동배양한 후, 저농도의 kanamycin(10mg･L-1)을 함유하고 있는 신초재분화 선발배지에서 배양하였을 때 모든 잎 절편 체에서 다수의 kanamycin 저항성 신초를 형성하였다(Fig. 2A, B, C).
최종 선별된 국화품종 ‘무랑루즈’의 형질전환은 무균상으로 배양된 개체의 잎을 1cm2으로 잘라내어 신초재분화 배지에 치상하고 준비된 아그로박테리움 용액 100μl씩 절편체에 떨어뜨리고 건조시킨 후 10일간 함께 배양하였다.
본 연구는 국내에서 개발 육성된 우수품종을 이용한 분자육종법을 확립하기 위해서 필요한 재분화 능력이 탁월한 품종을 선별하기 위해서 경남 화훼연구소에서 교배 육성한 스프레이형 국화 18 품종에 대한 재분화 능력을 조사하였다. 특히 스탠다드형과 스프레이형 국화 모두에 일반적으로 적용이 가능한 재분화 방법과 형질전환 방법을 확립하기 위해서 스탠다드형 국화인 신마의 신초유도가 양호한 BA(0.5mg･L-1)와 NAA(1.0mg･L-1)를 조합한 MS 배지조건을 기본배지로 사용하여서 스프레이형 품종들의 재분화 능력을 조사하였다(Lee 등, 2008). 또한 이 조건에서 스탠다드형과 스프레이형 국화들간의 재분화 효율을 비교하기 위해서 조사대상 품종에 ‘신마’를 포함시켜서 대조구로 사용하였다.
형질전환체의 RNA는 TrizolTM(Invitrogen)을 이용해서 분리하고, 10μg의 RNA당 10 units DNase 처리를 한 후, 각 1μg의 RNA를 주형으로 SuperscriptTM III One-step RT/Platinum@ Taq Mix(Invitrogen)를 사용하여 RT-PCR을 수행했다.
형질전환체의 genomic DNA는 2x CTAB extraction buffer를 이용해서 분리하고 AtSICKLE 유전자 특이적 forward primer(5’TTGCACCACGTGGCACGCTGTCTCTC3’)과벡터의 3’ UTR 영역 특이적인 reverse primer(5’TTAAAGC AGGGCATGCCTGC3’) 조합을 이용해서 genomic PCR을 수행하였다.
형질전환체의 표현형은 도입된 전이유전자의 발현 정도에 의해서 크게 영향을 받으므로 genomic-PCR를 통해서 확인된 30계통의 형질전환체들 중에서 15계통에 대해서 전이 유전자로 사용된 애기장대의 AtSICKLE 유전자의 발현량을 조사하였다. genomic-PCR에서 그 특이성이 확인된 동일한 primer 조합을 이용하였고 RNA의 상대적 양을 보정하기 위해서 항상 일정하게 발현하는 국화의 ACTIN1 유전자를 참고 유전자로 사용하였다.
대상 데이터
본 연구에서는 경남화훼연구소에서 개발된 스프레이형 국화(Dendranthema gradiflora (Ramat.) Kitamura) 18 품종(5 품종은 등록, 12 품종은 미등록 상태: SO4-GA, SO4-NA, SO4-DA, SO4-Ma1, SO4-Ma2, SO4-Ma4, SO4-Ma7, SO4-MA8, SO4-172, SO4-181, ‘워터포그’, ‘무랑루즈’, ‘핑키’, ‘세라피나’, SO4-227, SO4-239, ‘아이볼’, SO4-378)과 일본에서 개발된 스탠다드형 국화인 ‘신마’를 사용하였다.
감염용 아그로박테리움 용액의 제조 과정은 다음과 같았다. 재조합된 식물 형질전환용 binary vector를 함유하고 있는 A. tumefaciens EHA105은 항생제가 함유된 YEP 배지(10g･L-1 Bacto Peptone, 5g･L-1 NaCl, 10g･L-1 Yeast Extract)에서 24시간 동안 배양하고 원심분리로 집균하고 0.9% NaCl로 3번 세척하고 O.D600=1.0-2.0의 농도로 현탁해서 사용하였다.
데이터처리
각 국화 품종 별로 8개의 절편체를 사용하였으며 대조구로 사용한 신마의 재분화율과 각 품종들간의 차이는 student t test을 이용하여 조사하였다(P<0.05).
이론/모형
이러한 신초재분화 조건에서 ‘무랑루즈’잎 절편에 아그로박테리움을 감염하고 10일 동안 함께 배양한 후에, 선발항생제 kanamycin 농도를 저농도(10mg･L-1)에서 고농도(30mg･L-1)로 단계적으로 선발과정을 강화함으로써 효율적인 국화 형질전환체 제작이 가능하였다. 조사한 kanamycin 저항성 식물체 모두에서 전이유전자 AtSICKLE가 존재함을 genomic PCR 방법으로 확인하였다. 비록, 국화에서 그 기능이 비효율적인 CaMV 35S 프로모터를 사용했기 때문에 RT-PCR로 확인한 형질전환체에서의 전이유전자 AtSICKLE의 발현율은 상대적으로 낮았으나, 그 발현이 상대적으로 높은 개체에선 잎의 상편생장에 의한 엽형의 변화가 나타났다.
성능/효과
본 연구는 경남 화훼연구소에서 개발 육성된 스프레이형 국화 18 품종들에 대한 재분화율을 각각 조사하고, 그 중에서 ‘무랑루즈’가 가장 우수한 재분화 능력이 있음을 확인하였다.
조사한 kanamycin 저항성 식물체 모두에서 전이유전자 AtSICKLE가 존재함을 genomic PCR 방법으로 확인하였다. 비록, 국화에서 그 기능이 비효율적인 CaMV 35S 프로모터를 사용했기 때문에 RT-PCR로 확인한 형질전환체에서의 전이유전자 AtSICKLE의 발현율은 상대적으로 낮았으나, 그 발현이 상대적으로 높은 개체에선 잎의 상편생장에 의한 엽형의 변화가 나타났다. 이러한 연구의 결과는 모델 식물체에서 분리되고 연구된 많은 유전자들이 가지는 화훼작물의 분자육종학적 가치를 국화에서 대량으로 조사할 수 있는 기반을 제공 할 것으로 기대된다.
애기장대에서 꽃 기관 형성에 관여하는 것으로 보고된 AtSICKLE 유전자를 CaMV의 35S 프로모터를 이용하여서 애기장대에 과발현되면 잎의 세포분열이 촉진되고 이때 윗면의 분열속도가 아랫면 보다 빨라서 잎이 아래쪽으로 굽는 epinasty 표현형이 나타남을 확인하였다(자료 미제시). 도입된 애기장대의 AtSICKLE 유전자의 발현량에 비례해서 애기장대에서 나타나는 표현형과 유사하게 국화 잎이 커지면서 아래쪽으로 말리는 표현형을 보였다(Fig.
genomic-PCR에서 그 특이성이 확인된 동일한 primer 조합을 이용하였고 RNA의 상대적 양을 보정하기 위해서 항상 일정하게 발현하는 국화의 ACTIN1 유전자를 참고 유전자로 사용하였다. 조사된 15개의 형질전환체 중에서 5개에서 도입된 애기장대 AtSICKLE 유전자의 발현이 확인되었다. 특히 3번 형질전환체에서는 AtSICKLE 유전자가 상대적으로 매우 높게 발현되었다(Fig.
3A). 조사된 독립된 30계통의 국화 형질전환체 모두에서 예상되는 350bp의 도입된 AtSICKLE 유전자 영역이 특이적으로 증폭됨으로써 AtSICKLE 유전자가 국화 유전체에 안정적으로 삽입되어 있음을 확인하였다(Fig. 3B). 이러한 효율적인 국화 형질전환율은 ‘무랑루즈’의 우수한 재분화 능력과 단계별 선별 강도를 강화함으로써 재분화된 비형질전환체를 단계별로 제거한 결과로 생각된다.
조사한 18품종의 스프레이형 국화 품종들 중에서 ‘무랑루즈’ 품종만이 ‘신마’에 비해서 3배 이상의 높은 재분화율을 보였고 SO4-MA1과 SO4-MA2는 신마와 비슷한 재분화율을 보였다.
특히 BA(0.5mg･L-1)와 NAA(1.0mg･L-1)를 함유한 MS 배지를 신초재분화 배지로 이용함으로써 스탠다드형 국화인 신마와 함께 스프레이형 국화인 ‘무랑루즈’의 잎 절편체부터 효율적으로 신초 형성을 유도하고 완전한 식물체로 재분화시킬 수 있었다.
후속연구
최근엔 이러한 문제를 해결하기 위해서 kanamycin 농도를 단계별로 증가시키면서 연속적으로 선별하는 방법이 성공적으로 이용되고 있다(Han 등, 2008). 또한 무랑루즈와 같이, 캘러스 과정을 거치지 않고 직접 기관이 형성되는 경우에는 절편체의 상처받지 않은 부위에서 신초 형성이 이루어지고 있기 때문에 재생된 신초들 중에서 상당수가 유전자가 도입되지 않은 비형질전환체로 저농도의 kanamycin 선별배지에서 재생될 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서도 비형질전환체의 재분화율을 줄이고 형질전환체의 선별율을 향상시키기 위해서 1차로 kanamycin 10mg･L-1가 포함된 신초재분화 배지에서 선별된 항생제 저항성 신초들을 kanamycin 30mg･L-1이 함유된 MS 배지에 옮겨서 신초의 생장 및 뿌리발달을 유도하였다(Fig.
이러한 결과는 애기장대의 AtSICKLE 유전자와 국화의 SICKLE 유전자는 진화적으로 매우 가까우며 그 기능 또한 그대로 보존되어 있음을 의미한다. 또한 지금까지 애기장대, 벼 등의 다양한 식물체들에서 분리되었고 화훼학적으로 응용성이 있는 많은 유전자들을 국화에 과발현 또는 조직 특이적으로 발현시킴으로써 고부가가치의 국화 신품종의 개발을 촉진할 수 있을 것이다.
본 연구에서 확립한 스프레이 국화인 ‘무랑루즈’의 효율적인 형질전환 방법은 이미 분리되고 잘 연구된 다양한 유전자들을 국화에 응용하는 연구에 매우 유용할 뿐만 아니라, 애기장대에서 그 응용성이 검정된 activation tagging vector를 이용해서 국화의 모든 유전자들이 무작위로 활성화된 국화의 activation tagging 집단을 제조하여 새로운 유용형질의 도입 및 국화의 유용 유전자 분리 연구에 매우 유용할 것으로 생각된다.
비록, 국화에서 그 기능이 비효율적인 CaMV 35S 프로모터를 사용했기 때문에 RT-PCR로 확인한 형질전환체에서의 전이유전자 AtSICKLE의 발현율은 상대적으로 낮았으나, 그 발현이 상대적으로 높은 개체에선 잎의 상편생장에 의한 엽형의 변화가 나타났다. 이러한 연구의 결과는 모델 식물체에서 분리되고 연구된 많은 유전자들이 가지는 화훼작물의 분자육종학적 가치를 국화에서 대량으로 조사할 수 있는 기반을 제공 할 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국화 형질전환체들의 제작 사례는 무엇인가?
최근엔 조직배양학적 방법을 기반으로 하는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법들이 다양한 국화품종에서 개발되었다(Teixeira da Silva 등, 2006). 특히 화색조절(Ohmiya 등, 2006; Seo 등, 2007), 개화조절(Han 등, 2008), 노화지연(Narumi 등, 2005; Satoh 등, 2008), 무측지성(Han 등, 2007), 병해충저항성(Soh 등, 2009; Takatsu 등, 1999) 등과 같은 농업적으로 중요한 형질들과 관련한 유용 유전자들을 이용한 성공적인 국화 형질전환체들의 제작 사례들이 보고되었다. 그러나 아직 상대적으로 낮은 형질전환율은 국화에서 대단위의 유전자 기능분석을 통한 분자육종법의 개발을 어렵게 하고 있다.
아그로박테리움을 이용한 국화형질전환 방법에서 식물생장조절제의 농도 및 비율이 다양한 이유는 무엇인가?
지금까지 아그로박테리움을 매개로 하는 형질전환 방법이 먼저 확립된 많은 화훼 작물들의 경우와 같이, 국화의 형질전환을 위한 선결조건인 조직배양 조건을 확립하기 위해서 다양한 국화 품종들의 절편체로부터 완전한 식물체의 재생을 위한 기본배지 및 식물생장조절제의 농도와 비율에 대한 많은 연구들이 성공적으로 선행되었다(Lee 등, 2008). 재분화 식물체를 유도하기 위해서 국화 품종에 따라서 잎, 줄기, 꽃잎 등의 다양한 절편체가 사용되었고 이때 사용된 식물생장조절제의 농도 및 비율의 다양함은 국화 품종들 간에 뚜렷한 재분화 능력의 차이가 품종 별 배양조직의 식물생장조절제에 대한 반응의 차이에 기인함을 의미한다. 일반적으로 잎 절편체를 이용해서 신초를 재생하는 조직배양 방법이 많이 이용되고 있다.
국화 품종의 교배육종방법과 방사능 조사와 같은 돌연변이 유도 방법은 어떤 단점을 가지고 있는가?
지금까지 다양한 특성을 가진 많은 국화 품종들이 전통적인 교배육종방법과 방사능 조사와 같은 돌연변이 유도 방법 등을 통해서 개발되어왔다(Park 등, 2007). 그러나 유전자 풀의 한계와 배수성 차이에 의한 불친화성 등의 분류학적 장벽을 극복하기 어렵다는 단점들로 인해서 최근엔 분자유전학적 형질전환 방법을 이용한 새로운 유용 유전자를 가진 형질전환체 개발 방법이 새로운 대안으로 제시되고 있다(Teixeira da Silva, 2003). 특히 아그로박테리움을 이용한 국화형질전환 방법은 그 효율성과 간편함으로 인해서 가장 일반적으로 이용되고 있다.
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