생쥐 배아의 유리화 동결에 동결액의 조성과 냉각속도의 영향 Effect on Survival and Developmental Competence of Vitrified Mouse Embryos Using Various Cryoprotectants and Cooling Speeds원문보기
목적: 유리화 동결액의 조성조절과 냉각속도 증진을 통한 동결보호제의 농도를 낮추는 전략을 통해 세포에 미치는 독성을 감소시켜 유리화 동결 및 융해 후 생쥐 배아의 생존율 및 발생률을 증진시키고, 궁극적으로 배아의 유리화 동결법을 개선하고자 하였다. 연구방법: 생쥐 배아와 포배기를 그리드를 이용한 유리화 동결법을 이용하여 동결/융해하였다. 동결액 내 ethylene glycol와 dimethylsulphoxide (DMSO)의 농도와 당의 농도를 조절하여 생쥐 배아의 융해 후 생존율과 발생률을 관찰하였고, 냉각속도의 증가와 동결억제제의 농도와의 상관관계를 포배기의 융해 후 생존율과 발생률에 따라 비교하였다. 또한 융해 후 배아를 대리모에 이식하여 산자를 생산함으로 냉각속도의 효율성을 알아보았다. 결과: EG를 단독으로 사용한 동결보존액 보다는 DMSO와 혼합된 동결보존액의 사용이 보다 유리하다는 결과를 얻을 수 있었다. 슬러시 질소에 의한 냉각속도의 증가가 동결보존의 대상의 상해를 줄여 유리화 동결의 효율성을 증진시키는 것으로 생각된다. 결론: 혼합된 동결보호제를 사용하였을 때 생쥐 배아의 유리화 동결 후 생존과 발생률이 증진되었다. 슬러시 질소를 이용한 유리화 동결의 도입은 냉각속도의 증가를 통해 기존 유리화 동결방법의 효율을 증진시켜 생존율과 융해후 발생률, 임신율 증진에 기여하였다. 또한 냉각속도의 증진은 유리화 동결의 필수요건인 고농도의 동결억제제에 대한 노출을 감소시킬 수 있었다. 이러한 노력은 생식력의 보전을 위한 유리화 동결법의 효율 향상에 기여할 것이다.
목적: 유리화 동결액의 조성조절과 냉각속도 증진을 통한 동결보호제의 농도를 낮추는 전략을 통해 세포에 미치는 독성을 감소시켜 유리화 동결 및 융해 후 생쥐 배아의 생존율 및 발생률을 증진시키고, 궁극적으로 배아의 유리화 동결법을 개선하고자 하였다. 연구방법: 생쥐 배아와 포배기를 그리드를 이용한 유리화 동결법을 이용하여 동결/융해하였다. 동결액 내 ethylene glycol와 dimethylsulphoxide (DMSO)의 농도와 당의 농도를 조절하여 생쥐 배아의 융해 후 생존율과 발생률을 관찰하였고, 냉각속도의 증가와 동결억제제의 농도와의 상관관계를 포배기의 융해 후 생존율과 발생률에 따라 비교하였다. 또한 융해 후 배아를 대리모에 이식하여 산자를 생산함으로 냉각속도의 효율성을 알아보았다. 결과: EG를 단독으로 사용한 동결보존액 보다는 DMSO와 혼합된 동결보존액의 사용이 보다 유리하다는 결과를 얻을 수 있었다. 슬러시 질소에 의한 냉각속도의 증가가 동결보존의 대상의 상해를 줄여 유리화 동결의 효율성을 증진시키는 것으로 생각된다. 결론: 혼합된 동결보호제를 사용하였을 때 생쥐 배아의 유리화 동결 후 생존과 발생률이 증진되었다. 슬러시 질소를 이용한 유리화 동결의 도입은 냉각속도의 증가를 통해 기존 유리화 동결방법의 효율을 증진시켜 생존율과 융해후 발생률, 임신율 증진에 기여하였다. 또한 냉각속도의 증진은 유리화 동결의 필수요건인 고농도의 동결억제제에 대한 노출을 감소시킬 수 있었다. 이러한 노력은 생식력의 보전을 위한 유리화 동결법의 효율 향상에 기여할 것이다.
Objective: Vitrification requires a high concentration of cyroprotectant (CPA) and an elevated cooling speed to avoid ice crystal formation. We have evaluated the effect of different combinations of cooling rate and CPA on embryonic integrity (developmental competence) in order to increase the effic...
Objective: Vitrification requires a high concentration of cyroprotectant (CPA) and an elevated cooling speed to avoid ice crystal formation. We have evaluated the effect of different combinations of cooling rate and CPA on embryonic integrity (developmental competence) in order to increase the efficiency of vitrification without impairing embryo viabilit. We hypothesized that the combination of CPA or the increase of cooling rates can reduce the concentration of toxic CPA for vitrification. As consequently, we performed experiments to evaluate the effect of various composition of CPA or slush nitrogen ($SN_2$) on the mouse embryonic development following vitrification using low CPA concentration. Methods: Vitrification of mouse embryos was performed with EM grid using liquid nitrogen ($LN_2$) or $SN_2$ and different composition of CPAs, ethylene glycol (EG) and dimethylsulfoxide (DMSO). After vitrification-warming process, their survival and blastocyst formation rates were examined. For analyzing long-term effect, these blastocysts were transferred into the uterus of foster mothers. Results: Survival and blastocyst formation rates of vitrified embryos were higher in EG+DMSO group than those in EG only. Furthermor, the group using $SN_2$ with a lower CPA concentration showed a higher survival of embryos and developmental rates than group using $LN_2$. Conclusion: The combination of EG and DMSO as CPAs may enhance the survival of mouse embryos and further embryonic development after vitrification. $SN_2$ can generate high survival and developmental rate of vitrified/warmed mouse embryos when a lower concentration of CPA was applied. Therefore, these systems may contribute in the improvement of cryopreservation for fertility preservation.
Objective: Vitrification requires a high concentration of cyroprotectant (CPA) and an elevated cooling speed to avoid ice crystal formation. We have evaluated the effect of different combinations of cooling rate and CPA on embryonic integrity (developmental competence) in order to increase the efficiency of vitrification without impairing embryo viabilit. We hypothesized that the combination of CPA or the increase of cooling rates can reduce the concentration of toxic CPA for vitrification. As consequently, we performed experiments to evaluate the effect of various composition of CPA or slush nitrogen ($SN_2$) on the mouse embryonic development following vitrification using low CPA concentration. Methods: Vitrification of mouse embryos was performed with EM grid using liquid nitrogen ($LN_2$) or $SN_2$ and different composition of CPAs, ethylene glycol (EG) and dimethylsulfoxide (DMSO). After vitrification-warming process, their survival and blastocyst formation rates were examined. For analyzing long-term effect, these blastocysts were transferred into the uterus of foster mothers. Results: Survival and blastocyst formation rates of vitrified embryos were higher in EG+DMSO group than those in EG only. Furthermor, the group using $SN_2$ with a lower CPA concentration showed a higher survival of embryos and developmental rates than group using $LN_2$. Conclusion: The combination of EG and DMSO as CPAs may enhance the survival of mouse embryos and further embryonic development after vitrification. $SN_2$ can generate high survival and developmental rate of vitrified/warmed mouse embryos when a lower concentration of CPA was applied. Therefore, these systems may contribute in the improvement of cryopreservation for fertility preservation.
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문제 정의
하지만 최근 확산속도가 느린 DMSO와 EG와의 혼합된 동결억제제를 사용했을 때 동물뿐 만 아니라 인간 난자와 배아의 동결보존에서 그 효과가 뛰어나다는 보고가 있다. 30~33 따라서 본 연구에서는 혼합 동결 억제제의 이용에서 DMSO의 효용성과 적정농도를 확인하고자 하였다. 본 연구를 통해서 생쥐 배아와 포배기의 유리화 동결에서는 EG 단독의 동결억제제의 사용보다는 EG와 DMSO가 혼합된 동결보존 액을 사용할 경우 생존율과 배아 발생률이 보다 높다는 결과를 얻었다 (Tables 2, 3).
또한 이에 더불어 기존에 개선된 냉각속도에 따른 동결 억제제의 농도조정의 가능성도 대두되고 있다. 따라서 본 연구에서는 유리화 동결을 위한 동결억제제의 조성조절과 동결속도의 조절에 의한 동결억 제제의 농도조절이 배아의 유리화 동결-융해 후 생존율 또는 발생률에 미치는 영향을 비교하였다. 이러한 연구 결과를 통해 유리화 동결 시 동결억제제 조성의 개선과 냉각속도의 개선을 통한 동결억 제제의 농도감소를 통한 효율증진의 가능성을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 혼합 동결억제제의 이용에서 DMSO의 효용성을 확인할 뿐만 아니라 냉각속도의 증진을 통한 이 혼합 동결억제제의 농도감소의 가능성을 확인하고자 하였다. 본 연구의 선행 연구에서 난할 중 배아는 EG의 경우 4.
생쥐 배아의 유리화 동결 시 동결속도의 변화에 따른 유리화 동결액의 농도조절 가능성을 확인하기 위해서 연구를 진행하였다. 전 평형된 포배기 배아를 각각 1.
제안 방법
Louis, MO, USA)를 복강 주사하고, 48시간 후에 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG, Sigma-Aldrich)을 복강주사한 뒤 8주령 수컷과 교미시켰다. 13~15시간 후 질전이 확인된 암컷만을 선별해 분리하였고, hCG 주사 후 44~48 시간 후에 경추 탈골로 도살한 후 난관을 채취하여 modified human tubal medium (HTF, Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) 내에서 난관의 팽대부를 통한 관류법으로 2-세포기 배아를 회수하였다. 회수 된 배아는 10% synthetic serum substitute (SSS, Irvine Scientific)가 첨가된 preimplantation-1 (P-1, Irvine Scientific) 배양액에서 6~8-세포기까지 배양한 후 실험에 사용하였다.
대리모로 사용될 생쥐는 사육하고 있는 발정 전기의 ICR 마우스 암컷을 선별 후 이를 정관 결찰한 생쥐와 교배시켜 그 다음날 질전을 확인하였다. 2.5 dpc (days of post coital)의 준비된 대리모 생쥐에 해리성 마취제인 케타민 (Ketamine, Huons, Seoul, Korea)과 근육 이완 작용 및 진정에 좋은 약제인 럼픈 (Rompun, Bayer Animal Health Co., Ansan, Korea) 을 1:2의 비율로 섞은 마취제를 생쥐 체중을 기준 으로 0.002 mg/g의 농도로 복강 내에 주사하여 전신마취를 실시하였다. 마취된 생쥐의 등 쪽에 털을 제거한 후 약 1 cm 정도 절개한 다음 절개 부위를 통해 좌측 난소의 방향으로 피부와 근육층을 분리 하였다.
37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하면서 상태를 관찰 건강한 상태의 배아만을 선별하여 이식하였다. 대리모로 사용될 생쥐는 사육하고 있는 발정 전기의 ICR 마우스 암컷을 선별 후 이를 정관 결찰한 생쥐와 교배시켜 그 다음날 질전을 확인하였다.
EG+DMSO 혼합동결액의 개선을 위해 DMSO의 농도를 고정하고 EG의 농도를 조정하였다. 전 평형된 배아를 5.
마지막으로 배양액으로 2~3회 세척한 다음 배양액이 들어있는 배양접시로 옮겨 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그리고 유리화 동결 시 0.5 M의 sucrose를 이용했을 경우는 융해과정은 0.5 M, 0.25 M, 0.125 M, 0 M sucrose 용액에 2.5분씩 순차적으로 진행하였다. 융해 후 48~72시간 동안 배양을 실시하여 24시간 단위로 해부현미경 관찰을 통해 배아의 생존율, 발달률 및 부화율을 관찰하였고, 생존율, 발달률 및 부화율은 백분율로 평가하였다.
배양기에서 배양하면서 상태를 관찰 건강한 상태의 배아만을 선별하여 이식하였다. 대리모로 사용될 생쥐는 사육하고 있는 발정 전기의 ICR 마우스 암컷을 선별 후 이를 정관 결찰한 생쥐와 교배시켜 그 다음날 질전을 확인하였다. 2.
이후 미리 준비되어 LN2에 침지함으로서 유리화 동결을 완료하였다. 또한 모든 실험은 3회 이상의 반복실험을 하였다.
또한 이 선행 연구에서 포배기의 경우 보다 낮은 농도의 CPA를 사용한 동결액의 개발이 가능할 것으로 여겨져 농도조절 연구에서는 포배기에 우선적으로 적용하여 진행하였다 (Table 5, Figure 1).
002 mg/g의 농도로 복강 내에 주사하여 전신마취를 실시하였다. 마취된 생쥐의 등 쪽에 털을 제거한 후 약 1 cm 정도 절개한 다음 절개 부위를 통해 좌측 난소의 방향으로 피부와 근육층을 분리 하였다. 혈관을 피해 근육층을 절개한 다음, 난소, 난관, 자궁을 노출시킨 후 고정하고 해부현미경 아래에서 이식을 시행하였다.
생쥐 배아의 유리화 동결 시 가장 효과적인 유리 화 동결액을 선정하기 위하여 전 평형된 6~8-세포기 배아를 5.5 M EG만을 이용해 평형 후 LN2에 침지, 5.5 M EG만을 이용해 평형 후 SN2에 침지, 2.7 M EG+15% DMSO의 혼합액을 이용한 평형 후 LN2에 침지, 2.7 M EG+15% DMSO의 혼합액을 이용한 평형 후 SN2에 각각 침지하였다. 결과는 Table 2에 기술한 바와 같다.
생쥐 배아의 유리화 동결 시 동결속도의 변화에 따른 유리화 동결액의 농도조절 가능성을 재확인 하기위해 유리화 동결 후 융해된 각 그룹의 포배기 배아를 생쥐 대리모에 이식하고, 산자를 확인하였다. 이식 후 산자의 수는 대조군에서 53.
생쥐 배아의 유리화 동결액에서 적절한 sucrose 의 농도를 알기 위해 전 평형 처리된 배아를 각각 3.5 M EG+15% DMSO+1.0 M sucrose와 2.5 MEG+15% DMSO+1.0 M sucrose, 3.5 M EG+15% DMSO+0.5 M sucrose, 2.5 M EG+15% DMSO+0.5 M sucrose의 혼합액을 이용하여 평형한 후 각각 LN2 에 침지하였고, 그 결과를 Table 4에 기술하였다. 각 유리화 동결액에 따른 유리화 동결과 융해 후에 생존율은 대조군의 경우 99.
혈관을 피해 근육층을 절개한 다음, 난소, 난관, 자궁을 노출시킨 후 고정하고 해부현미경 아래에서 이식을 시행하였다. 우선 자궁을 찾아 놓고, 여기에 29 G 주사기로 자궁에 구멍을 뚫은 다음 준비된 이식용 파이펫의 끝을 삽입하여 극미량의 배양액과 함께 발달된 배아를 불어 넣은 후, 근육층과 피부를 차례로 봉합하였다. 이때 이식할 수정란은 배양액으로 2~3회 세척한 다음 한 개의 난관에 10~15개를 넣어 주었다.
유리화 동결된 배아가 부착된 EM grid는 액체질소 보관용기에서 최소 2주 이상 보관하였으며 융해는 EM grid를 1.0 M, 0.5 M, 0.25 M, 0.125 M, 0 M sucrose 용액에 연속적으로 각각 2.5분씩 침지함으로써 융해하면서 세포질 내의 동결억제제를 제거 하였다. 마지막으로 배양액으로 2~3회 세척한 다음 배양액이 들어있는 배양접시로 옮겨 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
유리화 동결의 효능을 증진하기 위한 방법으로 당 (sucrose) 농도의 영향을 살펴보기 위하여 농도의 변화를 주어 유리화 동결을 실시하였다. 본 연구를 통해 0.
5분씩 순차적으로 진행하였다. 융해 후 48~72시간 동안 배양을 실시하여 24시간 단위로 해부현미경 관찰을 통해 배아의 생존율, 발달률 및 부화율을 관찰하였고, 생존율, 발달률 및 부화율은 백분율로 평가하였다.
EG+DMSO 혼합동결액의 개선을 위해 DMSO의 농도를 고정하고 EG의 농도를 조정하였다. 전 평형된 배아를 5.5 M EG만을 이용해 평형 후 LN2에 침지, 5.5 M EG+15% DMSO의 혼합액을 이용한 평 형 후 LN2에 침지, 3.5 M EG+15% DMSO의 혼합액을 이용한 평형 후 LN2에 침지, 1.5 M EG+15% DMSO의 혼합액을 이용한 평형 후 LN2에 침지, 2.7 M (15%) EG+15% DMSO의 혼합액을 이용한 평형 후 LN2에 침지를 각각 시행하여 유리화 동결하였고, 그 결과를 아무 처리를 하지 않은 대조군과 비 교하였다. 그 결과는 Table 3에 정리하였다.
마취된 생쥐의 등 쪽에 털을 제거한 후 약 1 cm 정도 절개한 다음 절개 부위를 통해 좌측 난소의 방향으로 피부와 근육층을 분리 하였다. 혈관을 피해 근육층을 절개한 다음, 난소, 난관, 자궁을 노출시킨 후 고정하고 해부현미경 아래에서 이식을 시행하였다. 우선 자궁을 찾아 놓고, 여기에 29 G 주사기로 자궁에 구멍을 뚫은 다음 준비된 이식용 파이펫의 끝을 삽입하여 극미량의 배양액과 함께 발달된 배아를 불어 넣은 후, 근육층과 피부를 차례로 봉합하였다.
대상 데이터
유리화 동결액은 20% human serum albumin (HAS, SAGE, Trumbull, CT, USA)이 첨가된 Quinn's advantage medium (with HEPES buffer solution, SAGE)을 기본 배양액으로 사용하였고 각 실험에 따라 Table 1에 제시된 농도로 배양액을 제조하여 사용하였다. 동결억제제로는 침투성 동결억제제인 ethylene glycol (EG, Sigma-Aldrich)이 단독으로 또는 침투성 동결억제제인 dimethylsulphoxide (DMSO, SigmaAldrich)와 비침투성 동결억제제인 sucrose (SigmaAldrich)와 혼합하여 사용하였다. 모든 용액은 제조 후 0.
본 연구에 사용된 실험동물은 차의과학대학교 동물실험 윤리위원회의 승인하에 진행하였으며 항온 및 항습이 유지되면서 낮 12시간, 밤 12시간이 조절되는 사육실에서 충분한 먹이와 물, 공간을 제 공하면서 사육하였다. 실험을 위한 배아의 회수는 3~4주령된 암컷 생쥐 (ICR strain, Samtako Inc.
실험을 위한 배아의 회수는 3~4주령된 암컷 생쥐 (ICR strain, Samtako Inc., Osan, Korea)에 5 IU pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 복강 주사하고, 48시간 후에 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG, Sigma-Aldrich)을 복강주사한 뒤 8주령 수컷과 교미시켰다.
유리화 동결액은 20% human serum albumin (HAS, SAGE, Trumbull, CT, USA)이 첨가된 Quinn's advantage medium (with HEPES buffer solution, SAGE)을 기본 배양액으로 사용하였고 각 실험에 따라 Table 1에 제시된 농도로 배양액을 제조하여 사용하였다.
데이터처리
배아의 발달률과 부화율 조사에 대한 결과에 통계적인 분석은 one-way ANOVA (Duncan test)를, 분만율의 분석에는 Chi-square test를 이용하였고, p값이 0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
냉각속도를 증가시키기 위한 슬러시 상태의 질소를 이용하기 위한 방법의 경우는 유리화 동결 방법은 같은 방법으로 진행되었고 마지막 침지 시 Vit-Master (IMT, Ness Ziona, Israel)를 이용해 만들어진 슬러시 상태의 질소에 침지하였다.
배아 동결에는 electron microscopic grid (EM grid IGC 400, Pelco Internationals, Westchester, PA, USA)를 이용한 유리화 동결법을 이용하였다. 12 먼저 배아를 37℃의 전평형액 (pre-equilibration solution)에서 2.
성능/효과
각 유리화 동결액에 따른 유리화 동결 및 융해 후에 생존율은 아무 처리를 하지 않은 대조군의 경우 99.1%를 보였고, 실험군의 경우는 각각 91.3%, 92.4%, 98.2%, 98.2%를 보여 EG+DMSO 혼합군에서 보다 나은 생존율을 관찰 할 수 있었다 (p<0.05).
그 결과는 Table 3에 정리하였다. 각 유리화 동결액에 따른 유리화 동결 후에 융해 후에 생존율은 대조군의 경우 100%를 보였고 실험군의 경우는 각각 94.4%, 97.9%, 91.5%, 44.7%, 99.1%를 보 였다. 또한 각각의 처리군을 포배기까지의 발달률을 살펴보았을 때 대조군은 98.
7 M (15%) EG+ 15% DMSO의 혼합액에 평형한 후 LN2와 SN2에 침지한 결과는 Table 5와 같다. 각 유리화 동결액에 따른 유리화 동결/융해 후 생존율은 대조군의 경우 100%를 보였고 실험군의 경우는 각각 LN2군에서 92.0%, 96.8%, 98.8%, SN2군에서 94.1%, 98.1%, 98.9% 를 보였다. 또한 재확장된 포배기의 배아는 대조군이 100%, LN2군에서 80.
5 M sucrose의 혼합액을 이용하여 평형한 후 각각 LN2 에 침지하였고, 그 결과를 Table 4에 기술하였다. 각 유리화 동결액에 따른 유리화 동결과 융해 후에 생존율은 대조군의 경우 99.3%를 보였고 실험군의 경우는 각각 91.4%, 84.7%, 99.2%, 98.5%를 보였 다. 또한 각각의 처리군에서 포배기까지의 발달률을 살펴보았을 때 대조군은 97.
3% 를 각각 보였다. 그리고 부화 포배기까지 발달률도 대조군은 97.2%, 실험군은 71.2%, 80%, 94.6%, 95.6%를 보였다. 이상과 같이 발달률도 생존율과 유사한 경향을 관찰할 수 있었다.
6 M 농도)의 경우는 통계적으로 유의성 있게 생존 및 발달률이 낮았다. 따라서 이러한 결과를 통해 4.8~5.5 M 사이의 농도가 생존율과 발생률에 가장 좋은 농도임을 알 수 있었다. 또한 2.
5 M 사이의 농도가 생존율과 발생률에 가장 좋은 농도임을 알 수 있었다. 또한 2.7 M EG+15% DMSO로 동결억제제를 혼합하여 평형에 이용한 경우가 타군에 비해 유의성 있게 높은 생존율 및 발달률을 보였다.
배아 이식 후 산자의 생산 결과를 살펴 보면 SN2를 사용한 경우가 각각의 농도에서 유의 하게 산자의 생산을 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 또한 SN2의 사용은 보다 낮은 유리화 동결액의 농도에서도 다수의 산자의 생산이 가능하게 함을 알 수 있었다.
05). 또한 각각에 처리군을 포배기까지의 발달률을 살펴 보았을 때 대조군은 98.1% 를 보였고 반면 실험군은 74.%, 84.4%, 96.4%, 97.3% 를 각각 보였다. 그리고 부화 포배기까지 발달률도 대조군은 97.
1%를 보 였다. 또한 각각의 처리군을 포배기까지의 발달률을 살펴보았을 때 대조군은 98.1%를 보였고 반면 실험군은 86.6%, 90.3%, 87.9%, 22.8%, 97.3%를 각각 보였다. 부화 포배기까지 발달률도 살펴보면 대조 군은 95.
이상의 결과를 종합하면 투과성 동결억제제인 EG와 DMSO를 동량으로 혼합하여 사용하였을 때가 유리화 동결-융해 후 생쥐 배아의 생존과 발생률에 있어서 보다 좋은 결과를 얻었고, 슬러시 질소를 이용한 유리화 동결의 도입은 냉각속도의 증가를 통해 기존 유리화 동결방법의 효율을 증진시켜 생존율과 융해 후 발생률, 임신율이 향상되었다. 또한 냉각속도의 증진을 통해 유리화 동결의 필수 요건인 고농도의 동결억제제에 노출을 감소시킬 수 있는 가능성을 확인하였다.
이러한 결과는 인간 난자을 대상으로 하는 연구의 결과를 재확인 시켜주며, 13 향후 인간 배아 또는 포배기의 유리화 동결에 슬러시 질소의 도입을 가능케 할 것이다. 또한 슬러시 질소을 이용한 냉각속도의 증가는 3.2 M의 저농도에서도 생쥐 포배기의 생존율을 가능하게 했고, 배아 이식 후 산자의 회수율에도 많은 기여를 하였다. 이상의 결과는 높은 냉각속도가 동결억제제의 농도를 낮출 수 있다는 이론을 확인하는 것으로 추가 연구를 통해 유리화 동결법을 개선하는 방법으로서 사용이 가능할 것이다.
9% 를 보였다. 또한 재확장된 포배기의 배아는 대조군이 100%, LN2군에서 80.7%, 91.4%, 97.6%, SN2군에서 82.4%, 96.2%, 97.8%를 보였다. 부화 포배기까 지 발달률도 살펴보면 대조군은 97.
1% (5/55), 18% (9/50)가, SN2군에서는 18% (9/50), 20% (11/55), 38% (19/50)가 각각 산자로 태어났다. 배아 이식 후 산자의 생산 결과를 살펴 보면 SN2를 사용한 경우가 각각의 농도에서 유의 하게 산자의 생산을 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 또한 SN2의 사용은 보다 낮은 유리화 동결액의 농도에서도 다수의 산자의 생산이 가능하게 함을 알 수 있었다.
유리화 동결의 효능을 증진하기 위한 방법으로 당 (sucrose) 농도의 영향을 살펴보기 위하여 농도의 변화를 주어 유리화 동결을 실시하였다. 본 연구를 통해 0.5 M 농도의 당을 첨가한 경우가 더 높은 농도의 당이 첨가된 군에 비해 더 높은 생존과 발생률을 보였다 (Table 4). 실제로 당의 농도를 1.
30~33 따라서 본 연구에서는 혼합 동결 억제제의 이용에서 DMSO의 효용성과 적정농도를 확인하고자 하였다. 본 연구를 통해서 생쥐 배아와 포배기의 유리화 동결에서는 EG 단독의 동결억제제의 사용보다는 EG와 DMSO가 혼합된 동결보존 액을 사용할 경우 생존율과 배아 발생률이 보다 높다는 결과를 얻었다 (Tables 2, 3). 또한 이러한 결과는 일부 연구자들의 선행 연구 결과와 동일하였다.
또한 이 선행 연구에서 포배기의 경우 보다 낮은 농도의 CPA를 사용한 동결액의 개발이 가능할 것으로 여겨져 농도조절 연구에서는 포배기에 우선적으로 적용하여 진행하였다 (Table 5, Figure 1). 본 연구의 결과를 통해 슬러시 질소에 의한 냉각속도의 증가가 동결보존의 대상에 따라 약간의 차이는 있으나 동결상해를 줄여 유리화 동결의 효율성을 증진시키는 것에 기여를 한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 인간 난자을 대상으로 하는 연구의 결과를 재확인 시켜주며, 13 향후 인간 배아 또는 포배기의 유리화 동결에 슬러시 질소의 도입을 가능케 할 것이다.
따라서 본 연구에서는 유리화 동결을 위한 동결억제제의 조성조절과 동결속도의 조절에 의한 동결억 제제의 농도조절이 배아의 유리화 동결-융해 후 생존율 또는 발생률에 미치는 영향을 비교하였다. 이러한 연구 결과를 통해 유리화 동결 시 동결억제제 조성의 개선과 냉각속도의 개선을 통한 동결억 제제의 농도감소를 통한 효율증진의 가능성을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 종합하면 투과성 동결억제제인 EG와 DMSO를 동량으로 혼합하여 사용하였을 때가 유리화 동결-융해 후 생쥐 배아의 생존과 발생률에 있어서 보다 좋은 결과를 얻었고, 슬러시 질소를 이용한 유리화 동결의 도입은 냉각속도의 증가를 통해 기존 유리화 동결방법의 효율을 증진시켜 생존율과 융해 후 발생률, 임신율이 향상되었다. 또한 냉각속도의 증진을 통해 유리화 동결의 필수 요건인 고농도의 동결억제제에 노출을 감소시킬 수 있는 가능성을 확인하였다.
생쥐 배아의 유리화 동결 시 동결속도의 변화에 따른 유리화 동결액의 농도조절 가능성을 재확인 하기위해 유리화 동결 후 융해된 각 그룹의 포배기 배아를 생쥐 대리모에 이식하고, 산자를 확인하였다. 이식 후 산자의 수는 대조군에서 53.3% (24/ 45)의 포배기가 산자로 태어났고, LN2군에서는 각각 0% (0/50), 9.1% (5/55), 18% (9/50)가, SN2군에서는 18% (9/50), 20% (11/55), 38% (19/50)가 각각 산자로 태어났다. 배아 이식 후 산자의 생산 결과를 살펴 보면 SN2를 사용한 경우가 각각의 농도에서 유의 하게 산자의 생산을 증가시켰음을 확인할 수 있었다.
9%를 보였다. 이와 같은 결과로 볼 때 1.0 M sucrose의 농도 보다는 0.5 M의 sucrose의 농도에서 유의성 있는 생존과 발생률을 관찰할 수 있었다.
7%를 보였다. 이와 같은 결과로 볼 때 2.7 M (15%) EG+15% DMSO의 혼합액에 평형 후 LN2와 SN2에 침지한 경우에는 차이를 발견할 수 없었다. 하지만 1.
0%를 보였다. 이와 같은 결과로 볼 때 동결보호제 혼합액 7.6 M 고농도의 동결억제제 처리군에서 융해된 배아의 생존율은 높지만 발달률은 낮았다. 하지만 통계적 유의성은 없었다.
이상과 같이 발달률도 생존율과 유사한 경향을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 결과로 볼 때 생쥐 배아의 생존율과 발생률에 있어서 적절한 농도의 EG와 DMSO의 혼합이 EG 단독의 동결억제제보다 동결보존에 유리함을 보였다. 한편 냉각속도의 증진을 위해 슬러시 상태의 질소의 사용은 EG를 단독으로 사용한 군에서 LN2에의 침지보다 유의성 있게 배아의 발달률을 증진시켰으나, EG와 DMSO의 혼합군에서는 차이를 관찰할 수 없었다 (Table 2).
후속연구
본 연구의 결과를 통해 슬러시 질소에 의한 냉각속도의 증가가 동결보존의 대상에 따라 약간의 차이는 있으나 동결상해를 줄여 유리화 동결의 효율성을 증진시키는 것에 기여를 한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 인간 난자을 대상으로 하는 연구의 결과를 재확인 시켜주며, 13 향후 인간 배아 또는 포배기의 유리화 동결에 슬러시 질소의 도입을 가능케 할 것이다. 또한 슬러시 질소을 이용한 냉각속도의 증가는 3.
2 M의 저농도에서도 생쥐 포배기의 생존율을 가능하게 했고, 배아 이식 후 산자의 회수율에도 많은 기여를 하였다. 이상의 결과는 높은 냉각속도가 동결억제제의 농도를 낮출 수 있다는 이론을 확인하는 것으로 추가 연구를 통해 유리화 동결법을 개선하는 방법으로서 사용이 가능할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동결보존의 기본 원리는 무엇인가?
결국 해동이나 융해 이 후에 세포나 조직의 생존성을 해치게 된다.3 따라서 동결보존의 기본 원리는 세포의 고유한 형태를 유지하면서 내부의 수분을 고농도의 동결억제제 (cryoprotectant)의 삼투압 원리를 이용하여 점진적으로 제거하고, 이로 인해 얼음결정을 최소화하여 세포를 보호하는 것이다. 또한 동결을 통해 세포 내 모든 생리 및 생화학적 반응의 속도를 느리게 하거나 차단함으로써 장기간의 보존이 가능하다.
수분이 있는 상태로 동결 보존 이후 해동과정에서 세포나 조직의 생존성을 해치는 까닭은 무엇인가?
동결대상이 되는 세포나 조직의 대부분을 수분 이 차지하고 있기 때문에, 이들의 제거 없이 동결하 게 되면 세포 내의 수분이 날카로운 얼음결정 (ice crystal)을 형성하고 팽창하여 세포막과 내부 소기관 에 상해를 일으키게 된다. 결국 해동이나 융해 이 후에 세포나 조직의 생존성을 해치게 된다.
유리화 동결이란 무엇인가?
난자 및 배아는 일반 세포에 비해 부피가 크고 더불어 수분함유량이 매우 많아 이를 효과적으로 동결보존하기 위해서는 특히 얼음결정을 최소화하는 동결보존 기술이 필요한데, 이런 관점에서 도입 되어진 방법이 유리화 동결법이다.4 유리화 동결은 세포를 -196℃의 액체질소 (liquid nitrogen, LN2)에 직접 노출시켜 동결보존을 유도하지만, 실제로는 동결과정에서 세포 내에 얼음결정이 형성되지 않고 수분이 액체와 고체의 중간인 비결정질과 같은 상태를 유지하도록 하는 기술이다.5,6 이러한 상태를 "유리화"라고 하며, 이를 얻기 위해서는 세포 내 수분이 고농도의 동결억제제로 치환되는 것이 필요하며, 이에 더불어 매우 높은 냉각속도 (분당 3,000℃ 이상)가 필요하다.
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