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문제 정의
- 본 연구는 우리나라 무안, 태안, 여수, 제주 지역 및 중국 영성, 대련 지역의 낙지 개체군의 종 및 집단분석을 위해 미토콘드리아 CO1유전자의 염기서열을 조사하였다. 유전자 분석은 총 60 개체로부터 6개의 haplotype이 조사되었다.
- 본 연구는 우리나라 태안 (뻘낙지), 무안 (세발낙지), 여수 (통발낙지), 제주 (돌낙지) 및 중국 대련 및 영성 집단 낙지를 대상으로 CO1 유전자의 일부 염기서열을 조사하고, 낙지와 같은 속 (genus) 에 있는 문어 (O. dofleini) 의 CO1 유전자 분석을 통해 종 간 및 종 내 유전적 변이를 비교 조사하였다.
제안 방법
- 9% 에타놀에 보관하였다. DNA 추출을 위 해 약 20mg 조직을 lysis buffer (MFX-2000, TOYOBO) 에 넣고 proteinase K 처리 후 Mag Extractor genome DNA purification kit (TOYOBO) 와 함께 자동 DNA 추출기 (Mag Extractor MFX-6100, TOYOBO) 를 이용하여 total genomic DNA를 추출하였다.
- PCR primer pair HCO2198와 LCO1490에 의해 예상된 약 620bp 크기를 agarose gel 전기영동으로 확인한 후 염기서열 분석에 이용하였다. 한국과 중국 각 집단에서 확보된 총 60개체의 낙지 CO1 염기서열을 비교하였을 때, 본 연구에서 사용된 다양한 명칭의 낙지 개체군간 유사도가 99%로 매우 높은 것으로 확인되었고 NCBI GenBank에 등록된 Octopus minor mtDNA CO1 염기서열 (AB430541) 과 비교한 결과 99% 상동성을 가지고 있었다.
- 모든 PCR 과정이 끝난 후 agarose gel 전기영동으로 증폭된 DNA의 크기를 확인하였다. PCR 산물은 QIA quick PCR purification kit (QIAGEN) 로 PCR amplicon을 정제한 후, 염기서열분석에 이용하였다. Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit를 이용하여 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) 및 DNA sequencing analysis software (Applied Biosystems) 를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- PCR 조성은 template DNA 3μl, forward primer와 reverse primer 각각 1 μl (10pM μl-1), 10 X Taq PCR buffer 3 μl, dNTP mixture (2.5 mM each) 2.4 μl, Taq DNA polymerase (5 unit μl -1) 0.6 μl를 넣고, 멸균된 증류수로 최종부피 30 μl를 맞추었다.
- PCR 산물은 QIA quick PCR purification kit (QIAGEN) 로 PCR amplicon을 정제한 후, 염기서열분석에 이용하였다. Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit를 이용하여 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) 및 DNA sequencing analysis software (Applied Biosystems) 를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- 동일 속 (Genus) 에 있는 문어 (O. dofleini) 를 기준으로 6지역의 낙지집단의 유연관계를 분석하였다 (Fig. 4.). 문어와 낙지의 유전적 거리는 0.
- 그 후 DNA extension는 72℃에서 1 min 하여 총 35 cycles을 수행하였다. 모든 PCR 과정이 끝난 후 agarose gel 전기영동으로 증폭된 DNA의 크기를 확인하였다. PCR 산물은 QIA quick PCR purification kit (QIAGEN) 로 PCR amplicon을 정제한 후, 염기서열분석에 이용하였다.
- 본 연구에서 얻어진 낙지 및 문어의 염기서열은 SeqMan software 프로그램 (DNASTAR Lasergene 8 package) 을 이용하여 sequence assembly하여 정렬하였고, MEGA 4 프로그램 (Tamura et al., 2007) 에 의해 haplotype 분석 및 유전적 거리를 추정하였다.
- 본 연구에서는 서식지 혹은 지역마다 다양한 명칭으로 불리는 낙지 종류에 대한 종개념에서의 유전학적 차이를 조사하고 집단분석을 통해 지역집단 간 특성조사를 실시하였다. Mitochondria DNA (mtDNA) 의 진화속도는 일반적으로 nuclear DNA (nDNA) 에 비해 빠르고 (Hillis et al.
대상 데이터
- 낙지 CO1 유전자 PCR 증폭을 위해 사용된 universal CO1 primer는 HCO2198 (5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3')와 LCO1490 (5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3')를 사용하였다 (Folmer et al., 1994).
- 우리나라 낙지 주산지인 무안을 중심으로 태안, 여수, 제주 등 4집단 및 중국 대련 및 영성 집단에서 낙지 시료를 확보하였다 (Fig. 1.). 각 집단에서 각각 10개체를 대상으로 일부 조직을 추출하여 99.
성능/효과
- 국내 낙지 집단에서 관찰된 haplotype 분포와는 많은 차이를 나타내는 것으로 분석되었다 (Table 2). 관찰된 6개 haplotype은 두 개의 cluster로 나누어지면서 우리나라 제주와 중국 영성 집단의 개체군에서 주로 관찰된 haplotype A와 haplotype D가 하나의 cluster를 형성하고, 무안, 태안, 여수 그리고 중국 대련 집단에서 주로 관찰되었던 haplotype B, C, E가 다른 하나의 cluster를 형성하고 있었다 (Fig. 3.).
- 1로 분석되었다. 국내 낙지 집단에서 관찰된 haplotype 분포와는 많은 차이를 나타내는 것으로 분석되었다 (Table 2). 관찰된 6개 haplotype은 두 개의 cluster로 나누어지면서 우리나라 제주와 중국 영성 집단의 개체군에서 주로 관찰된 haplotype A와 haplotype D가 하나의 cluster를 형성하고, 무안, 태안, 여수 그리고 중국 대련 집단에서 주로 관찰되었던 haplotype B, C, E가 다른 하나의 cluster를 형성하고 있었다 (Fig.
- 한국과 중국 각 집단에서 확보된 총 60개체의 낙지 CO1 염기서열을 비교하였을 때, 본 연구에서 사용된 다양한 명칭의 낙지 개체군간 유사도가 99%로 매우 높은 것으로 확인되었고 NCBI GenBank에 등록된 Octopus minor mtDNA CO1 염기서열 (AB430541) 과 비교한 결과 99% 상동성을 가지고 있었다. 또한 같은 속 (Genus) 으로 분류되는 문어 (O. dofleini) 와 낙지의 CO1 유전자는 81%의 상동성을 나타내었다. 분석된 partial CO1 유전자 염기서열에서 131, 334, 352, 382 및 401 위치에서 염기치환 (base substitution) 이 관찰되었고, 이들 변이는 모두 transition (A↔G, C↔T) 으로 transversion (A↔T, A↔C, C↔G, G↔T) 변이는 관찰되지 않았다 (Fig.
- 미토콘드리아 CO1 유전자의 131, 334, 352, 382, 401 염기위치에서 염기치환에 의한 6종의 haplotype (A, B, C, D, E, F) 을 구분할 수 있었다. 제주를 제외한 대부분의 국내 낙지 개체군은 C haplotype으로, 태안 낙지 개체군인 경우 모든 개체가 (N = 10) C type, 여수 개체군에서의 C type 빈도 0.
- , 2005). 본 연구에서는 5개의 염기치환 위치에서 각 집단 개체군별 변이를 조사한 결과, 국내 낙지집단은 제주를 제외한 대부분 (태안, 여수, 무안) 집단의 개체군에 서의 allele 빈도는 유사하였으나, 제주 집단의 모든 개체 (N = 10) 는 유전적으로 동질하면서 다른 한국 집단의 개체군과는 완전히 다른 allele 분포를 가지고 있었다 (Table 1). 중국 낙지인 경우 대련 집단은 우리나라 태안, 여수, 무안 집단과 유사하였고, 영성 집단은 제주 집단과 유사하였다.
- 분석된 partial CO1 유전자 염기서열에서 131, 334, 352, 382 및 401 위치에서 염기치환 (base substitution) 이 관찰되었고, 이들 변이는 모두 transition (A↔G, C↔T) 으로 transversion (A↔T, A↔C, C↔G, G↔T) 변이는 관찰되지 않았다 (Fig. 2.).
- 미토콘드리아 CO1 유전자의 131, 334, 352, 382, 401 염기위치에서 염기치환에 의한 6종의 haplotype (A, B, C, D, E, F) 을 구분할 수 있었다. 제주를 제외한 대부분의 국내 낙지 개체군은 C haplotype으로, 태안 낙지 개체군인 경우 모든 개체가 (N = 10) C type, 여수 개체군에서의 C type 빈도 0.7, 무안 개체군에서는 0.9로 관찰되었으나, 제주 개체군인 경우 모든 개체 (N = 10) 가 A haplotype으로 다른 지역과 뚜렷한 차이를 나타내었다. 중국산 낙지 개체군인 경우 대련지역 개체군은 C type 0.
- PCR primer pair HCO2198와 LCO1490에 의해 예상된 약 620bp 크기를 agarose gel 전기영동으로 확인한 후 염기서열 분석에 이용하였다. 한국과 중국 각 집단에서 확보된 총 60개체의 낙지 CO1 염기서열을 비교하였을 때, 본 연구에서 사용된 다양한 명칭의 낙지 개체군간 유사도가 99%로 매우 높은 것으로 확인되었고 NCBI GenBank에 등록된 Octopus minor mtDNA CO1 염기서열 (AB430541) 과 비교한 결과 99% 상동성을 가지고 있었다. 또한 같은 속 (Genus) 으로 분류되는 문어 (O.
후속연구
- Group A에 속하는 무안, 태안, 여수, 대련 집단의 낙지 개체군은 group B (제주, 영성) 에 속하는 집단 개체군 보다 유전적 거리가 아주 가까웠다. 본 연구에서 사용한 CO1 universal primer는 종 판별 유전자 마커로서 낙지류에서도 유용하게 활용될 수 있었으나 partial CO1 유전자 내의 변이가 많지 않기 때문에 집단분석에는 한계가 있으나, 지역적 거리 및 장벽 그리고 서식지 차이 등에서 오는 제한적 gene flow에 대한 논의는 가능할 것으로 판단된다.
- (2009) 등은 16S rRNA 유전자를 이용하여 낙지집단의 유전학적 분석을 실시하였고 그 결과 남해 (남해, 여수, 무안, 진도), 서해 (거문도, 서산) 그리고 중국 (산동) 낙지 집단으로 구분됨을 보고하였다. 본 연구에서는 중국 영성 (CYS) 집단은 중국 대련 집단보다 한국 제주 집단과 유전적으로 가까운 것으로 분석되어, 중국 영성 집단에서 확보된 낙지의 서식지 및 생태가 제주 집단과 어떤 공통점이 있는지 확인할 필요가 있을 것으로 판단된다.
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