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문제 정의
- 그러므로, 본 연구에서는 독도의 동도 연안과 선착장 주변, 서도 어민 숙소 근처에서 2007년과 2008년에 3차례에 걸쳐 해수와 모래 등을 채집하여 해양 세균을 분리한 후, 그 염색체 DNA를 추출하여 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 부분동정을 통하여 독도에 존재하는 해양미생물의 종류를 밝혔다. 동시에 독도에 서식하는 배양가능한 세균의 우점속을 파악하며, 새로운 종 또는 새로운 속으로의 가능성을 제시하고, 나아가 보다 유용한 세균 자원 확보를 위한 기초 데이터를 제공하였다.
제안 방법
- 1/10 MA, 1/2 MA, MA 배지 등에 희석한 시료를 각각 100 µL 도말한 후, 25 ℃에서 5일간 배양하였다.
- 염기서열 간의 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model을 사용하여 추정하였다[21]. Neighbour-joining data의 Bootstrap 분석 시 1,000회의 resampling을 적용하여 tree topology의 평가 기준으로 사용하였고[12, 33], 이를 토대로 하여 phylogenetic tree를 결정하였다.
- PCR 조건은 denaturation(94 ℃, 5분) 시킨 후, denaturation(94 ℃, 30초), annealing(60 ℃, 30초), elongation(72 ℃, 45초) 단계를 35회 반복하고, 마지막으로 elongation(72 ℃, 10분)하는 조건으로 반응시켰다[39]. PCR 산물을 DNA prep mate TM (Bioneer, Korea)를 사용하여 회수하고, 염기서열을 결정하였다.
- 분리한 세균을 Marine broth(MB; Difco, USA)에 배양한 후 원심분리하여 세균을 모았다(10,000×g, 5 min). QIAamp DNA mini kit(QIAGEN; USA)을 사용하여 total genomic DNA를 추출하였다. 분리한 total DNA에서 16S rRNA를 증폭시키기 위하여 5'-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3'(Escherichia coli nucleotides 9에서 27)를 forward primer로 5-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'(E.
- 특히, 독도 연안의 해양세균의 분포에 대한 연구는 거의 없다. 그러므로, 본 연구에서는 독도의 동도 연안과 선착장 주변, 서도 어민 숙소 근처에서 2007년과 2008년에 3차례에 걸쳐 해수와 모래 등을 채집하여 해양 세균을 분리한 후, 그 염색체 DNA를 추출하여 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 부분동정을 통하여 독도에 존재하는 해양미생물의 종류를 밝혔다. 동시에 독도에 서식하는 배양가능한 세균의 우점속을 파악하며, 새로운 종 또는 새로운 속으로의 가능성을 제시하고, 나아가 보다 유용한 세균 자원 확보를 위한 기초 데이터를 제공하였다.
- 독도 연안에 존재하는 배양 가능한 미생물의 다양성을 16S rRNA 분석으로 조사하였다. 동도 선착장 주변과 서도 숙소 부근을 중심으로 채취한 시료에서 163개의 해양 미생물을 분리하였다.
- 분리균 udc398도 α-agarase 활성을 확인하였다.
- 분리된 세균을 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자의 염기서열 간 유사도를 확인하기 위하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) search를 이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 EzTaxon server(http://www.eztaxon.org)의 데이터베이스에서 유사한 염기서열을 비교하였다[27]. 분리균 DNA로부터 결정된 염기서열과 데이터베이스에서 얻어진 염기서열은 PHYDIT program(http://plaza.
- 분리한 total DNA에서 16S rRNA를 증폭시키기 위하여 5'-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3'(Escherichia coli nucleotides 9에서 27)를 forward primer로 5-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'(E. coli nucleotides 1492에서 1512)를 reverse primer로 사용하여 PCR을 수행하였다.
- 분리한 세균을 Marine broth(MB; Difco, USA)에 배양한 후 원심분리하여 세균을 모았다(10,000×g, 5 min).
- 1/10 MA, 1/2 MA, MA 배지 등에 희석한 시료를 각각 100 µL 도말한 후, 25 ℃에서 5일간 배양하였다. 세균의 순수 분리를 위하여, 배지 상에 나타난 군락을 형태적으로 분류, 선별하여 각각의 한천 배지에 획선 도말하였다.
- 염기서열이 분석된 분리균 163종 중 16S rRNA 유전자 염기서열의 거의 전체가 분석된 107종을 대상으로 각각의 분리균을 크게 gamma-proteobacteria와 alpha-, epsilonprteobacteria와 Bacteriodetes 그룹으로 분류한 뒤 계통수를 작성하였다. Fig.
- 채취한 시료는 단계별로 멸균된 artificial sea water[4]로 희석하여 standard dilution plating technique을 이용하여 Marine agar 2216(MA; Difco, USA) 배지에 도말하였다 [41]. 1/10 MA, 1/2 MA, MA 배지 등에 희석한 시료를 각각 100 µL 도말한 후, 25 ℃에서 5일간 배양하였다.
대상 데이터
- 독도를 구성하고 있는 2개의 큰 섬인 동도와 서도 연안에서, 먼저 접근하기 쉬운 동도 계단 주위 연안을 중심으로 바닷물을 채취하고, 선착장 주변에서 고여 있거나 흐르는 바닷물과, 서도에서는 어민 숙소 앞과 물골 주위의 바닷물을 각각 채취하였다. 2007년 9월, 2008년 4월과 6월 등 3회에 걸쳐 채취하였다. 채취한 시료는 멸균된 cornical tube에 담았고, 실험실에 옮겨서는 4 ℃에 보관하였다.
- 독도를 구성하고 있는 2개의 큰 섬인 동도와 서도 연안에서, 먼저 접근하기 쉬운 동도 계단 주위 연안을 중심으로 바닷물을 채취하고, 선착장 주변에서 고여 있거나 흐르는 바닷물과, 서도에서는 어민 숙소 앞과 물골 주위의 바닷물을 각각 채취하였다. 2007년 9월, 2008년 4월과 6월 등 3회에 걸쳐 채취하였다.
- 독도 연안에 존재하는 배양 가능한 미생물의 다양성을 16S rRNA 분석으로 조사하였다. 동도 선착장 주변과 서도 숙소 부근을 중심으로 채취한 시료에서 163개의 해양 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물 163종을 16S rRNA 염기서열의 분석을 이용하여 부분동정 할 수 있었다.
이론/모형
- Phylogenetic tree based on comparison of the 16S rDNA gene sequences of cultivable bacteria isolated from Dokdo coastal sea water and some of their closest phylogenetic relatives. The phylogenetic tree was generated using the neighbor-joining method.
- org)의 데이터베이스에서 유사한 염기서열을 비교하였다[27]. 분리균 DNA로부터 결정된 염기서열과 데이터베이스에서 얻어진 염기서열은 PHYDIT program(http://plaza.snu.ac.kr/~jchun/phydit)을 이용하여 Clustal W multiple alignment로 정렬하여 계통수 제작에 이용하였다. 염기서열 간의 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model을 사용하여 추정하였다[21].
- 염기서열 간의 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model을 사용하여 추정하였다[21].
성능/효과
- 163개의 분리균에서 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석할 수 있었는데, BLAST 로써 분석한 결과 56속 94종으로 부분동정 되었다. 전체적으로 보면 94개의 분리균이 gamma-proteobacteria(57.
- 3%에서 100%의 유사도를 보이며 56속 94종으로 부분 동정되었다. 163종의 부분 동정된 미생물 중 36개의 분리 미생물이 새로운 종으로 분류될 후보군으로 추정되었다. 본 연구의 결과 독도연안 바닷물에는 proteobacteria와 bacteriodetes의 비율이 높게 나타났고, 미생물 다양성을 높게 유지하고 있었다.
- 2007년 9월 시료에서는 2008년 4월과 6월 시료보다는 더 다양한 gamma-proteobacteria에 속하는 균들 분리 동정되었고, 4월과 6월 시료에서는 대장균군이 검출되지 않았지만, 9월 시료에서는 동도 선착장 주변의 해수 시료에서 대장균군에 속하는 세균인 Enterobacter aerogens가 검출되었는데, 이는 그 시기에 동도 선착장 인근 해역이 분변성 오염이 있을 수 있음을 암시하고 있다.
- Bacteriodetes에 속하는 균은 대부분 호기성이며 그람 음성균으로 complex macromolecule을 분해할 수 있는 능력을 가지는 균이 다수 알려져 있다[17]. 7개의 분리균이 Cellulophaga 속으로 동정되어 가장 우점속을 차지하고 있었고, 그 다음 Maribacter 속이 5개가 분리되었다(Fig. 2C).
- Alpha-proteobacteria는 17속에 속하는 22종 33개의 분리 균이 부분 동정되었다. Alpha-proteobacteria는 31개의 분리균이 Rhodobacteriaceae과에 속했고, 2개의 분리균이 Sphingomonadaceae과에 속했다. 이 결과는 바닷물로부터 분리한 alpha-proteobacter는 Rhodobacteriaceae과와 Sphingomonadaceae과가 우점을 차지하고 있다는 다른 지역의 분석 결과와 일치하는 분포를 보이고 있다[33].
- Alpha-proteobacteria로 분류된 33개의 분리균 중 16S rRNA 염기서열 상동성이 98.5% 미만인 분리균은 14개로 약 42%의 분리균이 새로운 종이 될 가능성을 가진 균주로 추정되었다(Table 1). 이 결과는 gamma-proteobacteria로 분류된 분리균보다 훨씬 새로운 종으로 동정될 가능성이 높았다.
- Roseobacter 계통은 호기성 비산소성 광합성을 담당하고, 온실 가스인 일산화탄소의 산화를 할 수 있어서 지구의 탄소와 황 순환에 중요한 역할을 하고 있다고 한다[35]. Alphaproteobacteria는 10종이 분리된 Phaeobacter 속이 우점속을 차지하고 있었고 나머지 분리균들은 특별히 우점속을 차지하지 않았고 다양한 alpha-proteobacteria에 속하는 분리균 들이 동정되었다(Fig. 2B). 분리균 2007년 9월 시료에서 분리된 udc336과 udc337은 Sulfitobacter pontiacus로 동정되었는데, Sulfitobacter pontiacus는 아황산염과 일산화탄소를 산화 할 수 있고, 방향족 화합물을 분해 할 수 있는 roseobacter 계통에 속하는 균주로 알려졌다[3].
- Bacteridetes로 분류된 26개의 분리균 중 16S rRNA 염기서열 상동성이 98.5% 미만인 분리균은 8개로 약 31%의 분리균이 새로운 종이 될 가능성을 가진 균주로 추정되었다(Table 1). 2008년 4월 시료에서는 9개의 Bacteriodetes에 속하는 종 중에 4종(약 44%)이 신종이나 신속으로 동정될 수 있다고 추정되기 때문에, 2008년 6월 시료보다 다양성도 높았고, 신종이나 신속의 가능성을 가진 균주의 비율도 높았다(Table 1).
- Bacteriodetes에 속하는 세균은 26개의 분리균이 14속 14종으로 부분동정 되었다. Bacteriodetes에 속하는 균은 대부분 호기성이며 그람 음성균으로 complex macromolecule을 분해할 수 있는 능력을 가지는 균이 다수 알려져 있다[17].
- 5% 미만인 분리균은 새로운 종일 가능성이 있다고 추정되었다[38]. Gamma-proteobacteria로 분류된 94개의 분리균 중 16S rRNA 염기서열 상동성이 98.5% 미만인 분리균은 14개로 약 15%의 분리균이 새로운 종으로 분류될 가능성을 가진 균주로 추정되었다(Table 1). 2007년 9월 시료에서는 다른 시료보다 gamma-proteobacteria의 비율도 높았고, 다양한 종류의 gamma-proteobacteria가 분리되었고, 새로운 종으로 분류될 가능성을 가진 균주의 비율도 약 24%(9/37)로 2008년 4월 시료 약 14%(4/18), 6월 시료 약 3%(1/29)보다 높았다.
- 채취한 장소에 따라 세균 종류와 수적 차이가 있었는데, 흐르는 해수를 채취 했을 때 보다 고여 있는 해수 시료에서 더 다양한 종류의 세균이 분리되었다. MA 원래 조성을 사용한 고체 배지에서보다 1/2 MA, 1/10 MA로 희석한 고체 배지에서 적은 숫자의 세균이 분리되었지만, 해당 배지에서만 특징적으로 분리되는 세균도 있었다.
- 3A는 가장 많이 분리된 gamma-proteobacteria의 phylogenetic tree를 보여준다. Vibrionaceae과, Shewanellaceae과와 Altermonadaceae과가 다수를 차지하고 있었고, 그 외에 10과와 19속에 속하는 다양한 세균이 분리되었다. Fig.
- 이는 해수온도의 차이 때문에 세균 분포가 다를 수 있다고 추정할 수 있었다[31]. 그리고 분리균의 종을 살펴보면 지리적으로 가까이 위치한 한국의 다른 해안가나 독도에서 분리된 균들과 염기서열 상동성이 높은 균들이 다른 지역에서 분리한 균보다는 많은 비율을 차지하고 있었다. 전체 염기서열이 분석된 분리균 163개 중 16S rRNA 염기서열이 기존 세균의 염기서열과 상동성을 비교했을 때, 98.
- 독도의 해수에서 분리한 균은 gamma-, alpha-, epsilon-proteobacteria, Bacteriodetes, low G+C Gram positive bacteria 등 5개의 계통으로 나누어졌다. 그중에 gamma-proteobacteria에 속하는 균이 약 58%를 차지하고 있었고, high G+C Gram positive bacteria는 분리되지 않았다. 이전에 한국의 해수환경인 제주 문섬의 세균군집 조사에서는 high G+C Gram positive bacteria가 약 59%가 분리되었고, 그 다음으로는 alpha-proteobacteria가 분리되었다는 결과와는 큰 차이를 보이고 있었다[26].
- Rhodobacteriaceae과와 Sphingomonadaceae과 모두 해양 Roseobacter 계통(alpha-3 subclass)에 속하는데, Roseobacter 계통은 특히 해양의 해안가와 극지방의 해양에서 배양할 수 미생물 중 약 25%를 차지한다고 알려져 있다[35]. 독도의 해안가에서 배양되는 미생물의 군집에서 분리된 alphaproteobacteria는 모두 Roseobacter 계통으로 전체 염기서열 분석된 분리균의 약 20%(33/163)를 차지하고 있었다. Roseobacter 계통은 호기성 비산소성 광합성을 담당하고, 온실 가스인 일산화탄소의 산화를 할 수 있어서 지구의 탄소와 황 순환에 중요한 역할을 하고 있다고 한다[35].
- alginolyticus와 상동성이 높은 udc311, udc324가 분리되기도 하였다[11]. 두 번째로는 Shewanella 속이 15개로 동정되었다. 2007년 9월 시료에서는 gamma-proteobacteria 중 Shewanella 속이 차지하는 비율이 약 22%로 Vibrio속보다더 우점을 차지하고 있었다.
- 163종의 부분 동정된 미생물 중 36개의 분리 미생물이 새로운 종으로 분류될 후보군으로 추정되었다. 본 연구의 결과 독도연안 바닷물에는 proteobacteria와 bacteriodetes의 비율이 높게 나타났고, 미생물 다양성을 높게 유지하고 있었다. 이 다양한 미생물로부터 다양한 유용미생물 자원을 확보할 수 있고, 새로운 종으로 분류될 후보군 들은 추후 여러 생리생화학적 실험을 수행하여 새로운 종 또는 새로운 속으로 발표할 수 있을 것으로 판단된다.
- 분리한 미생물 163종을 16S rRNA 염기서열의 분석을 이용하여 부분동정 할 수 있었다. 부분동정된 미생물은 gamma-proteobacteria(58%), alpha-proteobacteria (20%), bacteriodetes(16%) 계통이 대부분을 차지하고 있었고, 그 외에도 low G+C Gram positive bacteria와 epsilonproteobacteria가 소수 동정 되었다. 염기서열이 분석된 미생물들은 이전에 보고된 미생물들의 16S rRNA 유전자와 93.
- 동도 선착장 주변과 서도 숙소 부근을 중심으로 채취한 시료에서 163개의 해양 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물 163종을 16S rRNA 염기서열의 분석을 이용하여 부분동정 할 수 있었다. 부분동정된 미생물은 gamma-proteobacteria(58%), alpha-proteobacteria (20%), bacteriodetes(16%) 계통이 대부분을 차지하고 있었고, 그 외에도 low G+C Gram positive bacteria와 epsilonproteobacteria가 소수 동정 되었다.
- 1A). 시료 채취 시점에 따른 세균 분포는 gamma-proteobacteria가 모든 시점에서 가장 많이 분포하고 있었지만, 동도 앞바다에서 채취한 시료에서는 다른 시점보다 alpha-proteobaceria의 분포 비율이 높았고, Epsilon-proteobacteria는 동도 선착장 주변에서 채취한 시료에서만 분리되었으며, 동도 선착장 주변에서 채취한 시료에서 가장 다양한 그룹에 속하는 세균이 분리되었다(Fig. 1B).
- 부분동정된 미생물은 gamma-proteobacteria(58%), alpha-proteobacteria (20%), bacteriodetes(16%) 계통이 대부분을 차지하고 있었고, 그 외에도 low G+C Gram positive bacteria와 epsilonproteobacteria가 소수 동정 되었다. 염기서열이 분석된 미생물들은 이전에 보고된 미생물들의 16S rRNA 유전자와 93.3%에서 100%의 유사도를 보이며 56속 94종으로 부분 동정되었다. 163종의 부분 동정된 미생물 중 36개의 분리 미생물이 새로운 종으로 분류될 후보군으로 추정되었다.
- 5% 미만인 분리균은 14개로 약 42%의 분리균이 새로운 종이 될 가능성을 가진 균주로 추정되었다(Table 1). 이 결과는 gamma-proteobacteria로 분류된 분리균보다 훨씬 새로운 종으로 동정될 가능성이 높았다.
- 그리고 분리균의 종을 살펴보면 지리적으로 가까이 위치한 한국의 다른 해안가나 독도에서 분리된 균들과 염기서열 상동성이 높은 균들이 다른 지역에서 분리한 균보다는 많은 비율을 차지하고 있었다. 전체 염기서열이 분석된 분리균 163개 중 16S rRNA 염기서열이 기존 세균의 염기서열과 상동성을 비교했을 때, 98.5% 이하인 균주는 gamma-proteobacteria 14개, alphaproteobacteria 14개, Bacteriodetes 8개로 전체 36개(약 22%)의 분리균이 새로운 종이 될 가능성을 가진 균주로 추정되었고, alpha-proteobacteria로 분류된 분리균이 새로운 종으로 분류될 가능성이 가장 높았다. 이 결과는 전 등[20]에 의해 연구된 독도 식물근권에서 분리한 포자형성세균과 질소고정세균의 신종 가능성을 가진 균주의 비율인 20%보다 약간 높았다.
- 163개의 분리균에서 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석할 수 있었는데, BLAST 로써 분석한 결과 56속 94종으로 부분동정 되었다. 전체적으로 보면 94개의 분리균이 gamma-proteobacteria(57.7%), 32개의 분리균이 alpha-proteobacteria(19.6%), 27개의 분리균이 bacteriodetes(16.6%)에 속하고 있었고, 그 외에 6개의 분리균이 low G+C Gram positive bacteria(3.7%) 4개의 분리균이 epsilon-proteobacteria(2.5%)에 각각 속했다. Proteobacteria 중 강이나 호수에서 주로 분리되는 beta-proteobacteria는 분리되지 않았고 [8, 13, 27, 29], 대부분의 해양 침적지에서 우점으로 분포되는 delta-proteobacteria도 역시 분리되지 않았다.
- 채취한 장소에 따라 세균 종류와 수적 차이가 있었는데, 흐르는 해수를 채취 했을 때 보다 고여 있는 해수 시료에서 더 다양한 종류의 세균이 분리되었다. MA 원래 조성을 사용한 고체 배지에서보다 1/2 MA, 1/10 MA로 희석한 고체 배지에서 적은 숫자의 세균이 분리되었지만, 해당 배지에서만 특징적으로 분리되는 세균도 있었다.
후속연구
- 본 연구의 결과 독도연안 바닷물에는 proteobacteria와 bacteriodetes의 비율이 높게 나타났고, 미생물 다양성을 높게 유지하고 있었다. 이 다양한 미생물로부터 다양한 유용미생물 자원을 확보할 수 있고, 새로운 종으로 분류될 후보군 들은 추후 여러 생리생화학적 실험을 수행하여 새로운 종 또는 새로운 속으로 발표할 수 있을 것으로 판단된다.
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