선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구그룹은 대한민국 서해 연안의 해수로부터 agarase를 생산하는 신규 미생물을 확보하여 동정하고 그 특성을 규명함으로써, 우리나라의 생물자원 및 유전자원을 확보하고, 해양자원인 한천을 이용한 산업 발전에 응용하고자 하였다. 그 결과, 40℃에서 최대활성을 나타내는 agarase를 생산하는 균주 H9을 분리하였으며, 본 논문에서는 H9 균주의 동정, 생리적·생화학적 특성을 서술하였다.
- 본 연구그룹은 대한민국 서해 연안의 해수로부터 agarase를 생산하는 신규 미생물을 확보하여 동정하고 그 특성을 규명함으로써, 우리나라의 생물자원 및 유전자원을 확보하고, 해양자원인 한천을 이용한 산업 발전에 응용하고자 하였다. 그 결과, 40℃에서 최대활성을 나타내는 agarase를 생산하는 균주 H9을 분리하였으며, 본 논문에서는 H9 균주의 동정, 생리적·생화학적 특성을 서술하였다.
제안 방법
- 회수된 균체로부터 genomic DNA를 Genomic DNA extraction kit (DyneBio, Korea)로 추출하여 PCR 주형으로 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며[19], 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열은 GenBank에 JF965427로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BlastN program을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다.
- 균주 H9을 ASW-YP 액체배지와 최종농도 0.2%로 agar가 첨가된 ASW-YPA 액체배지에 각각 96시간동안 배양하면서 (28℃, 180 rpm) 24시간 간격으로 샘플을 채취하였다. 600 nm에서 흡광도를 측정하여 샘플의 균체 성장을 측정하였고, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 샘플 상등액의 agarase 활성을 측정하였다.
- 균주 H9는 Gram stain kit (BD Biosciences, USA)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 균주 H9의 균체 크기 및 모양 그리고 flagella의 유무는 2일간 고체배지에서 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid (PTA)로 염색한 후 투과전자현미경(JEM1010, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 탄소원 사용 및 발효, 효소생산 등의 생리적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit (Biomérieux, France)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
- 단, 제공되는 배지에 NaCl을 최종농도 2%가 되도록 첨가하여 28℃에서 2일간 배양한 후 관찰하였다. 균주 H9의 성장 특성은, NaCl을 최종농도 0−10% (1% 간격)가 되도록 각각 첨가한 ASW-YP 고체배지에 균주를 접종한 후 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다. 균주 H9의 성장에 영향을 미치는 pH 조건을 알아보기 위해서, pH 4.
- 균주 H9의 성장 특성은, NaCl을 최종농도 0−10% (1% 간격)가 되도록 각각 첨가한 ASW-YP 고체배지에 균주를 접종한 후 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다. 균주 H9의 성장에 영향을 미치는 pH 조건을 알아보기 위해서, pH 4.0-pH 10.0 (pH 1.0의 간격)의 고체배지를 만들어 균주를 접종한 후 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다. 또한 배양 온도에 따른 성장을 관찰하기 위해서 4, 15, 20, 25, 37, 40℃에서 각각 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다.
- 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열은 GenBank에 JF965427로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BlastN program을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다. 또한 EzTaxon database (http://www.eztaxon.org/)로부터 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 계통발생적 연관성을 분석하였다. 확보된 염기서열들 간의 Multi alignment는 ClustalW program(www.
- 0의 간격)의 고체배지를 만들어 균주를 접종한 후 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다. 또한 배양 온도에 따른 성장을 관찰하기 위해서 4, 15, 20, 25, 37, 40℃에서 각각 4일간 배양하여 성장을 관찰하였다.
- 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며[19], 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열은 GenBank에 JF965427로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BlastN program을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다. 또한 EzTaxon database (http://www.
- 12 M KI)으로 염색하여 colony 주변에 아가분해활성을 나타내 투명하게 보이는 colony를 선별하였다. 선별된 미생물 균주는 새로운 ASW-YP 또는 marine agar (Difco 2216) 고체배지에 옮겨서 2일간 배양하여 colony의 모양, 색깔, 투명도, 크기 등을 관찰하여 형태적 특성을 토대로 3개의 그룹으로 나누었다. 이들 3개의 그룹에서 각각 한 균주씩을 대표균주로 선정하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 이들 3개의 그룹에서 각각 한 균주씩을 대표균주로 선정하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 최종적으로 활성이 우수한 균주 H9을 선택하여 본 연구에 사용하였다.
- 해수에 서식하는 agarase 생산 미생물을 분리하기 위해서, 충청남도 보령시 대천 인근에 위치한 호도 근해의 해수를 채취하여 멸균수에 10−1−10−5으로 희석한 후 ASW-YP 평판고체배지(6.1 g Tris base, 12.3 g MgSO4, 0.74 g KCl, 0.13 g (NH4)2HPO4, 17.5 g NaCl, 0.14 g CaCl2, 1% Yeast extract, 0.3% bacto peptone, 1.5% agar; per liter; pH 7.2)에 도말하였다. 도말한 평판고체배지는 28℃에서 2일간 배양한 후 성장하는 모든 colony들을 새로운 고체배지에 접종하였다(replica 제작).
이론/모형
- 이러한 결과로부터 균주 H9은 Pseudoalteromonas 속의 한 종으로 판단되었다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 표준균주들과의 계통발생적 연관관계를 규명하고자 N-J 법으로 계통수를 제작하였다. 그 결과, 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성 조사와 마찬가지로 P.
- 600 nm에서 흡광도를 측정하여 샘플의 균체 성장을 측정하였고, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 샘플 상등액의 agarase 활성을 측정하였다. Agarase 활성은 0.2% agarose(AMRESCO LLC., USA)를 기질로 하는 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)법[13]으로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단, 효소반응은 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
- 0 ml/min 유속으로 사용하였다. 균체의 지방산은 methyl ester화[14] 시킨 fatty acid methyl esters (FAME) 혼합물을 Microbial Identification System (MIDI)의 지침[18]에 따라 Gas chromatography (Agilent technologies 6890, USA) 방법으로 분석하였다. HP ultra 2 컬럼(25 m × 0.
- 온도 조건에 따른 H9의 총 agarase의 효소활성을 조사하기 위해서, 준비된 조효소를 이용하여 25-50℃ (5℃ 간격)에서 각각 agarose를 기질로 하는 효소반응(20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0)을 10분간 실시하여, DNS 법으로 활성을 측정하였다. pH 조건에 따른 agarase의 효소활성은 pH 6.
- 조효소 10 μl를 0.2% agarose가 포함된 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)에 첨가한 후 40℃에서 24시간동안 반응하면서 12시간 간격으로 반응액을 취하여, Thin layer chromatography (TLC) 방법으로 가수분해산물을 분석하였다 [5]. 반응액(10 μl)을 Silica Gel 60 plate(EMD Merck AG, Darmstadt, Germany)에 로드하고 n-butanol, acetic acid 및 물(2:1:1, v/v/v)의 용매시스템 상에서 2회 연속 전개하여 분리하였다.
- com/download/windows/clustalW2/)을 사용하였고 5'-과 3'-말단의 gap은 GeneDoc program으로 편집하였다. 진화적 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura’s two-parameter evolutionary model [9]에 의해 계산되었고, Neighbor-Joining (N-J)법[17]으로 계통수를 제작하였다. 신뢰도(bootstrap value)는 1,000회의 재구성된 자료로부터 새롭게 tree를 제작하여 계산하였다.
- 균주 H9의 균체 크기 및 모양 그리고 flagella의 유무는 2일간 고체배지에서 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid (PTA)로 염색한 후 투과전자현미경(JEM1010, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 탄소원 사용 및 발효, 효소생산 등의 생리적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit (Biomérieux, France)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 단, 제공되는 배지에 NaCl을 최종농도 2%가 되도록 첨가하여 28℃에서 2일간 배양한 후 관찰하였다.
- org/)로부터 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 계통발생적 연관성을 분석하였다. 확보된 염기서열들 간의 Multi alignment는 ClustalW program(www.soft82.com/download/windows/clustalW2/)을 사용하였고 5'-과 3'-말단의 gap은 GeneDoc program으로 편집하였다. 진화적 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura’s two-parameter evolutionary model [9]에 의해 계산되었고, Neighbor-Joining (N-J)법[17]으로 계통수를 제작하였다.
성능/효과
- API 20NE kit를 사용한 생리적 특성 분석 결과, nitrate reduction, indole production, D-glucose fermentation 등의 반응과 urease, arginine dihydrolase, β-galactosidase 등의 효소생산에서 음성으로 관찰되었다. Arabinose, mannose, potassium gluconate, capric acid, adipic acid, phenylacetic acid 등의 assimilation 반응에서 음성으로 관찰되었다.
- 균주 H9은 배지내에 Na+ 이온이 존재하지 않으면 자라지 않는 Na+ 요구성 균주로 관찰되었고 Na+ 이온 농도가 6% 이상에서는 성장하지 못하였으며, 2−3%의 농도에서 최적의 성장이 관찰되었다. H9은 pH 4.0 이하와 pH 10.0 이상의 조건에서는 성장하지 못하였지만, pH 5.0−pH 9.0의 조건에서는 성장할 수 있고 pH 7.0−pH 8.0의 중성조건에서 최적의 성장이 관찰되었다. 또한 H9 균주는 10℃ 이하와 40℃ 이상의 온도 조건에서는 성장하지 못하지만, 15℃에서 약한 성장을 나타내고 25−30℃에서 최적의 성장이 관찰되었다.
- 3). H9의 agarase 활성은 두 종류 배지 모두에서 배양 24시간째 가장 높은 활성이 관찰되었는데, agar가 포함된 배지에서 약 1.5배 높은 활성이 관찰되었다. 이러한 결과로부터 균주 H9은 agar에 의해서 성장이 촉진될 뿐만 아니라 agarase 생산도 유도적으로 촉진되는 것으로 예상된다.
- atlantica IAM12927, P. agarivorans KMM255 등과 계통발생학적 연관관계를 갖는 것으로 예상되었다(Fig. 2).
- 4B). pH 9.0의 조건에서는 최대 활성의 약 83% 정도의 활성이 유지되어, 균주 H9의 agarase는 중성 및 약알칼리의 조건에서 높은 효소활성을 갖는 것으로 판단된다. 이는 해양 미생물이 서식하는 바닷물이 약알칼리성이기 때문인 것으로 추측된다.
- 균주 H9은 agar가 포함된 배지에서는 배양 초기부터 급격히 성장하여 배양 24시간째 stationary phase (OD600 = 4.22)에 접어들었고, 배양 48시간에 가장 높은 성장 (OD600 = 4.32)을 보인 후 서서히 감소하였다. 반면 agar가 포함되지 않은 배지에서는 배양 24시간째 최대 성장 (OD600 = 3.
- 균주 H9은 배지내에 Na+ 이온이 존재하지 않으면 자라지 않는 Na+ 요구성 균주로 관찰되었고 Na+ 이온 농도가 6% 이상에서는 성장하지 못하였으며, 2−3%의 농도에서 최적의 성장이 관찰되었다. H9은 pH 4.
- 균주 H9의 16S rRNA 유전자 염기서열을 해독하여 NCBI의 BlastN 프로그램으로 다른 미생물들과의 상동성을 조사한 결과, Pseudoalteromonas 속의 균들과 높은 상동성을 보였다. 균주 H9의 16S rRNA 유전자 염기서열은 P.
- 균주 H9은 quinone-8 (Q-8)을 주요 퀴논으로 함유하고 있었는데, Q-8은 Pseudoalteromonas 속 미생물이 함유하는 주요 퀴논으로 보고 되어 있다. 균주 H9의 주요지방산(>10%)은 C16:1ω7c (34.3%), C16:0 (23.72%), C18:1ω7c (13.64%) 등으로 관찰되었는데, 이들 주요지방산은 Pseudoalteromonas 속 미생물이 함유하는 주요 지방산과도 잘 일치한다[2]. 이러한 결과들은, H9이 Pseudoalteromonas 속에 속한다는 사실을 지지하는 증거이다.
- 균주 H9이 세포외로 배출하는 총 agarase는 40℃와 pH 7.0의 조건에서 최대 활성을 보였다(Fig. 4).
- 5). 그 결과, 균주 H9에 의해서 세포외부로 생산되는 agarase는 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 최종산물로 생산할 수 있음을 확인하였다. (Neo)agarooligosaccharide는 서론에서 언급했듯이 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있는 유용한 천연화합물로서 산업적으로 가치가 있다.
- 전술한 바와 같이 형태학적·생리학적 특성들과 유전학적 특성들을 토대로 균주 H9은 Pseudoalteromonas 속의 미생물로 분류될 수 있다. 그러나 H9 균주는 Pseudoalteromonas 속의 계통발생적 연관관계가 높은 다른 종들과는 생리화학적 특성들에서 많은 차이점들을 보였다(Table 1). 또한 균주 H9은 N-J phylogenetic tree에서 계통발생학적 연관관계가 높은 표준균주들과 분리된 monophyletic clade를 형성하였다.
- 45℃에서는 최대 활성의 약 91%의 활성을 보이고 35℃와 50℃에서는 최대 활성의 약 64%의 활성이 관찰되었다. 따라서 균주 H9이 생산하는 agarase는 40−45℃ 범위애서 높은 효소활성을 갖는 것으로 판단된다(Fig. 4A).
- 이러한 차이는, 전체 세포외 단백질내에는 AgaH92와는 다른 생화학적 속성을 갖는 agarase가 공존하고 있음을 시사하고 있어 이에 대한 후속 연구가 필요하다. 또한 AgaH92는 Fe2+ 이온에 의존성을 보이는 독특한 특징을 갖는 최초의 agarase임이 판명되어, H9 균주가 타 균주와는 구별되는 독특한 특성을 갖는 agarase들을 생산 할 가능성이 크다.
- 0의 중성조건에서 최적의 성장이 관찰되었다. 또한 H9 균주는 10℃ 이하와 40℃ 이상의 온도 조건에서는 성장하지 못하지만, 15℃에서 약한 성장을 나타내고 25−30℃에서 최적의 성장이 관찰되었다.
- 또한 균주 H9은 N-J phylogenetic tree에서 계통발생학적 연관관계가 높은 표준균주들과 분리된 monophyletic clade를 형성하였다. 이러한 결과들은 균주 H9이 지금까지 보고된 Pseudoalteromonas 속의 미생물과는 구별되는 균주 임을 시사한다.
- 64%) 등으로 관찰되었는데, 이들 주요지방산은 Pseudoalteromonas 속 미생물이 함유하는 주요 지방산과도 잘 일치한다[2]. 이러한 결과들은, H9이 Pseudoalteromonas 속에 속한다는 사실을 지지하는 증거이다.
- 64%) 등과 높은 상동성을 나타냈다. 이러한 결과로부터 균주 H9은 Pseudoalteromonas 속의 한 종으로 판단되었다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 표준균주들과의 계통발생적 연관관계를 규명하고자 N-J 법으로 계통수를 제작하였다.
- 5배 높은 활성이 관찰되었다. 이러한 결과로부터 균주 H9은 agar에 의해서 성장이 촉진될 뿐만 아니라 agarase 생산도 유도적으로 촉진되는 것으로 예상된다.
- 0에서 최대 활성을 보임을 보고하였다[5]. 이와 같은 AgaH92 agarase의 생화학적 특성은, 본 논문에서 제시하고 있는 H9 균주의 전체 세포외 단백질내에 존재하는 agarase의 최적 활성 조건(40℃, pH 7.0)과는 차이를 보이고 있다. 이러한 차이는, 전체 세포외 단백질내에는 AgaH92와는 다른 생화학적 속성을 갖는 agarase가 공존하고 있음을 시사하고 있어 이에 대한 후속 연구가 필요하다.
- 전술한 바와 같이 형태학적·생리학적 특성들과 유전학적 특성들을 토대로 균주 H9은 Pseudoalteromonas 속의 미생물로 분류될 수 있다. 그러나 H9 균주는 Pseudoalteromonas 속의 계통발생적 연관관계가 높은 다른 종들과는 생리화학적 특성들에서 많은 차이점들을 보였다(Table 1).
- 충청남도 대천 인근에 위치하는 호도 해안에 서식하는 agarase 생산 미생물 한 종을 선발하여 균주 H9으로 명명하였다. 균주 H9은 Korean Collection for Type Cultures(KCTC)에 KCTC23889로 기탁하였다.
- 1A), 그램 염색 결과 Gram 음성으로 판명되었다. 투과전자현미경 관찰 결과, H9 균체는 세로 1.5−2.0 μm 가로 0.6−0.8 μm 크기이며, 각각의 세포에는 1개의 polar flagellum을 갖고 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 1B).
후속연구
- 특히 일본에서는 한천의 화학적 분해방법을 통해서 한천유래 올리고당을 생산하여 식음료제품에 첨가한 기능성 상품을 판매 중에 있다. 따라서 균주 H9의 agarase를 이용한다면 자연친화적인 효소적 방법에 의해서 한천으로부터 기능성 올리고당의 생산이 가능하며, 이의 산업적 응용이 가능할 것으로 사료된다.
- 0)과는 차이를 보이고 있다. 이러한 차이는, 전체 세포외 단백질내에는 AgaH92와는 다른 생화학적 속성을 갖는 agarase가 공존하고 있음을 시사하고 있어 이에 대한 후속 연구가 필요하다. 또한 AgaH92는 Fe2+ 이온에 의존성을 보이는 독특한 특징을 갖는 최초의 agarase임이 판명되어, H9 균주가 타 균주와는 구별되는 독특한 특성을 갖는 agarase들을 생산 할 가능성이 크다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.