우리술의 주질개선 및 현장 실용화기술을 개발하기 위해 술 담금의 기본재료인 누룩의 규격화 및 품질향상 연구가 필요하다. 이와 같은 요구에 부응하기 위해, 누룩에 생육하는 우수 양조미생물의 분리 발굴, 균주개량 및 보존관리 등 우리 고유의 양조미생물 자원을 확보하고 활용함으로써 다양한 종류의 누룩 제조가 가능할 것으로 여겨진다. 따라서, 본 연구는 충청지역에서 시판되고 있는 누룩을 수집하여 희석평판 배양법으로 174개 균주를 분리하여 효소활성 검정을 통하여 효소 활성이 높은 균주를 다수 분리하였다. 분리된 곰팡이를 대상으로 액화력 및 당화력 등의 효소학적 특성을 조사하였고, 선발된 활성균주의 동정을 위해 genomic DNA상의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 부위의 염기서열을 분석한 결과 Aspergillus sp.(4균주), Rhizopus sp.(4균주), Rhizomucor sp.(2균주), Mycocladus sp.(2균주)으로 동정되었다. 밀기울을 사용한 고체배양에서 액화력, 당화력 및 산 생성능을 검토한 결과, Rhizopus sp. CN084, CN174, Aspergillus sp. CN161와 Mycocladus sp. CN042 균주가 효소활성이 높은 것으로 나타났으며 Aspergillus sp. CN010, CN161, Rhizopus sp. CN105, CN168 균주와 Rhizomucor sp. CN088 균주는 산 생성능이 우수한 것으로 나타났다. 따라서 이들 균주가 양조를 위한 누룩의 원료 균주로서 사용될 경우 단일 누룩제조가 가능할 것으로 판단되었다.
우리술의 주질개선 및 현장 실용화기술을 개발하기 위해 술 담금의 기본재료인 누룩의 규격화 및 품질향상 연구가 필요하다. 이와 같은 요구에 부응하기 위해, 누룩에 생육하는 우수 양조미생물의 분리 발굴, 균주개량 및 보존관리 등 우리 고유의 양조미생물 자원을 확보하고 활용함으로써 다양한 종류의 누룩 제조가 가능할 것으로 여겨진다. 따라서, 본 연구는 충청지역에서 시판되고 있는 누룩을 수집하여 희석평판 배양법으로 174개 균주를 분리하여 효소활성 검정을 통하여 효소 활성이 높은 균주를 다수 분리하였다. 분리된 곰팡이를 대상으로 액화력 및 당화력 등의 효소학적 특성을 조사하였고, 선발된 활성균주의 동정을 위해 genomic DNA상의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 부위의 염기서열을 분석한 결과 Aspergillus sp.(4균주), Rhizopus sp.(4균주), Rhizomucor sp.(2균주), Mycocladus sp.(2균주)으로 동정되었다. 밀기울을 사용한 고체배양에서 액화력, 당화력 및 산 생성능을 검토한 결과, Rhizopus sp. CN084, CN174, Aspergillus sp. CN161와 Mycocladus sp. CN042 균주가 효소활성이 높은 것으로 나타났으며 Aspergillus sp. CN010, CN161, Rhizopus sp. CN105, CN168 균주와 Rhizomucor sp. CN088 균주는 산 생성능이 우수한 것으로 나타났다. 따라서 이들 균주가 양조를 위한 누룩의 원료 균주로서 사용될 경우 단일 누룩제조가 가능할 것으로 판단되었다.
Studies on standardization and quality upgrade of nuruk which is a basic component in brewing are required to increase the quality level of Korean traditional rice wines and to develop the technology for practical use of it. It is important to isolate best strains, to improve the properties and effe...
Studies on standardization and quality upgrade of nuruk which is a basic component in brewing are required to increase the quality level of Korean traditional rice wines and to develop the technology for practical use of it. It is important to isolate best strains, to improve the properties and effectively preserve them for brewing industry. In this study, 16 commercial nuruk samples were obtained from the commercial markets located in Chungcheong areas in Korea. 174 fungal strains were isolated from the samples on DG18 medium using a dilution plating method and then screened for enzyme activity and acid production. The active strains were identified based on the morphological characteristics and ITS sequence analysis. Out of 174 strains, 12 strains showed high amylase activity. Especially, Rhizopus sp. CN084, CN174, Aspergillus sp. CN161 and Mycocladus sp. CN042 showed high saccharogenic power and dextrinogenic enzyme activity on cooked wheat bran medium. On the other hand, Aspergillus sp. CN010, CN161, Rhizopus sp. CN105, CN168 and Rhizomucor sp. CN088 produced high acid production on the same medium. Our results showed that the active strains may be used as microbial sources for nuruk starter with good quality in brewing.
Studies on standardization and quality upgrade of nuruk which is a basic component in brewing are required to increase the quality level of Korean traditional rice wines and to develop the technology for practical use of it. It is important to isolate best strains, to improve the properties and effectively preserve them for brewing industry. In this study, 16 commercial nuruk samples were obtained from the commercial markets located in Chungcheong areas in Korea. 174 fungal strains were isolated from the samples on DG18 medium using a dilution plating method and then screened for enzyme activity and acid production. The active strains were identified based on the morphological characteristics and ITS sequence analysis. Out of 174 strains, 12 strains showed high amylase activity. Especially, Rhizopus sp. CN084, CN174, Aspergillus sp. CN161 and Mycocladus sp. CN042 showed high saccharogenic power and dextrinogenic enzyme activity on cooked wheat bran medium. On the other hand, Aspergillus sp. CN010, CN161, Rhizopus sp. CN105, CN168 and Rhizomucor sp. CN088 produced high acid production on the same medium. Our results showed that the active strains may be used as microbial sources for nuruk starter with good quality in brewing.
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문제 정의
본 연구에서는 전통주의 품질향상을 위하여 충청지역 누룩에서 생육하는 우수 균주를 분리 · 선발하고, 이들 균주의 미생물학적 특성 등을 검토하였다.
제안 방법
순수 분리된 균주들을 MEB 배지에 균을 접종한 후 25℃에서 5일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. 1.5 mL microtube에 수확한 균사체를 넣고 동결 건조하여 마쇄한 뒤 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany;69106)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.
Nuclear rDNA 상에 존재하는 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA의 PCR 증폭을 위해, univeral primer pairs는 ITS1F-ITS4 primer[14]를 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 predenaturation 4분 후에 95℃에서 denaturation 1분, 58℃에서 annealing 1분, 72℃에서 extension 2분을 설정하여 35회 반복하고 최종 72℃에서 7분간 extension하여 약 530~640 bp의 밴드를 증폭시켰다.
균 분리는 누룩 표면의 서로 다른 균을 needle로 Malt extract agar (MEA: Malt extract 3%, Mycological peptone 0.5%, Agar 1.5%)배지에 접종하여 25℃에서 5일 동안 배양하여 서로 다른 균사를 순수 분리하였다.
당화력은 2% 가용성 전분용액을 기질로 하여 국세청 주류 분석규정[22] 및 일본 국세청 주류 분석규정[1]에 따른 glucoamylase 활성을 측정하여 비교하였다. 당화력은 기질용액을 55℃에서 1시간 효소반응시킨 후, 생성된 환원당의 양을 Lane-Eynone법[5]으로 측정하여 기질의 당화율이 15%되는 범위에서 당화율에 희석배수를 곱하여 산출하였다.
이와 같은 요구에 부응하기 위해, 누룩에 생육하는 우수 양조미생물의 분리 · 발굴, 균주개량 및 보존관리 등 우리 고유의 양조미생물 자원을 확보하고 활용함으로써 다양한 종류의 누룩 제조가 가능할 것으로 여겨진다. 따라서, 본 연구는 충청지역에서 시판되고 있는 누룩을 수집하여 희석 평판배양법으로 174개 균주를 분리하여 효소활성 검정을 통하여 효소 활성이 높은 균주를 다수 분리하였다. 분리된 곰팡이를 대상으로 액화력 및 당화력 등의 효소학적 특성을 조사하였고, 선발된 활성균주의 동정을 위해 genomic DNA상의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 부위의 염기서열을 분석한 결과 Aspergillus sp.
이들 균주를 대상으로 분자생태학적 동정을 실시하였다. 분리균의 ITS(Internal Transcribed Spacer)영역 염기서열을 분석하였다. 액화력이 우수한 균주(CN084, CN105, CN168 및 CN174)는 계통도에서 Rhizopus sp.
순수 분리된 균주들을 MEB 배지에 균을 접종한 후 25℃에서 5일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. 1.
순수 분리한 균주는 MEA, PDA 또는 OA배지 등에 접종하여 25℃에서 10일간 배양한 후, 균총의 형태와 색상, 균사의 특징 등을 관찰하였고 미세구조는 광학현미경(Karl Zeiss, Axioskop A2)을 사용하여 균사 및 포자의 형태 등을 관찰하였다. 분리균의 형태적 동정은 The Identification of Fungi(Dugan, 2006)[20], Identification of common Aspergillus species(Klich, 2002)[15], Introduction to Food-and Airborne Fungi Seventh Edition(Samson et al.
액화력 및 당화력의 단위는 누룩 혹은 배양체 1 g의 활성으로 표시하였으며, 각 sample은 3회 측정한 평균값으로 표기하였다.
시판누룩에서 분리한 균주들을 PDA, MEA 및 OA배지상에서 형태를 현미경으로 관찰한 결과, 일반적으로 공기 중에 높은 빈도로 존재하는 Aspergillus와 Rhizopus 속의 곰팡이가 대부분이었다. 이들 균주를 대상으로 분자생태학적 동정을 실시하였다. 분리균의 ITS(Internal Transcribed Spacer)영역 염기서열을 분석하였다.
0)으로 ITS 영역의 계통수를 작성하였으며 1,000회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였다[16]. 충청지역 누룩에서 분리한 균주의 분류적 위치를 검토하기 위해, NCBI GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)의 염기서열을 획득한 후, 분리균과의 similarity를 분석하였다.
일반적으로 누룩을 사용하는 발효과정에서 이상발효 및 잡균의 오염방지를 위해, 산 생성능이 높은 곰팡이가 필요 하다. 충청지역에서 분리한 12균주의 산 생성능을 조사하였다. 시판누룩의 pH는 6.
대상 데이터
희석액 100 µL를 분리용 평판배지에 도말하여 25℃에서 5일간 배양한 후, 나타난 곰팡이 colony를 순수 분리하였다. Dichloran-glycerol agar(DG18 : Peptone 0.5%, Glucose 1%, KH2PO4 0.1%, MgSO47H2O 0.05%, Dichloran (0.2% in ethanol) 1.0 mL, Chloramphenicol 0.01%, Agar 1.5%)배지와 Dichloran rose bengal chloramphenicol agar(DRBC: Peptone 0.5%, Glucose 1%, KH2PO4 0.1%, MgSO47H2O 0.05%, Dichloran (0.2% in ethanol) 1.0 mL, Rose bengal 0.0025%, Chloramphenicol 0.01%, Agar 1.5%)배지를 사용하였다.
본 실험에 사용한 누룩은 충청지역 7개 시군의 재래시장과 농가에서 직접 제조한 누룩 16점을 수집하여 사용하였다. 수집 누룩의 형태는 Table 1에서와 같이 대부분이 원형과 분쇄형으로 시판되고 있었으며, 원형 누룩은 지름이 160 mm 에서 270 mm, 두께는 32 mm에서 55 mm로 지역에 따라 크기가 다양하였다.
충청권에서 수집한 전통누룩 16점을 분리원으로 사용하였으며, 균 분리는 직접분리와 희석평판분리 두 가지 방법을 사용하였다.
충청권역인 아산시 외 7개 시 · 군의 재래시장에서 시판되는 누룩과 농가에서 직접 제조한 누룩 16점을 수집하였다(Table 1).
충청지역 시판 누룩에서 분리한 사상균을 대상으로 1차적으로 amylase 활성이 우수한 12 균주를 선발하였다(data not shown). 이들 균주의 액화력과 당화력 등의 효소활성을 Table 3에 나타내었다.
데이터처리
해독한 염기서열은 Lasergene사의 DNASTAR pro software(SeqMan Pro v7.0)를 이용하여 NJ 방법(MEGA v4.0)으로 ITS 영역의 계통수를 작성하였으며 1,000회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였다[16]. 충청지역 누룩에서 분리한 균주의 분류적 위치를 검토하기 위해, NCBI GenBank(http://blast.
이론/모형
Phylogenetic tree of fungi isolated from commercial Nuruk. The tree was constructed from NJ analysis of ITS sequence. The numbers above the nodes represent bootstrap values (out of 1,000 bootstrap replication).
당화력은 2% 가용성 전분용액을 기질로 하여 국세청 주류 분석규정[22] 및 일본 국세청 주류 분석규정[1]에 따른 glucoamylase 활성을 측정하여 비교하였다. 당화력은 기질용액을 55℃에서 1시간 효소반응시킨 후, 생성된 환원당의 양을 Lane-Eynone법[5]으로 측정하여 기질의 당화율이 15%되는 범위에서 당화율에 희석배수를 곱하여 산출하였다.
순수 분리한 균주는 MEA, PDA 또는 OA배지 등에 접종하여 25℃에서 10일간 배양한 후, 균총의 형태와 색상, 균사의 특징 등을 관찰하였고 미세구조는 광학현미경(Karl Zeiss, Axioskop A2)을 사용하여 균사 및 포자의 형태 등을 관찰하였다. 분리균의 형태적 동정은 The Identification of Fungi(Dugan, 2006)[20], Identification of common Aspergillus species(Klich, 2002)[15], Introduction to Food-and Airborne Fungi Seventh Edition(Samson et al., 2004)[7] 및 Atlas of Clinical Fungi(de Hoog et al., 2000)[6] 등의 서적을 참조로 하였다.
성능/효과
CN105, CN168 균주와 Rhizomucor sp. CN088 균주는 산 생성능이 우수한 것으로 나타났다. 따라서 이들 균주가 양조를 위한 누룩의 원료 균주로서 사용될 경우 단일 누룩제조가 가능할 것으로 판단되었다.
수집 누룩의 일반성분 및 효소학적 특성을 Table 2에 나타내었다. 누룩 추출물 pH는 대체로 6~7로 누룩간의 차이는 없었으며, 산도는 대체로 0.2~0.9 정도이나, 청주와 진천군 2에서 수집한 누룩의 산도는 1.8과 2.8로 높았다. 당화력의 경우, 청주에서 수집한 누룩 이외는 대체로 효소활성이 낮았으나, 그중에 보은 1, 충주, 공주 1, 2 누룩의 당화력는 320에서 348로 높았다.
CN088 균주는 산 생성능이 우수한 것으로 나타났다. 따라서 이들 균주가 양조를 위한 누룩의 원료 균주로서 사용될 경우 단일 누룩제조가 가능할 것으로 판단되었다.
시판누룩에서 분리한 균주들을 PDA, MEA 및 OA배지상에서 형태를 현미경으로 관찰한 결과, 일반적으로 공기 중에 높은 빈도로 존재하는 Aspergillus와 Rhizopus 속의 곰팡이가 대부분이었다. 이들 균주를 대상으로 분자생태학적 동정을 실시하였다.
후속연구
보다 정확한 동정을 위해, 향후 β-tublin과 elongation 1-α 등 유전자 분석과 18S rDNA 및 23S rDNA 분석이 병행되어야 할 것이다.
우리술의 주질개선 및 현장 실용화기술을 개발하기 위해술 담금의 기본재료인 누룩의 규격화 및 품질향상 연구가 필요하다. 이와 같은 요구에 부응하기 위해, 누룩에 생육하는 우수 양조미생물의 분리 · 발굴, 균주개량 및 보존관리 등 우리 고유의 양조미생물 자원을 확보하고 활용함으로써 다양한 종류의 누룩 제조가 가능할 것으로 여겨진다.
이와 같은 요구에 부응하기 위해, 누룩에 생육하는 우수 양조미생물의 분리 · 발굴, 균주개량 및 보존관리 등 우리 고유의 양조미생물 자원을 확보하고 활용함으로써 다양한 종류의 누룩 제조가 가능할 것으로 여겨진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
전통 발효주 제조 시, 누룩곰팡이의 역할은?
전통누룩은 고온 다습한 여름철에 자연적으로 곡물(밀)에 생육하는 다양한 미생물군(곰팡이, 효모 및 유산균)을 이용 하여 제조한 것으로, 주로 밀을 원료로 만들어지며 저온에서 장기간에 걸쳐 다양한 미생물군에 의해 발효되며, 지역에 따라 옥수수, 보리, 대두, 귀리, 조 및 백미 등의 잡곡류가 사용되기도 한다[12, 18]. 또한, 누룩곰팡이의 전분분해효소 작용으로 당화 효소제로서의 역할뿐만 아니라 효모 증식으로 알코올을 생산하는 역할까지 수행하는 병행복발효로 전통 발효주에 향과 맛을 낸다[13].
전통누룩은 무엇인가?
전통누룩은 고온 다습한 여름철에 자연적으로 곡물(밀)에 생육하는 다양한 미생물군(곰팡이, 효모 및 유산균)을 이용 하여 제조한 것으로, 주로 밀을 원료로 만들어지며 저온에서 장기간에 걸쳐 다양한 미생물군에 의해 발효되며, 지역에 따라 옥수수, 보리, 대두, 귀리, 조 및 백미 등의 잡곡류가 사용되기도 한다[12, 18]. 또한, 누룩곰팡이의 전분분해효소 작용으로 당화 효소제로서의 역할뿐만 아니라 효모 증식으로 알코올을 생산하는 역할까지 수행하는 병행복발효로 전통 발효주에 향과 맛을 낸다[13].
전통 누룩 제조법의 현대화와 품질 표준화에 대한, 체계적인 연구가 필요한 배경은?
누룩 미생물 연구는 누룩에서 분리한 황곡균의 특성[17, 22], 누룩미생물의 문헌적 고찰[23, 24], 한국 전통누룩에서 분리한 유용 곰팡이의 특성[11], 한국 재래식 누룩 중의 곰팡이의 분리 및 동정[8], 소곡주 공장의 공기로부터 곰팡이의 분리 및 동정[19], 효모 연구는 누룩으로부터 분리한 야생형 효모의 청주제조 가능성에 관한 연구[10], 전통 누룩에서 분리된 Saccharomyces cerevisiae HA3을 이용한 하향 주의 제조 및 특성[9] 등 여러 연구가 보고되고 있으나 분리 균주 보존관리가 미흡하고, 산업적 활용성이 낮은 상태이다. 농가에서 전통방식으로 제조한 누룩에서 곰팡이, 효모 및 유산균 등 다양한 균총의 존재로 생산된 누룩 또한 비위생적이고 역가가 낮은 제품들이 시중에 유통되고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 전통 누룩 제조법의 현대화 및 품질 표준화에 대한 체계적인 연구가 절실히 요구되고 있다.
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