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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 5종의 청국장(CKJ, CKJ-DD, CKJRG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)의 혈당상승에 관여하는 α-amylase 저해활성을 조사 하였다(Fig. 1).
제안 방법
- 1 kg의 대두를 깨끗하게 씻은 후, 25℃±1에서 12시간 건조시키고, 건조된 대두를 9시간 동안 침지를 시킨 후, Autoclave(jSR; JSAC-100)에서 121℃, 15분간 살균하였다.
- 1% DNS 용액(Dinitrosalicylic acid, color reagent)을 1 mL 첨가하여 반응을 정지시킨 후 100℃로 유지되는 boiling water bath에서 5분간 중탕 시킨 후, 실온(25℃±1)에서 30분간 식히고 1 mL 증류수를 첨가하였다.
- 건조 후 마쇄기를 사용하여 분쇄한 시료 1g을 Colormate용 cap에 담아 color spectrophotometer(SCINCO ColorMate®)를 이용하여 Hunter color system으로 L(lightness), a(redness), b(yellowness)의 값을 3회 반복 측정하고 색도를 평균값으로 나타내었다.
- 대두와 당귀, 지황, 홍삼을 깨끗하게 씻은 후, 실온(25℃±1)에서 12시간 건조 시켰다. 건조시킨 대두를 9시간 동안 침지를 시킨 후, 건조된 각각의 한약재들과 함께 Autoclave(jSR; JSAC-100)를 이용하여 121℃, 15분간 살균을 수행 하였다. 각 청국장 시료에 함유된 한약재들의 첨가비율은 Table 1과 같았다.
- 따라서 효율적인 당뇨병의 관리를 위해서는 활성산소를 제거 할 수 있는 항산화활성 물질의 섭취가 중요하다. 따라서 본 연구에서는 5종의 청국장(CKJ, CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJRED)의 항산화 활성(Peroxyl radical 소거능)을 측정하였고 그 결과는 Fig. 3과 같았다. 10 µg/mL 농도에서 대조군인 CKJ과 비교하여 CKJ-DD은 비슷한 활성을 보였으나 CKJRG는 1.
- 따라서 본 연구에서는 대두를 이용한 청국장발효시에 이들 기능성 페놀성 성분들을 다량함유하고 있는 당귀·지황·홍삼을 첨가하면 발효 중 대두 및 첨가된 약용식물의 각종 영양성분 및 생리활성의 변화가 올 것으로 예상하고, 청국장(CKJ), 당귀 청국장(CKJ-DD), 지황 청국장(CKJ-RG), 당귀·지황 청국장(CKJ-DD+RG), 홍삼 청국장(CKJ-RED)을 각각 제조 하여 발효 중 영양성분 및 생리활성물질들의 변화를 조사하였다.
- 발효를 통한 당귀·지황·홍삼의 각종 기능성 페놀성 성분들의 최적화를 통해 총페놀성분 함량, 항산화 활성, 그리고 혈당상승억제 효능의 변화가 이루어지는지를 조사하였으며, 또한 당귀·지황·홍삼을 첨가한 청국장과 일반청국장의 영양 및 기호도 변화를 알아보기 위하여 약용식물 첨가 및 무첨가 청국장의 색도 및 아미노산 조성의 변화에 대하여도 조사하였다.
- 살균된 시료를 50℃까지 식힌 후, 일반청국장 제조방법과 동일하게 미리 준비한 B. subtilis 종균배양액(108 CFU/mL)을 0.5% 첨가한 후, 37℃±1, 습도 80%, 48시간 배양 시켰다.
- )로 여과하였다. 여과액을 아미노산분석기(HITACH L-8900, Post-reaction type)로 분석하였다. 세부 기기 분석조건은 Table 2와 같았다.
- 유리아미노산 분석은 시료를 전처리(열수 추출)하여 간섭물질인 단백질 등을 제거한 후 분석하였다. 상세하게 설명하면 분말화 된 건조 청국장 시료 1g에 50 mL 증류수를 첨가하여 80℃에서 15분간 열수 추출하였다.
- 일반 청국장과 한약재를 첨가한 CKJ-DD, CKJ-RG, CKJDD+RG, CKJ-RED의 기호도 및 기능성을 측정하였다. 색도분석 결과, 5가지 청국장 모두 브라운 계열이었으며, a값(redness), b값(yellowness)은 5가지 청국장에서 모두 유의적인 차이를 나타냈다.
- Voltex 후 725 nm에서 Spectrophotometer(SHIMADZU; UV160A)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 지표물질인 Gallic acid를 증류수에 녹여 추출물 희석액과 같은 방법으로 반응시켜 표준검량곡선을 작성한 후 총페놀 함량은 Gallic acid-equivalent 값으로 계산하였으며 모든 측정은 3회 반복하여 평균값을 내어 계산하였다.
- 항산화 활성 측정은 Kurihara H[20]의 ORAC assay을 참고하였다. 체내에서 산화를 일으키는 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescein의 흡광도 감소율을 측정하여 계산하였다. 과산화 라디칼의 생성을 위하여 2,2’-azobis(2- amidinopropane) dihychloride(AAPH, 20 mM)을 사용하였고, 측정기기는 GENios functional plate reder Salzburg(Tecan)로 사용하였으며 전자가 485 nm에서 흡수되고 538 nm에서 방출되게 설정해 놓고 사용하였다.
- 측정방법은 DMSO(Junsei; Dimethyl sulfoxide)에 녹인 건조 청국장 시료 200µL를 0.02 M sodium phosphate buffer(pH 6.9, 0.006 M sodium chloride 함유)에 녹인 porcine pancreatic α-amylase 용액 300 µL와 섞은 후, 25℃에서 10분간 반응시켰다.
- 효소액을 완충용액으로 대체하고 시료만을 용해시킨 것을 대조구로 사용하여 측정값을 비교하였으며, αamylase에 의해서 기질로부터 분해된 환원당과 DNS 용액과의 반응을 통해 발색된 정도를 조사하기 위해 540 nm에서 ELISA reader(Tecan; SUNRISE) 를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 과산화 라디칼의 생성을 위하여 2,2’-azobis(2- amidinopropane) dihychloride(AAPH, 20 mM)을 사용하였고, 측정기기는 GENios functional plate reder Salzburg(Tecan)로 사용하였으며 전자가 485 nm에서 흡수되고 538 nm에서 방출되게 설정해 놓고 사용하였다.
- 5% 첨가한 후, 37℃±1, 습도 80%, 48시간 배양시켰다. 배양이 끝난 청국장시료는 건조 후 마쇄기를 사용하여 분말화 시켜 시험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 대두(품종: 황금콩, Glycine max(L.)Merrill)와 당귀(건당귀, Angelica gigas), 지황(생지황, Rehmanniae raidx) 그리고 홍삼(4년근, Panax ginseng)은 충청남도 금산군 농업기술센터에서 새기술실증시험 연구활동의 일환으로 공여된 시료를 사용하였다. 청국장 발효 미생물은 볏짚에서 분리된 Bacillus subtilis(B.
- 청국장 발효 미생물은 볏짚에서 분리된 Bacillus subtilis(B. subtilis)를 nutrient broth(Bacto; 88053JE)에서 37℃±1, 48시간 종균배양한 후 사용하였다.
- 효소는 pancreatic α-amylase(EC 3.2.1.1)를 사용하였고, 기질로는 1% starch solution을 사용하였다.
데이터처리
- SAS(Statistical Analysis system)에 의한 Duncan의 다범위 검정(Duncan's multiple range test)을 통하여 p<0.05에서 각 시료간의 유의적인 차이를 검증하였다.
이론/모형
- 총 페놀 함량의 측정은 Folin-Ciocalteu Phenol법을 사용하여 측정하였다. 건조하여 분말화 시킨 5종의 청국장 시료 0.
- 항산화 활성 측정은 Kurihara H[20]의 ORAC assay을 참고하였다. 체내에서 산화를 일으키는 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescein의 흡광도 감소율을 측정하여 계산하였다.
- 혈당상승억제 실험은 Kwon 등이 사용한 당질분해효소활성억제 시험법인 α-amylase 저해 실험법을 이용하였다[21].
성능/효과
- 10 µg/mL 농도에서 대조군인 CKJ과 비교하여 CKJ-DD은 비슷한 활성을 보였으나 CKJRG는 1.5배, CKJ-DD+RG은 3배 높은 항산화 활성을 나타냈다.
- 079 mg/g-dry weight으로 가장 낮은 함량을 나타냈다. CKJ-DD+RG은 Glutamic acid, Lysine, NH3, Aspartic acid, Phenylalanine순으로 함량이 높았으며, CKJ-RED는 Glutamic acid, Lysine, Leucine, NH3, Valine 순으로 0.993 mg/g-dry weight의 가장 높은 유리 아미노산 함량을 보였다. 청국장은 발효숙성 중에 Bacillus subtilis의 작용으로 콩의 단백질을 분해시켜 구수한 맛을 내는 Glutamic acid, Aspartic acid, 쓴맛을 지닌 valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine 및 단맛을 내는 alanine, glycine, lysine[24] 등의 유리아미노산들이 어울러져 청국장 특유의 향미를 갖게 해준다.
- 56 mg/100 g GAE으로 총 페놀 함량이 가장 낮은 함량을 나타내었다. CKJ-RED이 17.87 mg/100 g GAE으로 총 페놀 함량이 가장 높은 함량을 나타냈으며, CKJ-RG, CKJDD+RG 그리고 CKJ-DD 순이었다. 이러한 결과는 Kim 등이 보고한 홍삼 가공시간에 따른 페놀성 성분 함량의 변화와 일치하는 것이었으며[18], 총 페놀 성분의 분석을 통해 한방청국장의 품질관리가 가능할 것으로 사료된다.
- Fluorescein값은 2분 마다 100 cycle로 기록 되었으며 모든 Fluorescein값은 최초의 값에 비교되어 상대적으로 나타내었으며, ORAC 값은 1g당 µM Trolox equivalent로 나타내었다(µM TE/g).
- 청국장은 발효숙성 중에 Bacillus subtilis의 작용으로 콩의 단백질을 분해시켜 구수한 맛을 내는 Glutamic acid, Aspartic acid, 쓴맛을 지닌 valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine 및 단맛을 내는 alanine, glycine, lysine[24] 등의 유리아미노산들이 어울러져 청국장 특유의 향미를 갖게 해준다. 각 조건별 청국장 종류에 따라 유리아미노산 함량이 다르게 나타났으며, 맛과 향미 또한 다르게 나타났다. 홍삼청국장의 경우 구수한 맛을 내는 glutamic acid와 단맛을 내는 lysine의 함량이 다른 시료와 비교했을 때 상대적 높았으나 쓴맛을 내는 leucine과 valine의 함량 역시 상대적으로 높음을 알 수 있었다.
- 결과에서 보듯이 5종의 청국장 시료는 모두 농도의존적으로 α-amylase 저해효과가 증가하는 경향을 보였지만, CKJ과 한약재를 첨가한 4종의 청국장(CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)에서 통계적으로 유의적인 차이가 나타나지는 않았다.
- 최근 식이성 유리아미노산에 대한 영양적 가치에 대한 연구보고에 의하면, 식품 내 유리아미노산은 맛난 맛의 증진뿐만 아니라 빠른 흡수 및 근육 단백질의 강화, 그리고 항산화 활성 등에 효과가 있다고 보고되었다[1, 8, 11, 24]. 따라서 본 연구에서는5종의 청국장 분말(CKJ, CKJ-DD, CKJRG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)의 유리아미노산을 분석하였고 그 결과(Table 4), CKJ의 유리아미노산 조성은 Glutamic acid, Lysine, Urea, Phenylalanine, Leucine 등의 순으로 함량이 높았으며, CKJ-DD은 Glutamic acid, Leucine, Lysine, NH3, Valine 등의 순으로 유리아미노산 함량이 우수하였다. CKJ-RG은 Glutamic acid, Ornithine, Valine, Lysine, Phosphoserine 순으로 총 유리아미노산 함량은 0.
- 한편 혈당강하 조절기전과 관련된 항당뇨 활성 결과에서는 농도 의존적으로 혈당상승억제효과가 증가하는 경향을 나타내지만, CKJ과 한약재를 첨가한 청국장(CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJRED) 간의 큰 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 또한 5종의 청국장의 기능성을 알아보기 위해, 총 피놀릭성분의 함량 분석 결과, CKJ에 비해 한약재를 첨가한 청국장(CKJDD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)의 총 피놀릭 함량이 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈다. 항산화 활성(Peroxyl radical 소거능)을 측정한 결과, 10 µg/mL 농도에서 대조군인 CKJ과 비교하여 CKJ-DD은 비슷한 활성을 보였으나 CKJ-RG는 1.
- 따라서 모든 시료는 황색을 주로 띄며 시료간 큰 차이는 없었다. 밝기(명도)를 100단계로 나누어서 수치로 나타내는 L값은 지황청국장이 일반 청국장보다 다소 높은 값을 보였고, 홍삼청국장은 일반청국장에 비해 유의적으로 낮은 값을 보였다. 한편 적색도에서는 홍삼청국장이 가장 높은 값을 나타냈고 그 다음으로 일반청국장이었으며 지황청국장은 가장 낮은 값을 나타냈다.
- 헌터색도계의 a값은 양수(+)일 경우에는 적색, 음수(-)일 경우에는 녹색을 나타낸다. 본 시료의 경우, 색도값이 모두 양수(+)를 갖는 것으로 보아 모든 시료의 색도는 적색을 띄는 것을 알 수 있었다. 양수(+)일 경우에는 황색을 음수(-)일 경우에는 청색을 나타내는 b값은 CKJ-DD, CKJ-RED, CKJ, CKJ-DD+RG,CKJ-RG 순으로 유사하게 나타났으며, 그 값은 모두 양의 값으로 28.
- 일반 청국장과 한약재를 첨가한 CKJ-DD, CKJ-RG, CKJDD+RG, CKJ-RED의 기호도 및 기능성을 측정하였다. 색도분석 결과, 5가지 청국장 모두 브라운 계열이었으며, a값(redness), b값(yellowness)은 5가지 청국장에서 모두 유의적인 차이를 나타냈다. 유리아미노산 분석 결과, 구수한 맛을 나타내는 Aspartic acid, Glutamic acid의 함량이 CKJ보다 한약재를 첨가한 청국장(CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)이 더 많은 함량을 나타났으며, 단맛을 나타내는 alanine, glycine, lysine 또한 CKJ에 비해 한약재를 첨가한 청국장(CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)이 3~4.
- 색도분석 결과, 5가지 청국장 모두 브라운 계열이었으며, a값(redness), b값(yellowness)은 5가지 청국장에서 모두 유의적인 차이를 나타냈다. 유리아미노산 분석 결과, 구수한 맛을 나타내는 Aspartic acid, Glutamic acid의 함량이 CKJ보다 한약재를 첨가한 청국장(CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)이 더 많은 함량을 나타났으며, 단맛을 나타내는 alanine, glycine, lysine 또한 CKJ에 비해 한약재를 첨가한 청국장(CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)이 3~4.5배 더 많은 함량을 나타냈다. 반면, 한약재의 고유한 향에 의해서 쓴맛을 나타내는 leucine은 CKJ에 비해 CKJ-DD, CKJ-RED이 2배의 함량을 더 나타냈다.
- 5배, CKJ-DD+RG은 3배 높은 항산화활성을 나타냈다. 이상의 결과로 다양한 한방청국장 제품의 표준화 및 제품화를 위한 다양한 지표들을 확인 할 수 있었다.
- 이상의 결과로 청국장 발효 시 첨가되는 약용식물의 종류에 따라 최종발효 제품 속의 구수한 맛과 쓴맛 그리고 단맛을 내는 아미노산의 종류 및 함량이 변화됨을 알 수 있었으며, 이를 이용하여 청국장의 맛을 조정 할 수 있음을 알 수 있었다.
- 한편 적색도에서는 홍삼청국장이 가장 높은 값을 나타냈고 그 다음으로 일반청국장이었으며 지황청국장은 가장 낮은 값을 나타냈다. 이상의 결과로 청국장에 첨가되는 약용식물의 종류에 따라 최종 청국장 제품의 색도가 다름을 알 수 있었으며, 대량생산 시 이들 결과를 이용하여 소비자의 기호에 맞는 제품의 색도를 조정할 수 있음을 알 수 있었다.
- 청국장(CKJ), 당귀청국장(CKJ-DD), 지황청국장(CKJ-RG), 당귀지황청국장(CKJ-DD+RG) 그리고 홍삼청국장(CKJ-RED)의 색도의 변화를 Hunter color system으로 측정한 결과(Table 2), 밝기정도인 명도를 나타내는 L값은 CKJ-RG, CKJ, CKJ-DD+RG, CKJ-DD 및 CKJ-RED 분말의 순으로 밝게 나왔으며, 그 값은 각각 60.39, 57.60, 55.90, 46.69, 42.11이었다. 색도를 나타내는 a값은 CKJ-DD, CKJ-RED, CKJ, CKJ-DD+RG 및 CKJ-RG 순으로 나타났으며, 그 값은 각각 11.
- 홍삼청국장의 경우 구수한 맛을 내는 glutamic acid와 단맛을 내는 lysine의 함량이 다른 시료와 비교했을 때 상대적 높았으나 쓴맛을 내는 leucine과 valine의 함량 역시 상대적으로 높음을 알 수 있었다. 한편 일반적으로 한약취를 많게 하기 위하여 사용하는 당귀가 들어간 당귀청국장의 경우는 홍삼청국장과 유사한 경향을 보인 반면 지황청국장의 경우는 구수한 맛, 쓴맛, 단맛을 나타내는 아미노산의 함량이 모두 낮은 것을 알 수 있었다.
- 반면, 한약재의 고유한 향에 의해서 쓴맛을 나타내는 leucine은 CKJ에 비해 CKJ-DD, CKJ-RED이 2배의 함량을 더 나타냈다. 한편 혈당강하 조절기전과 관련된 항당뇨 활성 결과에서는 농도 의존적으로 혈당상승억제효과가 증가하는 경향을 나타내지만, CKJ과 한약재를 첨가한 청국장(CKJ-DD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJRED) 간의 큰 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 또한 5종의 청국장의 기능성을 알아보기 위해, 총 피놀릭성분의 함량 분석 결과, CKJ에 비해 한약재를 첨가한 청국장(CKJDD, CKJ-RG, CKJ-DD+RG, CKJ-RED)의 총 피놀릭 함량이 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈다.
- 항산화 활성(Peroxyl radical 소거능)을 측정한 결과, 10 µg/mL 농도에서 대조군인 CKJ과 비교하여 CKJ-DD은 비슷한 활성을 보였으나 CKJ-RG는 1.5배, CKJ-DD+RG은 3배 높은 항산화활성을 나타냈다.
- 각 조건별 청국장 종류에 따라 유리아미노산 함량이 다르게 나타났으며, 맛과 향미 또한 다르게 나타났다. 홍삼청국장의 경우 구수한 맛을 내는 glutamic acid와 단맛을 내는 lysine의 함량이 다른 시료와 비교했을 때 상대적 높았으나 쓴맛을 내는 leucine과 valine의 함량 역시 상대적으로 높음을 알 수 있었다. 한편 일반적으로 한약취를 많게 하기 위하여 사용하는 당귀가 들어간 당귀청국장의 경우는 홍삼청국장과 유사한 경향을 보인 반면 지황청국장의 경우는 구수한 맛, 쓴맛, 단맛을 나타내는 아미노산의 함량이 모두 낮은 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 이는 한약재 첨가가 청국장 발효 시 혈당상승억제물질의 생산에 큰 영향을 미치지 않았으며 동등한 혈당상승억제 효능을 보이는 것을 시사한다. 따라서 한약재 첨가 청국장의 경우, 일반 청국장과 비교하여 혈당상승억제효과의 증가를 기대하기보다는 향후 첨가된 한약재 특유의 여타 다른 생리활성을 조사하는 것이 필요할 것으로 사료된다.
- 87 mg/100 g GAE으로 총 페놀 함량이 가장 높은 함량을 나타냈으며, CKJ-RG, CKJDD+RG 그리고 CKJ-DD 순이었다. 이러한 결과는 Kim 등이 보고한 홍삼 가공시간에 따른 페놀성 성분 함량의 변화와 일치하는 것이었으며[18], 총 페놀 성분의 분석을 통해 한방청국장의 품질관리가 가능할 것으로 사료된다.
- 발효를 통한 당귀·지황·홍삼의 각종 기능성 페놀성 성분들의 최적화를 통해 총페놀성분 함량, 항산화 활성, 그리고 혈당상승억제 효능의 변화가 이루어지는지를 조사하였으며, 또한 당귀·지황·홍삼을 첨가한 청국장과 일반청국장의 영양 및 기호도 변화를 알아보기 위하여 약용식물 첨가 및 무첨가 청국장의 색도 및 아미노산 조성의 변화에 대하여도 조사하였다. 이러한 연구는 향후 보다 더 다양한 실험을 통해 전통약용식물과 전통발효식품을 접목하여 우리의 전통 기호식품으로서 뿐만 아니라 건강기능성식품으로서의 가치를 향상시키는데 도움이 될 것으로 기대된다.
- 식물계에 널리 분포되어 있는 페놀성 화합물은 다양한 구조와 많은hydroxyl기를 가지고 있어서 free radical scavenging 효과를 통해 항산화 활성을 나타낸다고 보고 되어 있다[10]. 이상의 결과를 통해 총 페놀 성분 함량측정과 함께 항산화 활성의 측정은 한약재 첨가 청국장의 품질관리 지표의 하나로서 사용이 가능할 것으로 사료된다.
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