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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 예비실험 결과 효능을 나타내는 한약재인 유자, 상백피, 오미자, 율무, 당귀, 고삼을 물로 추출한 후 동결건조한 분말에 유산균인 Streptococcus thermophilus를 이용하여 발효한 다음 동결건조한 발효분말의 세포독성, 항염증, tyrosinase 저해효과 및 멜라닌 저해효과를 통하여 항염증 및 미백 효능을 갖는 소재를 연구하고자 하였다.
제안 방법
- 실험에 사용된 한약재는 금산의 한약재상에서 2013년 4월에 구입하여 사용하였다. 각 한약재 10 g씩 전체 60 g을 1 L의 물과 혼합하여 1 h씩 2회 환류 냉각 추출하여 제조하고, 제조된 추출물을 여과지를 사용하여 얻어진 여액을 동결건조하여 건조분말을 얻었다. 이 분말을 -20 ℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 발효분말의 피부염증 완화 효과를 평가하기 위해, Raw 264.7 세포를 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 배지에 10% FBS, 100 units/mL 페니실린(penicillin)과 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycine)을 첨가하여 배양하였다.
- 배양액을 배지흡입기를 이용하여 제거한 후 각 발효분말을 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24 h 동안 37 ℃ 세포배양기에서 배양하였다.
- 세포가 100 mm dish 바닥의 80% 정도까지 자랐을 때 세포의 염증 반응을 유도하기 위하여 1% FBS가 함유된 DMEM 배양액에 LPS(1 µg/mL)를 처리하여, 활성화를 유도한 다음, 각 발효분말의 양(6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg/mL)을 각각 다르게 처리하여 24 h 동안 배양하였다.
- 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후, 분광광도계로 파장 475 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5 mL를 넣은 것을 사용하였고 양성대조군으로는 미백제로 잘 알려진 알부틴을 사용하였다. 상기 각 시료의 tyrosinase 활성 저해율은 다음 식에 따라 계산하였다.
- 종균 단계에서는 Rogosa, and Sharpe (MRS) 배지를 121 ℃에서 20 min 간 멸균한 후 Streptococcus thermophilus를 3 × 106 CFU/mL 되게 접종하였다.
대상 데이터
- Cambrex (UK)로부터 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast)를 구입하였다. 세포 배양용 배지는 Dulbeco’s Modified Eagle’s Media (DMEM)/F12 (3 : 1)를 사용하였으며, 배지에 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 사용하였다.
- Melanocyte line, Melan-a는 D.C. Bennett (St George’s Hospital Medical School, London, UK)에서 분양받았다.
- Tyrosinase는 Sigma사에서 구입하여 사용하였고, 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05 M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1 mg/mL 용액으로 만들어 사용하였다. 발효분말은 0.
- 이 분말을 -20 ℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 동결건조분말은 필요시마다 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시킨 후 사용하였다.
- 1 mg/mL 용액으로 만들어 사용하였다. 발효분말은 0.05 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.
- 6). 본 배양에서는 서울우유 100 mL에 추출 건조분말 1.5 g과 설탕 3 g, 종균액 1 mL을 넣고 혼합한 후 37 ℃에서 48 h 배양하였다. 발효가 완료되면 그 발효액을 여과지(Whatmman No.
- 세포 배양용 배지는 Dulbeco’s Modified Eagle’s Media (DMEM)/F12 (3 : 1)를 사용하였으며, 배지에 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 한약재는 금산의 한약재상에서 2013년 4월에 구입하여 사용하였다. 각 한약재 10 g씩 전체 60 g을 1 L의 물과 혼합하여 1 h씩 2회 환류 냉각 추출하여 제조하고, 제조된 추출물을 여과지를 사용하여 얻어진 여액을 동결건조하여 건조분말을 얻었다.
데이터처리
- 결과값은 3번의 독립적인 실험을 통한 평균과 표준편차로 나타내었다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 Tukey test를 사용하면서 ANOVA검정을 적용하였으며, p < 0.
- 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 Tukey test를 사용하면서 ANOVA검정을 적용하였으며, p < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- Fermented power was added at human dermal fibroblast cells. After 1 day, cell viability was evaluated by SRB method. Each value is the result of mean ± S.
- 배양액을 배지흡입기를 이용하여 제거한 후 각 발효분말을 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24 h 동안 37 ℃ 세포배양기에서 배양하였다. 각 발효분말의 세포독성은 전에 보고된 sulforhodamine B (SRB) 분석법으로 측정하였다[15].
- 5, 25, 50, 100 µg/mL)을 각각 다르게 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 배양액 중의 함유된 산화질소(nitric oxide; NO)의 양은 Griess reagent system을 이용하여 측정하였다[16].
성능/효과
- 각 한약재 추출물(유자, 상백피, 오미자, 율무, 당귀, 고삼) 20 µg/mL의 농도에서 각각 24, 21, 27, 25, 26, 23%의 tyrosinase 저해활성을 나타내었다.
- 더욱이 발효분말은 tyrosinase 활성을 처리농도에 비래하여 억제하였으며, melanin생성도 유의적으로 억제하였다(p < 0.05).
- 또한 발효분말을 500 µg/mL의 농도로 처리하였을 경우 tyrosinase 저해활성은 57%를 나타내었고 양성대조군인 arbutin의 경우는 200 µg/mL의 농도로 처리하였을 경우 tyrosinase 저해활성은 58%를 나타내었다.
- 또한 이러한 발효분말은 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 증가된 NO의 생성을 유의적으로 억제하였다(p < 0.05).
- 발효분말을 6.25 µg/mL의농도로 처리하였을 때 LPS에 의해 증가된 NO의 생성을 82%로 감소시켰으며, 12.5, 25, 50, 100 µg/mL의 농도로 각각 처리한 경우 NO의 생성을 각각 75, 64, 58, 35%로유의성 있게 감소시켰다(p < 0.05).
- 발효분말을 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg/mL의 농도로 증가하면서 처리하였을 때 멜라닌 생성의 저해율은 각각 2.1, 14, 20, 22, 25%로 저해율이 유의적으로 증가함을 알 수 있었다(p < 0.05).
- 또한 NO에 의해 생체 내의 항산화효소가 고갈되면서 피부염증반응이 심화되는 것으로 알려졌다[18]. 본 연구에서 발효분말의 처리농도가 증가할수록 NO의 생성은 농도의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 따라서 발효분말은 피부염증에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 많은 연구에서 한약재 추출물들은 tyrosinase 저해활성을 나타낸다고 보고하였다[7,8,20]. 본 연구에서도 발효분말을 처리하였을 때 농도의존적으로 tyrosinase 저해활성율이 높아지는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 05). 따라서 발효분말은 세포독성이 없으면서 피부미백효과를 기대할 수 있을 것으로 생각되며, 이를 응용하여 화장품소재로서의 개발 가능성을 시시한다.
- 발효분말은 전 처리농도에서 피부섬 유아세포(Human dermal fibroblast)에 대해 약 100%의 세포생존율을 나타내었다. 따라서 발효분말은 피부세포에 독성이 없게 나타났으므로 미용소재로써 사용가능할 것으로 생각된다
- 본 연구에서 발효분말의 처리농도가 증가할수록 NO의 생성은 농도의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 따라서 발효분말은 피부염증에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
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