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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전통 발효식품인 김치 및 젓갈류로부터 ACE 저해활성이 우수한 젖산균을 분리하여, 향후 분리 균주를 이용한 항고혈압 발효유의 개발을 위한 starter로서의 가능성을 제시하고자 하며 또한 우리나라 전통 발효식품으로부터 분리한 균주의 생리적 특성을 조사하고, 전통 발효식품의 우수성에 대한 자료를 제공하고자 한다.
- 본 연구는 우리나라 전통 발효식품인 장류, 김치류 및 젓갈류로부터 angiotensin converting enzyme 저해활성이 우수한 젖산균을 분리하고자 하였다. 젖산균을 분리하기 위한 선택배지로서 bromocresol purple (BCP) 한천배지를 사용하여 1차적으로 젖산균을 분리하였으며, 그 중 angiotensin converting enzyme 저해활성이 우수한 균주를 최종 선발하였다.
제안 방법
- , Japan)을 함유한 BCP 한천배지를 사용하였으며, 준비된 시료를 마쇄한 후 평판희석 도말법을 이용하여 BCP 한천배지에 10-5-10-6 수준으로 희석하여 도말한 후, 37℃에서 48시간 배양하면서 균체 주변에 노란색을 형성하는 균주를 1차로 선별하였다. 1차 선별된 균주들은 BCP 한천배지에 다시 계대 배양하여 순수분리 하였고, 여기서 선발된 균주는 DeMan Rogosa Sharpe (MRS, Difco, USA) 한천배지에서 계대 배양하여 활성화 시킨 후 MRS 액체배지에 접종하여 48시간 배양한 후, ACE 저해활성을 측정하고 활성이 높은 균주들을 2차로 선발하였다.
- ACE 저해활성의 측정은 Cushman과 Cheung의 방법(8)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 시료 100 μl에 100 mM sodium borate buffer (pH 8.
- 분리된 젖산균은 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 동정하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 27F primer(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)와 1492R primer(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR 증폭과정은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 45초 반응을 30회 반복 시행하였으며, 72℃에서 10분간 반응 후 4℃로 내려 종료하였다. 증폭된 PCR 산물은 PCR purification kit (Solgent, Korea)로 정제한 후 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer, USA)를 사용하여 염기서열 분석을 위한 PCR을 수행한 후 ABI 3730XL capillary DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA)로 결과를 분석하였다.
- 다음 20종의 항생제 [amikacin (30 μg), neomycin (30 μg), streptomycin (10 μg), gentamycin (10 μg), kanamycin (30 μg), cefmetazole (30 μg), cefoxatin (30 μg), ceftnaxone (30 μg), cephalothin (30 μg), ampicillin (10 μg), penicillin (10 units), ticarcillin (75 μg), sulbactam+ampicillin (20 μg), amoxicillin+clavulanic acid (30 μg), tetracycline (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), nalidixic acid (30 μg), lincomycin (2 μg), chloramphenicol (30 μg), sulfamethoxazole+trime thoprim (23.75 μg/1.25 μg)]가 함유된 paper disc (BD BBLTM Sensi-DiscTM)를 올려 34℃에서 24시간 배양한 후 디스크 주변에 형성된 투명환의 직경을 측정하여 감수성정도를 측정하였다.
- 분리된 젖산균은 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 동정하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 27F primer(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)와 1492R primer(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다.
- 선발된 젖산균의 생장은 생육도와 pH의 변화로 측정하였다. 생육도는 MRS 액체배지에 젖산균을 접종한 후 34, 37 및 40℃에서 36시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 시료를 취하고, UV-VIS spectrophotometer (Hewlett Packard 8453, Germany)로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 선발된 젖산균의 내담즙성은 Gilliland와 Speck의 방법(11)을 변형하여 사용하였으며 MRS 액체배지에 0.3, 0.5 및 1.0% bile extract (Sigma)를 첨가하고 34℃에서 24시간 배양된 균주를 2%로 접종하여 34℃에서 30시간 동안 배양하면서 시간대별 생육도를 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 선발된 젖산균의 내산성은 Clark 등의 방법(7)을 변형하여 사용하였으며 1 N HCl을 증류수에 희석하여 MRS 산성 액체 배지(pH 1.0, 2.0 및 3.0)와 MRS 중성 액체배지(pH 6.3)를 준비하고 34℃에서 24시간 배양된 균주를 1%로 접종하여 34℃에서 120분간 배양하면서 30분 간격으로 sampling하여 BCP 한천 배지에 도말하여 34℃에서 36시간 배양한 후 균체수를 계수하였다.
- 선발된 젖산균의 생장은 생육도와 pH의 변화로 측정하였다. 생육도는 MRS 액체배지에 젖산균을 접종한 후 34, 37 및 40℃에서 36시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 시료를 취하고, UV-VIS spectrophotometer (Hewlett Packard 8453, Germany)로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 선발된 젖산균의 항생제 내성은 Charteris 등이 기술한 방법(3)을 일부 변형하여 사용하였다. 즉, MRS 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 L.
- 분리시료는 강원도, 경북, 충북 등에서 제조원이 다른 장류, 김치류 및 젓갈류로 부터 젖산균을 분리하여 실험에 사용하였다. 젖산균을 분리하기 위한 선택배지로는 bromocresol purple(BCP, Eiken chemical Co., Japan)을 함유한 BCP 한천배지를 사용하였으며, 준비된 시료를 마쇄한 후 평판희석 도말법을 이용하여 BCP 한천배지에 10-5-10-6 수준으로 희석하여 도말한 후, 37℃에서 48시간 배양하면서 균체 주변에 노란색을 형성하는 균주를 1차로 선별하였다. 1차 선별된 균주들은 BCP 한천배지에 다시 계대 배양하여 순수분리 하였고, 여기서 선발된 균주는 DeMan Rogosa Sharpe (MRS, Difco, USA) 한천배지에서 계대 배양하여 활성화 시킨 후 MRS 액체배지에 접종하여 48시간 배양한 후, ACE 저해활성을 측정하고 활성이 높은 균주들을 2차로 선발하였다.
- 본 연구는 우리나라 전통 발효식품인 장류, 김치류 및 젓갈류로부터 angiotensin converting enzyme 저해활성이 우수한 젖산균을 분리하고자 하였다. 젖산균을 분리하기 위한 선택배지로서 bromocresol purple (BCP) 한천배지를 사용하여 1차적으로 젖산균을 분리하였으며, 그 중 angiotensin converting enzyme 저해활성이 우수한 균주를 최종 선발하였다. 분리된 젖산균을 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정한 결과 Lactobacillus brevis ATCC 14869T와 99.
- 조사된 젖산균의 염기서열 결과는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Blast 검색을 통해 GenBank data base에 수록되어 있는 16S rRNA 유전자 염기 서열과 비교⋅분석하였다.
- 선발된 젖산균의 항생제 내성은 Charteris 등이 기술한 방법(3)을 일부 변형하여 사용하였다. 즉, MRS 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 L. brevis HLJ59를 MRS 한천배지와 잘 혼합한 후 평판 배양한 다음 약 1시간 동안 방치하였다. 다음 20종의 항생제 [amikacin (30 μg), neomycin (30 μg), streptomycin (10 μg), gentamycin (10 μg), kanamycin (30 μg), cefmetazole (30 μg), cefoxatin (30 μg), ceftnaxone (30 μg), cephalothin (30 μg), ampicillin (10 μg), penicillin (10 units), ticarcillin (75 μg), sulbactam+ampicillin (20 μg), amoxicillin+clavulanic acid (30 μg), tetracycline (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), nalidixic acid (30 μg), lincomycin (2 μg), chloramphenicol (30 μg), sulfamethoxazole+trime thoprim (23.
- PCR 증폭과정은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 45초 반응을 30회 반복 시행하였으며, 72℃에서 10분간 반응 후 4℃로 내려 종료하였다. 증폭된 PCR 산물은 PCR purification kit (Solgent, Korea)로 정제한 후 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer, USA)를 사용하여 염기서열 분석을 위한 PCR을 수행한 후 ABI 3730XL capillary DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA)로 결과를 분석하였다. 조사된 젖산균의 염기서열 결과는 NCBI (http://www.
대상 데이터
- 강원도, 경북, 충북 등에서 제조원이 다른 전통발효식품 중장류, 김치류 및 젓갈류의 각 시료 1 g을 멸균된 0.85% 생리식염수 용액으로 단계희석하고, BCP 한천 배지에 도말하여 형광색의 집락을 형성하는 나타내는 68종의 균주를 1차적으로 선발하였다. 선발된 균주들을 MRS 한천 배지에 2회 계대 배양하여 순수 분리된 균주들을 MRS 액체배지에 접종하여 34℃에서 36시간 정치 배양하였다.
- 선발된 균주들을 MRS 한천 배지에 2회 계대 배양하여 순수 분리된 균주들을 MRS 액체배지에 접종하여 34℃에서 36시간 정치 배양하였다. 배양 상등액을 원심분리하여 ACE 저해활성을 측정하였으며 그 중 ACE 저해활성을 나타내는 균주 중에서 ACE 저해활성이 98.8%로 가장 높은 HLJ59를 본 연구의 최종 실험 균주로 선발하였다(Table 1).
-
젖산균의 분리
분리시료는 강원도, 경북, 충북 등에서 제조원이 다른 장류, 김치류 및 젓갈류로 부터 젖산균을 분리하여 실험에 사용하였다. 젖산균을 분리하기 위한 선택배지로는 bromocresol purple(BCP, Eiken chemical Co.
성능/효과
- 9×108/ml)을 2% (v/v)로 접종한 후 각 온도별로 4시간 간격으로 36시간 동안 배양한 결과, 각각의 온도에서 균주의 생장과 pH의 변화가 비슷한 패턴을 보였으나 34℃가 최적의 온도로 조사되었다. 16시간째부터 생육이 증가하기 시작하여 24시간 배양 하였을 때 가장 우수한 생육을 나타내었으며 이후는 점차 감소하는 것으로 나타났다. 균주의 생육에 따른 pH의 변화는 8시간째부터 산생성능이 높아지기 시작하여 배양 20시간째에 가장 높은 산생성능을 보였으며 이후에는 일정한 수준을 유지하였다.
- L. brevis HLJ59는 내산성의 경우 pH가 2.0, 3.0으로 보정된 DeMan Rogosa Sharpe 액체배지에서 접종 후 각각 90분, 30분이 경과하였을 때 배양초기와 비교 시 약 99% 감소하는 결과를 보였으나, 담즙산(Bile extract)의 경우 1% 첨가 시에도 생육에 저해를 받지 않는 것으로 조사되어 L. brevis HLJ59 균주는 담즙산에 대한 내성이 우수한 균주임을 확인하였다.
- 각종 항생제에 대한 감수성의 조사 결과 Fig. 4와 같이 aminoglycosides계의 amikacin (30 μg), gentamycin (10 μg), neomycin (30 μg), streptomycin (10 μg)에 감수성을 보였고, kanamycin (30 μg)은 약간의 감수성을 보였으며, cephalosporin계의 cefmetazole (30 μg), cephalothin (30 μg), β-lactam penicillins계의 ampicillin (10 μg), ticarcillin (75 μg), sulbactam+ampicillin (20 μg), β-lactam+β-lactamase inhibitor 복합계의 amoxicillin+clavulanic acid (AMC, 30 μg), tetracyclines계의 tetracycline (30 μg) 및 기타 sulfamethoxazole+trime thoprim (SXT, 23.75 μg/1.25 μg)에 대하여 감수성을 나타내 었다.
- 16시간째부터 생육이 증가하기 시작하여 24시간 배양 하였을 때 가장 우수한 생육을 나타내었으며 이후는 점차 감소하는 것으로 나타났다. 균주의 생육에 따른 pH의 변화는 8시간째부터 산생성능이 높아지기 시작하여 배양 20시간째에 가장 높은 산생성능을 보였으며 이후에는 일정한 수준을 유지하였다. 이러한 결과는 Jeon (13)이 보고한 L.
- 3과 같다. 그 결과 담즙을 첨가하지 않은 대조구와 비교하였을 때 배양 15시간 전까지는 첨가구 모두에서 생육에 저해를 받았으나, 담즙에 대한 적응기간을 거친 15시간 이후부터는 오히려 대조구 보다도 생육이 더 활발하게 일어남을 알 수 있었다. 이는 L.
- 1). 따라서 본 연구에서 분리한 HLJ59 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석결과를 토대로 L. brevis HLJ59로 명명하였다.
- brevis HLJ59의 내산성을 조사한 결과는 Table 2와 같다. 분리균주의 내산성 측정을 위한 대조구로서 pH를 6.3으로 보정한 MRS 액체배지에서 120분간 배양하였을 때 배양시간이 경과함에 따라 균체수는 배양초기와 비교시 약 11% 증가하는 것을 알 수 있었다. 하지만 pH를 3.
- 젖산균을 분리하기 위한 선택배지로서 bromocresol purple (BCP) 한천배지를 사용하여 1차적으로 젖산균을 분리하였으며, 그 중 angiotensin converting enzyme 저해활성이 우수한 균주를 최종 선발하였다. 분리된 젖산균을 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정한 결과 Lactobacillus brevis ATCC 14869T와 99.7%의 유사도를 나타냄에 따라 L. brevis HLJ59로 명명하였다.
- 최종 선발된 HLJ59 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 얻은 1,468 bp의 염기서열을 NCBI의 GenBank에 등록된 염기서열 data base와 비교하여 본 결과 L. brevis의 표준 균주인 ATCC 14869T 균주의 염기서열과 99.7%의 유사도를 나타내었다(Fig. 1). 따라서 본 연구에서 분리한 HLJ59 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석결과를 토대로 L.
- 3으로 보정한 MRS 액체배지에서 120분간 배양하였을 때 배양시간이 경과함에 따라 균체수는 배양초기와 비교시 약 11% 증가하는 것을 알 수 있었다. 하지만 pH를 3.0, 2.0 및 1.0으로 보정한 MRS 액체배지에서 120분간 배양하였을 경우에는 배양시간이 경과함에 따라 균체수는 감소하는 것을 확인 할 수 있었으며, MRS 액체배지의 pH를 3.0으로 보정한 경우 90분이 경과하였을 때 배양초기와 비교시 약 99% 감소하였으며, pH를 2.0으로 보정한 경우 30분이 경과하였을 때 배양초기와 비교시약 99% 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 한편 cephalosporin계의 cefoxatin (30 μg), ceftnaxone (30 μg), penicillin계의 penicillin (10 units), quinolones계 ciprofloxacin (5 μg), nalidixic acid (30 μg), lincosamid계의 lincomycin (2 μg) 및 기타 chloramphenicol (30 μg)에 대해서는 내성을 가지고 있음을 확인하였다.
- 항생제 내성의 경우 20종의 항생제를 paper disc법으로 조사한 결과 본 균주는 cephalosporin계의 cefoxatin (30 μg), ceftnaxone (30 μg), penicillin계의 penicillin (10 units), quinolones계 cprofloxacin (5 μg), nalidixic acid (30 μg), lincosamid계의 lincomycin (2 μg) 및 기타 chloramphenicol (30 μg)에 대해서는 내성을 가지고 있음을 확인하였다.
후속연구
- 이러한 결과는 Kang(16)에 따르면 Lactobacillus는 사람과 동물의 소화관 등에 많이 서식하는 미생물로서, 대표적인 전통발효식품 중에 하나인 김치내의 항생제 내성 Lactobacillus가 내성 운반수단으로 작용하고, 장내 세균군에 내성 유전자를 전달할 수 있는 저장고로 기능할 가능성이 있다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 분리한 L. brevis HLJ59 균주 또한 Lactobacillus 속의 균주로서 항생제에 대한 내성이 장내 세균군으로 전이될 가능성이 있으므로 이에 대한 실험이 필요하다 생각된다. 또한, 항생제 오·남용으로 인해 발생하는 장내 젖산균 활동이 저해되어, 향후 젖산균을 probiotics로 사용하기 위한 균주 선택에 있어 중요한 기초자료가 될 수 있을 것이다.
- brevis HLJ59 균주를 이용한 항고혈압 활성이 뛰어난 요쿠르트, 발효음료, 발효김치 등의 다양한 발효 식품으로의 접근 가능성과 현재 연구 중인 마 활용성을 증대시키기 위한 발효마의 개발을 통한 기능성 마 첨가 발효유 등에 본 균주가 활용될 수 있고, 현재 이에 대한 실험이 진행 중에 있다. 또한 본 연구에서 분리된 L. brevis HLJ59 균주의 특성을 이용하여 향후 발효유 제조에 사용되고 있는 수입 균주의 대체 또한 가능하리라 판단된다.
- 또한, 항생제 오·남용으로 인해 발생하는 장내 젖산균 활동이 저해되어, 향후 젖산균을 probiotics로 사용하기 위한 균주 선택에 있어 중요한 기초자료가 될 수 있을 것이다.
- 이러한 결과를 바탕으로 L. brevis HLJ59 균주를 이용한 항고혈압 활성이 뛰어난 요쿠르트, 발효음료, 발효김치 등의 다양한 발효 식품으로의 접근 가능성과 현재 연구 중인 마 활용성을 증대시키기 위한 발효마의 개발을 통한 기능성 마 첨가 발효유 등에 본 균주가 활용될 수 있고, 현재 이에 대한 실험이 진행 중에 있다. 또한 본 연구에서 분리된 L.
- 그러나 Park (21)의 보고에 따르면 대부분의 Bifidobacterium과 Lactobacillus는 비교적 담즙산에 약하였으나 몇 종류의 균주는 강한 담즙산 내성을 보인다고 하였으며, Lactobacillus의 경우 균종간의 차이보다는 각 균주별 내성 능력의 차이에 기인된 것이라 보고하였다. 이러한 결과를 바탕으로 향후 답즙산에 내성능을 가지고 있는 L. brevis HLJ59를 probiotics로 활용하는 측면에서 볼 때 매우 우수한 균주라 판단된다.
- 0 이하의 강산성 이지만 음식물 섭취 후 침과 음식으로 인해 희석되므로 균의 생존율은 보다 높아 질 것으로 추정된다고 하였다(23). 하지만 분리 균주의 pH에 대한 안정성을 높여 주기 위한 조건들에 대해서는 좀 더 검토할 필요가 있다고 사료된다.
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