선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 하지만, 아직까지 여러 환경 시료에서 mcyA 유전자의 다양성에 대해서는 많이 알려지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 mcyA 유전자 염기서열을 이용하여 개발된 분자생물학적 지표를 이용하여, 국내의 여러 대표적인 호수를 대상으로 microcystins의 농도 및 종류와 mcyA 유전자의 염기서열 다양성을 분석하였다.
- 본 연구에서 국내 대형 호수를 대상으로 조류 독소인 microcystins의 생합성에 관여하는 유전자의 염기서열 다양성을 분석하였다. 국내 호소에서 분리된 Microcystis 속과 수시료에서 mcyA 유전자를 분석한 결과, 외국의 호소와 달리 다양성이 매우 낮은 것으로 나타났다.
제안 방법
- 반응액 50 μl에 10 ng의 주형 DNA를 더하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분간 전처리한 후, 변성(95℃, 30초), 결합(54℃, 40초), 중합(72℃, 40초) 단계를 30주기 수행하였으며, 72℃에서 10분간 후처리를 하였다. PCR을 위한 thermal cycler는 MJ Mini Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)를 사용하였다.
- mcyA 유전자를 증폭하기 위해 mcyA-Cd 1F (5′-AAA AGT GTT TTA TTA GCG GCT CAT-3′)와 mcyA-Cd 1R (5′-AAA ATT AAA AGC CGT ATC AAA-3′)을 PCR primer로 사용하였다(7).
- 국내에서 분리된 독소생산 Microcystis 속과 조류 대발생 시기에 대청호, 충주호, 용담호, 소양호, 및 의암호에서 채취한 시료에서 조류 독소인 microcystins의 생합성에 관여하는 mcyA 유전자의 염기서열 다양성을 분석하였다. GenBank에 등록된 mcyA 염기서열과 비교한 결과, 국내 호소에서 분리된 Microcystis 속의 mcyA 유전자 염기서열은 매우 낮은 다양성을 나타내었다.
- 남조세균을 배양하기 위하여 25±1℃를 유지한 배양실에서 150 rpm으로 교반하였으며, 14시간의 명기(약 40 μE/m2/sec 강도의 빛)와 10시간의 암기를 교대로 반복하였다.
- 남조세균의 파쇄 효율을 높이기 위해 급속 해냉동(-70°C/ 60°C, 각각 15분) 처리를 3회 실시하였다.
- 반응액 50 μl에 10 ng의 주형 DNA를 더하여 PCR을 수행하였다.
- 배양된 남조세균 및 수시료로부터 genomic DNA의 추출은 Rhochelle 등(24)의 방법을 변형시켜 사용하였다. 배양된 남조세균의 경우, 배양액을 22,000×g에서 10분간 원심분리한 후, lysozyme이 포함된 완충용액(0.
- 엽록소 a의 농도를 측정하기 위해 적당량의 시료를 GF/C 여과지(Whatman, UK)로 여과한 후, 아세톤 용액(90%, v/v)으로 여과지의 색소를 추출하였다. 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)로 추출액의 흡광도를 측정한 결과를 이용하여 엽록소 a의 농도를 계산하였다(2).
- Ampicillin (50 μg/ml)과 kanamycin (50 μg/ml)이 포함된 LB 배지에서 1일 간 배양한 후, 시료 당 약 100개의 colony를 무작위로 선택하였다. 선택된 colony에 PCR 산물이 삽입된 것을 확인하기 위하여, mcyA-Cd 1F/mcyA-Cd 1R을 primer로 사용하여 다시 PCR을 수행하였다. 염기서열은 Solgent에 의뢰하여 분석하였으며, DNA 분석기는 ABI PRISM 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하였다.
- 수시료에 포함된 microcystins의 농도를 측정하기 위하여, 시료를 GF/C 여과지로 여과한 후, Maatouk 등(15)의 방법을 일부 변형시켜 추출 정제하였다. 여과지에 methanol 용액(75%, v/v)을 첨가한 후, 강한 vortexing을 3분간 수행하였다.
- 수시료에서 mcyA 유전자에 대한 library를 구축하기 위하여, PCR 산물을 PCR Purification kit (TaKaRa, Japan)로 정제한 후, T-blunt vector (Solgent, Korea)를 사용하여 클로닝을 하였다. Ampicillin (50 μg/ml)과 kanamycin (50 μg/ml)이 포함된 LB 배지에서 1일 간 배양한 후, 시료 당 약 100개의 colony를 무작위로 선택하였다.
- 용액 중 DNA는 phenol:chloroform법을 사용하여 정제하였다. 수시료의 경우, GF/C 여과지로 시료를 여과한 후, lysozyme 완충용액 및 SDS 완충용액, 초음파세척기, 및 3회의 급속해냉동법을 실시하였으며, 사용된 완충용액의 조성 및 물리적 처리 조건은 배양된 남조세균에서 DNA를 추출하는 조건과 동일하게 사용하였다.
- 05%, v/v)가 포함된 acetonitrile/water (32%: 68%)를 이동상으로 사용하였다. 순수한 microcystins -LR, -YR, -RR (Wako Pure Chemical Ind., Japan)을 외부 표준물질로 사용하여, microcystins의 peak를 판별하고 정량하였다.
- 채취된 시료는 냉장 상태를 유지하여 실험실로 옮긴 후, 분석하였다. 엽록소 a의 농도를 측정하기 위해 적당량의 시료를 GF/C 여과지(Whatman, UK)로 여과한 후, 아세톤 용액(90%, v/v)으로 여과지의 색소를 추출하였다. 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)로 추출액의 흡광도를 측정한 결과를 이용하여 엽록소 a의 농도를 계산하였다(2).
- 대청호의 경우 2007년 10월과 2008년 7월에 시료를 채취하였고, 나머지 호수에서는 2008년 6월과 9월에 걸쳐 시료를 채취하였다. 채취된 시료는 냉장 상태를 유지하여 실험실로 옮긴 후, 분석하였다. 엽록소 a의 농도를 측정하기 위해 적당량의 시료를 GF/C 여과지(Whatman, UK)로 여과한 후, 아세톤 용액(90%, v/v)으로 여과지의 색소를 추출하였다.
- 0)을 넣고 37°C에서 1시간 동안 처리하였다. 처리된 용액에 SDS가 포함된 완충용액[0.1 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl, 6%(w/v) SDS, pH 8.0]을 넣고 5 분간 초음파세척기(150W, 대한과학, Korea)를 처리하여 남조세균을 파쇄하였다. 남조세균의 파쇄 효율을 높이기 위해 급속 해냉동(-70°C/ 60°C, 각각 15분) 처리를 3회 실시하였다.
대상 데이터
- Ampicillin (50 μg/ml)과 kanamycin (50 μg/ml)이 포함된 LB 배지에서 1일 간 배양한 후, 시료 당 약 100개의 colony를 무작위로 선택하였다.
- Microcystins는 UV 흡광 검출기(UV 725S; 영린과학, Korea)와 Xterra RP18 column (5 μm 입자크기, 15 cm×3.9 mm I.D.; Waters)이 장착된 HPLC를 사용하여 정량하였으며, trifluoroacetic acid (0.05%, v/v)가 포함된 acetonitrile/water (32%: 68%)를 이동상으로 사용하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 3분간 전처리한 후, 변성(95℃, 30초), 결합(54℃, 40초), 중합(72℃, 40초) 단계를 30주기 수행하였으며, 72℃에서 10분간 후처리를 하였다. PCR을 위한 thermal cycler는 MJ Mini Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)를 사용하였다.
- GenBank에 올려진 mcyA 유전자 염기서열은 517개(2010년 4월 1일 기준)이며, Microcystis 속에 대한 결과가 전체의 81%로 가장 많다. mcyA 유전자의 condensation region을 대상으로 개발된 PCR primer인 mcyA-Cd 1F/mcyA-Cd 1R (7)로 증폭된 염기서열은 359개로 전체의 69%이다. 현재 까지 알려진 염기서열에 따르면, 이 primer set를 사용하여 증폭하였을 때 Anabaena, Planktothrix 및 Nostoc 속으로부터 297 bp의 산물이 만들어지며, Microcystis sp.
- Microcystis 중 NIER로 표시된 6종은 대청호, 팔당호, 소양호, 영천호 및 안계호에서 분리된 것으로 국립환경과학원(National Institute of Environmental Research, NIER)으로부터 제공을 받았으며, 3종(CBE-08, CBE-12, CBE-29)은 대청호와 용담호에서 분리된 종이다(14). 남조세균의 배양 배지는 CB 배지를 사용하였다(26). 남조세균을 배양하기 위하여 25±1℃를 유지한 배양실에서 150 rpm으로 교반하였으며, 14시간의 명기(약 40 μE/m2/sec 강도의 빛)와 10시간의 암기를 교대로 반복하였다.
- 분석에 사용된 수시료는 대청호, 용담호, 충주호, 의암호, 소양호에서 채취하였다(Table 2). 대청호의 경우 2007년 10월과 2008년 7월에 시료를 채취하였고, 나머지 호수에서는 2008년 6월과 9월에 걸쳐 시료를 채취하였다. 채취된 시료는 냉장 상태를 유지하여 실험실로 옮긴 후, 분석하였다.
- 이러한 결과로 판단할 때, 본 연구에서 분석한 시료에서 microcystins를 생산하는 Anabaena 속은 없거나 매우 적은 농도로 존재하는 것으로 보인다. 본 연구의 대상호소는 5개이며, 특정 시점에 채취한 시료를 대상으로 분석한 것이기 때문에, 국내 수생태계에 microcystins를 생성하는 Anabaena 속의 존재 여부에 대한 것은 확실하지 않다.
- 분석에 사용된 수시료는 대청호, 용담호, 충주호, 의암호, 소양호에서 채취하였다(Table 2). 대청호의 경우 2007년 10월과 2008년 7월에 시료를 채취하였고, 나머지 호수에서는 2008년 6월과 9월에 걸쳐 시료를 채취하였다.
- 실험에 사용된 독소 생산 Microcystis의 종류를 Table 1에 나타내었다. Microcystis 중 NIER로 표시된 6종은 대청호, 팔당호, 소양호, 영천호 및 안계호에서 분리된 것으로 국립환경과학원(National Institute of Environmental Research, NIER)으로부터 제공을 받았으며, 3종(CBE-08, CBE-12, CBE-29)은 대청호와 용담호에서 분리된 종이다(14).
데이터처리
- 국내 호소에서 분리된 남조세균의 염기서열의 GenBank 분류번호는 Table 1에 나타내었으며, 수시료에서 얻은 clone의 염기 서열은 GenBank 분류번호 HM003174-HM003178과 HM064483-HM064494에 수록되었다. 분석된 염기서열은 CLUSTALW2 (11)로 정렬한 후, 각 시료에서 동일한 clone의 출현 빈도를 계산하였다. 유전학적 계통분석은 MEGA4 (27)를 사용하였으며, 계통도는 neighbor-joining tree algorithm을 사용하여 얻었다.
이론/모형
- Phylogenetic tree based on the partial sequences of mcyA gene in microcystin-producing cyanobacteria. The tree was constructed by using the neighbor-joining method. Strains isolated from the Korean freshwaters were indicated in bold-face.
- 선택된 colony에 PCR 산물이 삽입된 것을 확인하기 위하여, mcyA-Cd 1F/mcyA-Cd 1R을 primer로 사용하여 다시 PCR을 수행하였다. 염기서열은 Solgent에 의뢰하여 분석하였으며, DNA 분석기는 ABI PRISM 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. 국내 호소에서 분리된 남조세균의 염기서열의 GenBank 분류번호는 Table 1에 나타내었으며, 수시료에서 얻은 clone의 염기 서열은 GenBank 분류번호 HM003174-HM003178과 HM064483-HM064494에 수록되었다.
- 남조세균의 파쇄 효율을 높이기 위해 급속 해냉동(-70°C/ 60°C, 각각 15분) 처리를 3회 실시하였다. 용액 중 DNA는 phenol:chloroform법을 사용하여 정제하였다. 수시료의 경우, GF/C 여과지로 시료를 여과한 후, lysozyme 완충용액 및 SDS 완충용액, 초음파세척기, 및 3회의 급속해냉동법을 실시하였으며, 사용된 완충용액의 조성 및 물리적 처리 조건은 배양된 남조세균에서 DNA를 추출하는 조건과 동일하게 사용하였다.
- 분석된 염기서열은 CLUSTALW2 (11)로 정렬한 후, 각 시료에서 동일한 clone의 출현 빈도를 계산하였다. 유전학적 계통분석은 MEGA4 (27)를 사용하였으며, 계통도는 neighbor-joining tree algorithm을 사용하여 얻었다.
- Microcystin 생합성 유전자의 염기서열은 분리된 Microcystis sp.의 독소 생산능을 평가하거나(7, 14), mcy gene의 진화학적 연관성(20), 환경 시료에서 유전자 염기 서열 다양성(23), 및 실시간 PCR을 이용한 독소생산 Microcystis의 계수(28) 등의 연구에 활용되었다. 국내에서는 주로 Microcystis의 독소 생산 여부를 확인하기 위한 분자생물학적 지표를 개발하는 연구가 이루어졌다(3, 12, 13).
성능/효과
- 국내에서 분리된 독소생산 Microcystis 속과 조류 대발생 시기에 대청호, 충주호, 용담호, 소양호, 및 의암호에서 채취한 시료에서 조류 독소인 microcystins의 생합성에 관여하는 mcyA 유전자의 염기서열 다양성을 분석하였다. GenBank에 등록된 mcyA 염기서열과 비교한 결과, 국내 호소에서 분리된 Microcystis 속의 mcyA 유전자 염기서열은 매우 낮은 다양성을 나타내었다. 환경 시료 분석 결과, 2-3종류의 clone이 전체의 87-100%를 차지하였으며, Anabaena 속이나 Planktothrix 속의 mcyA 유전자와 유사한 염기서열은 발견되지 않았다.
- 3). Microcystins의 농도가 낮은 의암호, 소양호, 용담호 시료의 경우 clone의 종류가 2-3개로 다양성이 매우 낮았다. 현미경으로 관찰하였을 때, Microcystis 속 이외의 다른 남조세균이 거의 관찰되지 않은 충주호 시료에서는 microcystins의 농도는 14.
- Phycocyanin β subunit와 α subunit 사이의 intergenic spacer의 길이는 남조세균에 따라 다르며, GenBank에 등록된 염기서열을 분석하면 Microcystis 속의 경우 66 bp가 전체의 95%이며, Anabaena 속의 경우에는 76-103 bp의 길이이며 61%가 99 bp 길이를 나타낸다.
- 국내 5개의 호수에서 채취한 시료에서 mcyA 유전자 염기서열을 분석한 결과, mcyA-Cd 1F/mcyA-Cd 1R을 사용하여 PCR을 수행하였을 때 291 bp 길이의 산물이 생성되었으며, 모든 clone이 Microcystis 속과 유사성이 큰 것으로 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 대상 지역에서 독소를 생산하는 Anabaena 속 또는 Planktothrix 속이 존재하지 않거나, 매우 적은 수가 존재함을 의미한다.
- 본 연구에서 국내 대형 호수를 대상으로 조류 독소인 microcystins의 생합성에 관여하는 유전자의 염기서열 다양성을 분석하였다. 국내 호소에서 분리된 Microcystis 속과 수시료에서 mcyA 유전자를 분석한 결과, 외국의 호소와 달리 다양성이 매우 낮은 것으로 나타났다. 국내 수생태계에서 제한된 종류의 microcystins가 검출되는 결과와 비교할 때, 이는 mcy 유전자의 낮은 다양성에 기인할 가능성이 있다.
- 대상 시료에서 특정 clone의 빈도를 조사한 결과, 모든 시료에서 두 종류의 clone이 우점하는 것으로 나타났다(Fig. 3). Microcystins의 농도가 낮은 의암호, 소양호, 용담호 시료의 경우 clone의 종류가 2-3개로 다양성이 매우 낮았다.
- 대상 호소 중 소양호를 제외하고, 엽록소 a의 농도는 33.7-64.2 mg/L의 범위로 매우 높게 나타나 조사 시점에 심한 조류 대발생이 일어났음을 확인할 수 있었다(Table 2). 2001년부터 2008년까지 대청호 지역의 댐 수문자료(한국수자원공사, www.
- 6 μg/L의 범위였다(Table 2). 대청호를 제외한 모든 시료에서 microcystin-RR 만 검출되었으며, 대청호의 경우에는 microcystin-YR 및 -LR이 각각 20, 2.6%가 있었으나 microcystin-RR의 농도가 가장 높았다(Table 2). 이러한 결과는 국내 호소에서 microcystin-RR이 가장 많다는 기존의 연구 결과와 일치하는 것이다(10, 18).
- 또한 남조세균이 만드는 색소의 일종인 phycocyanin 유전자에 대한 PCR primer로 널리 사용되는 PCβF/PCαR (16)을 사용하여 대상 시료를 분석하였을 때, Anabaena에 해당되는 clone이 용담호와 대청호에서 각각 49%와 40%를 차지하였다(결과 미제시).
- 본 실험에서 분석한 모든 시료에서 microcystins의 농도는 1.0 μg/L 이상이지만, 이 결과를 WHO 기준과 비교하기는 어렵다고 판단된다.
- 2). 이러한 결과는 대상 지역에서 독소를 생산하는 Anabaena 속 또는 Planktothrix 속이 존재하지 않거나, 매우 적은 수가 존재함을 의미한다. 현미경으로 대상 시료를 관찰하였을 때, 용담호 및 대청호 시료에서 다수의 Anabaena가 존재하는 것이 관찰되었다.
- 환경 시료 분석 결과, 2-3종류의 clone이 전체의 87-100%를 차지하였으며, Anabaena 속이나 Planktothrix 속의 mcyA 유전자와 유사한 염기서열은 발견되지 않았다. 이러한 결과로 볼 때, 대상 호소에서 microcystins는 주로 Microcystis 속에 의해 생산되며, 독소 생산에 관여하는 mcyA 유전자의 염기서열은 보존되어 있는 것으로 판단된다.
- 이를 확인하기 위하여 Anabaena 속의 mcyA와 mcyB gene에 specific한 primer set를 제작하여 PCR을 수행한 결과, 대상 시료에서 PCR 산물이 전혀 생성되지 않았다(결과 미제시). 이러한 결과로 판단할 때, 본 연구에서 분석한 시료에서 microcystins를 생산하는 Anabaena 속은 없거나 매우 적은 농도로 존재하는 것으로 보인다. 본 연구의 대상호소는 5개이며, 특정 시점에 채취한 시료를 대상으로 분석한 것이기 때문에, 국내 수생태계에 microcystins를 생성하는 Anabaena 속의 존재 여부에 대한 것은 확실하지 않다.
- 선행 연구에서, GenBank에 등록된 Anabaena 속의 mcyA 염기서열과 mcyA-Cd 1F/mcyA-Cd 1R의 염기 서열을 비교한 결과, 일부 염기에서 차이가 있어, 이들 primer를 사용하였을 때 Anabaena 속의 mcyA gene이 증폭되지 않을 가능성이 제기되었다(14). 이를 확인하기 위하여 Anabaena 속의 mcyA와 mcyB gene에 specific한 primer set를 제작하여 PCR을 수행한 결과, 대상 시료에서 PCR 산물이 전혀 생성되지 않았다(결과 미제시). 이러한 결과로 판단할 때, 본 연구에서 분석한 시료에서 microcystins를 생산하는 Anabaena 속은 없거나 매우 적은 농도로 존재하는 것으로 보인다.
- 대청호를 제외한 시료와 대청호 시료에서 가장 우점하는 clone의 종류가 상이하였다. 즉, 대청호를 제외한 시료에서는 mcyA-clone-01이 가장 비율이 높았으나, 대청호에서는 mcyA-clone-02가 가장 높은 비율이었다(Fig. 3). 따라서, 대청호의 microcystins의 높은 농도가 다른 호소와 달리 독소 생성능이 뛰어난 균주에 기인할 가능성이 있으며, 이에 대한 후속연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 현미경으로 관찰하였을 때, Microcystis 속 이외의 다른 남조세균이 거의 관찰되지 않은 충주호 시료에서는 microcystins의 농도는 14.2 μg/L로 크게 높지 않았으나, clone의 종류는 9개로 분석한 시료 중 가장 많은 수를 나타내었다(Fig. 3).
- GenBank에 등록된 mcyA 염기서열과 비교한 결과, 국내 호소에서 분리된 Microcystis 속의 mcyA 유전자 염기서열은 매우 낮은 다양성을 나타내었다. 환경 시료 분석 결과, 2-3종류의 clone이 전체의 87-100%를 차지하였으며, Anabaena 속이나 Planktothrix 속의 mcyA 유전자와 유사한 염기서열은 발견되지 않았다. 이러한 결과로 볼 때, 대상 호소에서 microcystins는 주로 Microcystis 속에 의해 생산되며, 독소 생산에 관여하는 mcyA 유전자의 염기서열은 보존되어 있는 것으로 판단된다.
후속연구
- 실시간 PCR법을 이용하여 목표 미생물을 계수하는 연구가 많이 이루어 졌으며, 독소 생산 Microcystis의 경우에도 실시간 PCR법을 이용하여 이를 계수하기 위한 여러 방법이 제안되었다(6, 28). 국내 호소에서 mcyA의 염기서열이 매우 보존되어 있는 것으로 나타났으며, 이는 본 연구에서 증폭한 유전자 부분이 실시간 PCR을 통한 독성 Microcystis의 계수를 위한 방법에 활용될 수 있음을 제시한다.
- 3). 따라서, 대청호의 microcystins의 높은 농도가 다른 호소와 달리 독소 생성능이 뛰어난 균주에 기인할 가능성이 있으며, 이에 대한 후속연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 또한 독소의 농도에 따라 우점하는 균주의 mcyA 유전자가 다르게 나타났다. 이러한 결과로 판단할 때, mcyA 유전자가 microcystins의 종류 및 독소 합성능에 중요한 역할을 수행할 가능성이 있으며, 이를 규명하기 위한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.