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문제 정의
- Nontyphoid Salmonella 105주 중에서 가장 많은 비율을 차지한 S. Enteritidis 50주에 대하여 균주 간의 유사도를 알아보고자 PFGE를 실시하였다. 분석 dendrogram은 Fig.
- 2002년부터 2010년 5월까지 국내 식중독 원인균별 발생현황을 보면 세균 원인체 중에서 병원성대장균 다음으로 살모넬라에 의한 식중독 발생건수가 가장 많은 것으로 보고되었다(8). 본 연구는 소아에서 분리된 살모넬라균에 대한 혈청형 분포와 항생제 내성에 관한 연구를 수행하였다.
- 이에 본 연구는 2003년부터 2009년까지 서울지역 소아 환자에서 분리된 nontyphoid Salmonella의 혈청형을 조사하고 항생제 내성 및 항생제 내성과 관련 있는 integron의 보유여부와 특성을 알아보았다. 그리고 분리빈도가 높은 혈청형에 대해서 분리균주 간의 역학적인 연관성을 알아보기 위해 PulsedField Gel Electrophoresis (PFGE)를 실시하여 유연관계를 살펴보았다.
제안 방법
- Integron 보유확인을 위한 PCR primer로는 hep 35 (5′-TGG GGG TYA ARG ATB TKG ATT T-3′)와 hep 36 (5′-CAR CAC ATG CGT RAT RAT-3′)을 사용하였고, PCR product는 Labopass™ PCR purification kit (COSMO Genetech, Korea)를 이용하여 정제하였다.
- Integron 보유확인을 위한 PCR primer로는 hep 35 (5′-TGG GGG TYA ARG ATB TKG ATT T-3′)와 hep 36 (5′-CAR CAC ATG CGT RAT RAT-3′)을 사용하였고, PCR product는 Labopass™ PCR purification kit (COSMO Genetech, Korea)를 이용하여 정제하였다. Integron의 유형분류를 위하여 정제한 PCR 증폭산물을 제한효소인 HinfI (TaKaRa, Japan)을 이용하여 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 검사를 시행하였다.
- 2003년부터 2009년까지 서울시보건환경연구원에 의뢰된 6세 이하 소아 설사환자 검체에서 분리된 nontyphoid Salmonella 105주를 실험에 이용하였다. MacConkey agar에서 무색투명하게 자란 colony 중 KIA에서 K/A, H2S 생성균주에 대하여 API 20E kit (bioMerieux Co., France)에 의한 생화학적 동정을 실시한 후 O항원은 슬라이드 응집법으로, H항원은 시험관 응집법으로 결정하였다. 사용한 O항혈청과 H항혈청은 국립보건연구원(KNIH, Korea)과 Difco (USA)사 제품을 사용하였다.
- Tm 63.8 sec의 조건으로 14°C에서 18시간 진행하였고, Ethidium bromide (0.5 μg/ml) 용액에 gel을 넣어 10분간 염색 후 증류수에 탈색하여 Gel doc (BioRad)으로 밴드를 확인하였다.
- 이에 본 연구는 2003년부터 2009년까지 서울지역 소아 환자에서 분리된 nontyphoid Salmonella의 혈청형을 조사하고 항생제 내성 및 항생제 내성과 관련 있는 integron의 보유여부와 특성을 알아보았다. 그리고 분리빈도가 높은 혈청형에 대해서 분리균주 간의 역학적인 연관성을 알아보기 위해 PulsedField Gel Electrophoresis (PFGE)를 실시하여 유연관계를 살펴보았다.
- Class 1 integron의 gene cassette 분석을 위한 PCR primer는 White 등(26)의 방법에 따라 hep 58 (5′-TCATGGCTTG TTATGACTGT-3′)과 hep 59 (5′-GTAGGGCTTATTATGCA CGC-3′)를 사용하였다. 증폭된 PCR product는 gel extraction kit (QIAGEN, UK)를 이용하여 정제하였고, COSMO Genetech사(Korea)에 sequencing을 의뢰하였다. 염기서열 결과는 NCBI 의 GenBank와 비교분석하였다(http://www.
대상 데이터
- 2003년부터 2009년까지 서울시보건환경연구원에 의뢰된 6세 이하 소아 설사환자 검체에서 분리된 nontyphoid Salmonella 105주를 실험에 이용하였다. MacConkey agar에서 무색투명하게 자란 colony 중 KIA에서 K/A, H2S 생성균주에 대하여 API 20E kit (bioMerieux Co.
- , France)에 의한 생화학적 동정을 실시한 후 O항원은 슬라이드 응집법으로, H항원은 시험관 응집법으로 결정하였다. 사용한 O항혈청과 H항혈청은 국립보건연구원(KNIH, Korea)과 Difco (USA)사 제품을 사용하였다.
- 항균제 감수성 시험은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 방법에 따라 디스크 확산법으로 실시하였다(5). 실험에 사용한 10종의 항균제는 ampicillin (AM), ampicillin/sulbactam (SAM), cephalothin (CF), cefotaxime (CTX), nalidixic acid (NA), ciprofloxacin (CIP), chloramphenicol (C), gentamicin (GM), tetracyline (TE), trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT)이였다.
데이터처리
- 5 μg/ml) 용액에 gel을 넣어 10분간 염색 후 증류수에 탈색하여 Gel doc (BioRad)으로 밴드를 확인하였다. PFGE 결과분석은 BioNumerics software version 5.1 (Applied Maths, Belgium)을 이용하였고, 밴드패턴은 1.5% tolerance Dice coefficient로 dendrogram을 작성하여 분석하였다.
- 증폭된 PCR product는 gel extraction kit (QIAGEN, UK)를 이용하여 정제하였고, COSMO Genetech사(Korea)에 sequencing을 의뢰하였다. 염기서열 결과는 NCBI 의 GenBank와 비교분석하였다(http://www. ncbi.nlm.nih.gov.).
이론/모형
- Class 1 integron의 gene cassette 분석을 위한 PCR primer는 White 등(26)의 방법에 따라 hep 58 (5′-TCATGGCTTG TTATGACTGT-3′)과 hep 59 (5′-GTAGGGCTTATTATGCA CGC-3′)를 사용하였다.
- White 등(26)의 방법에 따라 가열법으로 DNA를 추출하여 integrase 유전자에 대한 PCR을 시행하였다. Integron 보유확인을 위한 PCR primer로는 hep 35 (5′-TGG GGG TYA ARG ATB TKG ATT T-3′)와 hep 36 (5′-CAR CAC ATG CGT RAT RAT-3′)을 사용하였고, PCR product는 Labopass™ PCR purification kit (COSMO Genetech, Korea)를 이용하여 정제하였다.
- 항균제 감수성 시험은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 방법에 따라 디스크 확산법으로 실시하였다(5). 실험에 사용한 10종의 항균제는 ampicillin (AM), ampicillin/sulbactam (SAM), cephalothin (CF), cefotaxime (CTX), nalidixic acid (NA), ciprofloxacin (CIP), chloramphenicol (C), gentamicin (GM), tetracyline (TE), trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT)이였다.
성능/효과
- 전체 105주에 대하여 integrase 검출을 위한 PCR을 수행한 결과 20주가 양성이었고, integrase 유형 분류을 위해 RFLP를 한 결과 20주 모두 class 1 integron을 보유하였다(Table 4). Class 1 을 보유한 20주 중에서는 혈청형 Montevideo가 8주로 가장 많은 비율을 차지하였고, 그 다음으로는 혈청형 Typhimurium이 4주, 분리균 중 가장 많은 비율을 차지한 Enteritidis는 단지 1주만 integron을 보유하였다. 이들 integron 보유균에 대해 gene cassette를 분석한 결과는 Table 4와 같이 4주에서만 gene cassette가 확인되었다.
- 4%로 비교적 높았다. 기타 혈청형은 ampicillin과 tetracyline이 각각 40%의 내성률을 보였고 streptomycin과 nalidixic acid가 각각 24%, 20%의 내성률을 보였는데 전체 Salmonella의 내성률은 ampicillin이 60%로 가장 높았고, tetracyline과 streptomycin이 각각 46.7%, 35.2%의 내성률을 보였고, cefotaxime과 ciprofloxacin, gentamicin, trimethoprim/ sulfamethoxazole은 10% 미만의 낮은 내성률을 보였다.
- 혈청형 Enteritidis의 경우 7제 및 9제 내성균도 각각 1주 확인되었다. 기타 혈청형의 경우 좀 더 다양한 유형이 확인되었는데, AM-SAM-TE형이 12주(21.8%)로 가장 많이 차지하였는데 이 중 혈청형 Montevideo가 9주를 차지하였다(결과 미제시). 그 다음으로는 NA 단일형과 AM-NATE형이 각각 3주 확인되었다.
- 국외의 경우 일본(12), 스페인(9), 프랑스(2)에서도 역시 Enteritidis가 가장 많이 분리되는 것으로 보고하여 지역에 따라 조금씩 차이는 있으나 nontyphoid Salmonella 중에 Enteritidis가 가장 많이 분리되는 것은 전 세계적인 경향임을 알 수 있었다. 본 연구에서 두 번째로 많이 분리된 Montevideo의 경우 2003년부터 2009년까지 전반적으로 걸쳐서 분리된 것이 아니라 2005, 2006년에 편중되어 분리된 경향이 있고 이들 균에 대한 PFGE 결과 10종의 항생제에 모두 감수성인 2005년 분리균 3주를 제외하고 나머지 균주는 전체 95.3%의 유사도를 보여 유전자형이 유사한 균주로 확인이 되었다(결과 미제시). 또한 조 등(4)의 결과를 보면 우리나라에서 비슷한 시기에 분리된 살모넬라 중 S.
- Typhimurium은 다른 혈청형에 비해 항균제에 대한 내성도가 매우 높은 것으로 알려져 있다. 본 연구에서도 10종에 대한 항균제 내성을 조사한 결과 S. Typhimurium이 가장 내성률이 높은 혈청형으로 확인되었다. Typhimurim 7주 모두 3제 이상의 내성유형을 나타내었고 2003년에 분리된 1주는 7제 내성을 보였는데, tetracycline, ampicillin, chloramphenicol, trimethoprim/sulfamethoxazole에 대한 내성이 높았고 nalidixic acid에도 28.
- 분리균의 항균제 내성유형은 총 29종이었으며, 총 10종의 항균제에 대해서 1종에서부터 최고 9종의 항균제에 대해 내성을 나타내는 다양한 내성형을 나타내었다. 총 105주에서 22주는 10종의 항균제에 대해 감수성을 보였으며, 내성을 보인 균주의 내성유형을 살펴보면 Table 3과 같이 혈청형 Enteritidis의 경우 AM과 NA에 단일내성을 보이는 균주가 21주로 42%를 차지하였고, AM-S-C-TE형이 7주(14%), AM-S-TE형이 6주(12%)를 차지하였다.
- 2003년부터 2009년까지 7년간 서울지역 소아 설사환자에서 분리된 nontyphoid salmonella는 총 105주였다. 분리된 균주의 혈청형은 18종이였으며 분리빈도를 보면 혈청형 Enteritidis가 50주(47.6%)로 가장 많았고, 그 다음이 Montevideo 16주(15.2%)였다. 혈청형 Typhimurium과 Hillingdon이 각각 7주(6.
- 보유한 gene cassette는 streptomycin과 spectinomycin의 내성 유전자인 aadA2와 ampicillin에 내성 유전자인 blaP1, trimethoprim에 내성인 dfrA12와 aadA2, dfrA17-aadA5, 그리고 aadA7 유전자였다. 이들 내성유전자를 보유한 균주는 모두 ampicillin이나 streptomycin 그리고 trimethoprim에 내성을 보였다. BlaP1 및 aadA2유전자가 있는 1,000 bp와 1,200 bp 크기의 integron은 43 kb의 S.
- coli를 비롯한 다른 장내세균을 대상으로 한 연구에서 흔히 보고되고 있다(14, 17, 19, 25, 26). 이러한 결과들로 볼 때 integron내 gene cassette는 integron을 보유한 다른 균으로 쉽게 전파가능하기 때문에 본 연구에서 integron 보유균 중 80%의 비율을 차지한 gene cassette 비보유균에 대해서도 주의가 요구된다. 본 연구 결과에서 integron에 의한 항생제 내성에 대한 관여도는 상대적으로 낮지만 integron내에는 여러 내성유전자를 삽입할 가능성이 있기 때문에 지속적으로 확인할 필요성이 있다.
- 조 등(4)은 EnterNet Korea 사업 결과 Salmonella속의 항생제 내성률이 ampicillin 40%, tetracycline 39%, nalidixic acid 23%, chloramphenicol 14%였고, 권 등(13)의 국가항생제내성안전관리사업 연구보고서에 따르면 설사환자에서 분리된 살모넬라의 항생제 내성률이 ampicillin 50%, tetracycline 40%이고 축산물에서 분리된 살모넬라는 nalidixic acid 74%, tetracycline 67%, streptomycin 67%라고 보고하였다. 이러한 결과와 비교해보면 본 연구가 소아에서 분리되었음에도 불구하고 항생제 내성률이 국내 평균보다 다소 높음을 알 수 있었다. 살모넬라의 경우 인수공통전염병으로 동물과 인체에서 분리된 균주의 항균제 내성에서의 차이는 사람과 동물에 사용하는 항생제 차이에 의한 것과 동물에서 사료첨가제로 사용한 항생제 종류에 따라 내성에 차이가 있는 것으로 보고되고 있다(20).
- 전체 105주에 대하여 integrase 검출을 위한 PCR을 수행한 결과 20주가 양성이었고, integrase 유형 분류을 위해 RFLP를 한 결과 20주 모두 class 1 integron을 보유하였다(Table 4). Class 1 을 보유한 20주 중에서는 혈청형 Montevideo가 8주로 가장 많은 비율을 차지하였고, 그 다음으로는 혈청형 Typhimurium이 4주, 분리균 중 가장 많은 비율을 차지한 Enteritidis는 단지 1주만 integron을 보유하였다.
- Enteritidis에 대해 PFGE 분석을 한 결과 크게 3그룹으로 나눠졌다. 정확히 일치하지는 않지만 비교적 항생제 내성패턴과 유사한 유전자 패턴을 보였고, 전체 50주 중에서 3주를 제외하고는 89.8%의 비교적 유연관계가 높은 균주임을 알 수 있었다. 이 결과로 볼 때 서울지역 소아 설사환자에서 분리된 S.
- 분리균의 항균제 내성유형은 총 29종이었으며, 총 10종의 항균제에 대해서 1종에서부터 최고 9종의 항균제에 대해 내성을 나타내는 다양한 내성형을 나타내었다. 총 105주에서 22주는 10종의 항균제에 대해 감수성을 보였으며, 내성을 보인 균주의 내성유형을 살펴보면 Table 3과 같이 혈청형 Enteritidis의 경우 AM과 NA에 단일내성을 보이는 균주가 21주로 42%를 차지하였고, AM-S-C-TE형이 7주(14%), AM-S-TE형이 6주(12%)를 차지하였다. 혈청형 Enteritidis의 경우 7제 및 9제 내성균도 각각 1주 확인되었다.
- C그룹은 1균주를 제외하고는 모두 ampicillin에 내성이고 AM-S-C-TE 내성형인 균주가 대다수를 이루었는데, 2004년에 분리된 1균주는 10종의 항생제에 모두 감수성을 보여 나머지 C그룹과는 유전자 패턴에 차이가 있었다. 혈청형 Enteritidis 전체 50주의 유사도는 확연히 구분되는 A그룹으로 인해 47.2%의 낮은 유사도를 보였다.
- 1%의 비교적 높은 내성률을 보였다. 혈청형 Hillingdon은 다른 혈청형에 비해 nalidixic acid의 내성률이 71.4%로 비교적 높았다. 기타 혈청형은 ampicillin과 tetracyline이 각각 40%의 내성률을 보였고 streptomycin과 nalidixic acid가 각각 24%, 20%의 내성률을 보였는데 전체 Salmonella의 내성률은 ampicillin이 60%로 가장 높았고, tetracyline과 streptomycin이 각각 46.
- Ciprofloxacin과 cefotaxime에 내성을 보이는 균주가 각각 1주 있었다. 혈청형 Montevideo는 ampicillin과 tetracyline의 내성을 보이는 균주가 전체 16주 중 13주로 81.3%의 높은 내성률을 보였고 ampicillin/sulbactam이 다른 혈청형에 비해 68.7%의 높은 내성률을 보였다. 혈청형 Typhimurium은 tetracyline의 내성률이 100%로 검사한 7주 모두 내성을 보였고, ampicillin, streptomycin이 각각 71.
- 7%의 높은 내성률을 보였다. 혈청형 Typhimurium은 tetracyline의 내성률이 100%로 검사한 7주 모두 내성을 보였고, ampicillin, streptomycin이 각각 71.4%, trimethoprim/sulfamethoxazole이 57.1%의 비교적 높은 내성률을 보였다. 혈청형 Hillingdon은 다른 혈청형에 비해 nalidixic acid의 내성률이 71.
- 분리된 Salmonella 균의 혈청형별 항균제 내성률은 Table 2와 같다. 혈청형별 내성률이 조금씩 달랐는데 혈청형 Enteritidis의 경우 ampicillin의 내성률이 66%로 가장 높았고, streptomycin 44%, tetracycline과 nalidixic acid는 각각 34%, 32%의 내성률을 보였다. Ciprofloxacin과 cefotaxime에 내성을 보이는 균주가 각각 1주 있었다.
- 혈청형은 총 19종으로 Enteritidis가 47.6%로 가장 많이 분리되었고, 그 다음은 Motevideo 15.2%, Typhimurium, Hillingdon이 각각 7%였다. 이는 유 등(24)이 2001년부터 2004년까지 광주지역 소아에서 분리한 살모넬라의 혈청형이 Typhimurium 32.
후속연구
- 6%에서 integron이 검출이 되었으며 이 중 86%가 gene cassette가 확인 되었다고 하였는데, 본 연구결과보다 integron 보유율이 휠씬 높았다. 그러나 이 등(14)의 결과에 의하면 임상 검체 261주 중 21주(8%)에서 integron이 검출되었고 그 중 12주(57%)에서 gene cassette가 확인되었다고 하였고, 손 등(25)의 결과에 의하면 S. Typhimurium 17주 중 3주가 integron을 보유하였는데 지역별 균주별로 차이가 있는 것인지 진단검사의 방법상의 문제로 인한 것인지 확인이 필요할 것으로 생각된다. 보유한 gene cassette는 streptomycin과 spectinomycin의 내성 유전자인 aadA2와 ampicillin에 내성 유전자인 blaP1, trimethoprim에 내성인 dfrA12와 aadA2, dfrA17-aadA5, 그리고 aadA7 유전자였다.
- 3%의 유사도를 보여 유전자형이 유사한 균주로 확인이 되었다(결과 미제시). 또한 조 등(4)의 결과를 보면 우리나라에서 비슷한 시기에 분리된 살모넬라 중 S. Montevedio의 분리률이 낮은 점으로 보아 2006년도에 서울지역에서 소규모 유행이 있었음을 짐작할 수 있는데 이에 대해서는 좀 더 확인이 필요할 것으로 생각된다. 환자에서 분리된 살모넬라의 항균제에 대한 내성 증가가 문제가 되고 있는데, 특히 S.
- 이러한 결과들로 볼 때 integron내 gene cassette는 integron을 보유한 다른 균으로 쉽게 전파가능하기 때문에 본 연구에서 integron 보유균 중 80%의 비율을 차지한 gene cassette 비보유균에 대해서도 주의가 요구된다. 본 연구 결과에서 integron에 의한 항생제 내성에 대한 관여도는 상대적으로 낮지만 integron내에는 여러 내성유전자를 삽입할 가능성이 있기 때문에 지속적으로 확인할 필요성이 있다.
- Enteritidis는 유사한 유전자형을 가진 균주에 의한 확산으로 생각되며, 유연관계가 떨어지는 3주에 대해서는 해외 유입균인지 아니면 기존 균주의 새로운 변이형인지 등에 대해서 추가적인 역학조사가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 성인에 비해 항생제 노출기회가 적은 소아에서 분리된 균주임에도 불구하고 고도내성을 보이는 균주나 integron을 보유한 균주에 대해서는 앞으로도 지속적인 모니터링을 통해 국가적인 차원에서 관리가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 8%의 비교적 유연관계가 높은 균주임을 알 수 있었다. 이 결과로 볼 때 서울지역 소아 설사환자에서 분리된 S. Enteritidis는 유사한 유전자형을 가진 균주에 의한 확산으로 생각되며, 유연관계가 떨어지는 3주에 대해서는 해외 유입균인지 아니면 기존 균주의 새로운 변이형인지 등에 대해서 추가적인 역학조사가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 성인에 비해 항생제 노출기회가 적은 소아에서 분리된 균주임에도 불구하고 고도내성을 보이는 균주나 integron을 보유한 균주에 대해서는 앞으로도 지속적인 모니터링을 통해 국가적인 차원에서 관리가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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