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문제 정의
- 배양 상등액의 항균활성을 조사한 결과 박테리오신으로 추정되었다. 본 논문에서는 B. subtilis 168이 만드는 박테리오신의 몇가지 특성을 조사하여 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 10종의 Gram 양성균과 음성균을 대상으로 B. subtilis 168에 의한 저해 여부를 조사하였다(Table 2). S.
- 3시간 후 앞의 tricine-SDS PAGE에 사용한 것과 동일한 박테리오신 시료 50 µg을 첨가하고 24시간 두면서 일정 간격으로 시료를 취하여 생균수를 측정하였다.
- B. cereus ATCC 14579를 LB 평판배지에 1×105 cells로도말한 후 8 mm 직경의 paper disk 를 올려놓고 저해 스펙트럼 조사에 사용한 것과 동일한 B. subtilis 168 박테리오신 시료 2.8 µg을 가하였다.
- B. subtilis 168 박테리오신에 노출된 B. cereus ATCC 14579의 생균수 변화를 측정하였다. 박테리오신에 노출되지 않은 대조구의 경우 초기균수 1×108 cell/mL는 6시간째 1×105 cells/mL 까지 감소하였으나 6시간 이후 차츰 균수가 증가하여 배양 24시간에는 5×107 cells/mL까지 다시 증가하였다.
- B. subtilis 168을 LB 배지에 1% 접종한 후 37℃에서 60시간 동안 진탕 배양하면서 균 증식과 항균력을 측정하였다(Fig. 1). 균 증식은 계속 꾸준히 이루어짐을 흡광도 측정 결과에서 알 수있고 배양 60시간에 1.
- B. subtilis 168의 항균 물질의 효소 처리에 따른 반응을 조사하였다. 지시균주로는 B.
- 각 균주를 LB, BHI, 혹은 MRS 평판배지에 1×105 cells로 도말한 후 8 mm 직경의 paper disk (Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 놓고 그 위에 박테리오신 시료 30 µg을 가한 후에 37℃에서 24 시간 둔 다음 저해환의 직경을 측정하여 저해 정도를 확인하였다.
- subtilis 168 생육과 항균 역가 측정을 위해 200 mL LB 액체배지에서 37℃, 60시간 진탕 배양하였다. 시간대별로 배양액을 회수하여 UV-visible spectrophotometer(Shimadzu uv-1601, Kyoto, Japan)을 이용하여 OD600 nm에서 측정하였다. 항균력은 회수한 배양액을 원심분리 후 여과(0.
- 0) 완충용액에 현탁하여 항균력을 측정하였다. 항균력 측정 시료를 순차적으로 2배씩 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)로 희석하여 접종하고 저해환을 형성하는 최대 희석배수를 확인하였다. 희석배수의 역을 취하고 이 값에 1 mg에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 mg protein당 AU(activity unit)로 항균력을 나타내었다.
- 항균력은 회수한 배양액을 원심분리 후 여과(0.45 µm, Sartorius, Goettingen, Germany)한 상등액을 회수하여 동결 건조(Chuo-ku, Tokyo, Tokyo Rikaikat Co.)한 후 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 현탁하여 항균력을 측정하였다.
대상 데이터
- 1, lyophilized supernatant + proteinase K; 2, lyophilized supernatant + protease; 3, lyophilized supernatant + pepsin; 4, lyophilized supernatant + trypsin; 5, lyophilized supernatant control (no enzyme treatment). B. cereus ATCC 14579 was used as an indicator.
- 단백질가수분해 효소액 5 µL를 paper disk 한 쪽 면에 첨가하여 37℃ 24시간 배양 후 관찰하였다[12]. Proteinase K(Takara, B2205A, Japan), protease (Sigma, P5147, Type XIV, from Streptomyces griseus), pepsin(Sigma, P7000, E.C. 3.4.23., from porcine gastric mucosa), trypsin(Fluka Analytical, E.C. 3.4.21.4, from hog pancreas) 4가지 효소를 사용하였다. Proteinase K는 원상태인 액상 상태, protease, trypsin은 5 mM 인산완충용액(pH 7.
- 4, from hog pancreas) 4가지 효소를 사용하였다. Proteinase K는 원상태인 액상 상태, protease, trypsin은 5 mM 인산완충용액(pH 7.0), pepsin은 0.02 N HCl에 녹여 효소액을 만들어서 protease는 0.042 unit, proteinase K는 3 unit, pepsin은 6.7 unit, 그리고 trypsin은 21.04 unit를 사용하였다.
- 지시균주로는 L. monocytogenes ATCC 19111와 E. faecalis ATCC 29212을 각각 1×105 cells 사용하였다.
이론/모형
- B. subtilis 168 박테리오신의 B. cereus ATCC 14579에 대한 저해 기작을 문 등[15]의 방법으로 조사하였다. B.
- 단백질 농도를 Bradford법[1]으로 측정하여 50 µg을 tricine polyacrylamide gel(16% acrylamide)에 걸어주고 30 mA에서 전기영동을 행하였다[17].
- 0)에 녹여서 박테리오신 시료로 사용하였다. 저해 spectrum 확인을 위해 Gram 양성 및 음성균 10종을(Table 1) 사용하여 paper disk method[6]로 실험을 진행하였다. 각 균주를 LB, BHI, 혹은 MRS 평판배지에 1×105 cells로 도말한 후 8 mm 직경의 paper disk (Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.
성능/효과
- 항균력은 배양 16시간부터 20시간째 급격히 증가하다가 24시간 이후 급격히 감소됨을 알수 있었다. 27시간 이후로는 항균력이 100 AU/mg 단백질로 일정하게 유지됨을 확인 할 수 있었다. 최대 항균력은 배양 20-24시간에 관찰되었고 400 AU/mg 단백질이었다.
- Tricine-SDS PAGE을 통하여 L. monocytogenes ATCC 19111와 E. faecalis ATCC 29212에 대한 항균력을 측정한 결과 gel 상에서 약 5 kDa 부위에서 두 균 공히 저해하는, 항균력을 지닌 밴드를 관찰 할 수 있었다(Fig. 3). Coomassie로 염색된 SDS gel 해당 위치에서도 동일 크기의 펩타이드가 확인되었다.
- 1). 균 증식은 계속 꾸준히 이루어짐을 흡광도 측정 결과에서 알 수있고 배양 60시간에 1.6 부근에 도달하였다. 항균력은 배양 16시간부터 20시간째 급격히 증가하다가 24시간 이후 급격히 감소됨을 알수 있었다.
- Coomassie로 염색된 SDS gel 해당 위치에서도 동일 크기의 펩타이드가 확인되었다. 이 결과로부터 B. subtilis 168이 생산하는 5 kDa 크기 펩타이드는 항균력을 지닌 박테리오신임을 확인할 수 있었다.
- 4 그래프 상에서 6시간 이후) 생균수가 감소하였으며, 배양 24시간에는 1×102 cells/mL까지 감소 하였다. 이상 결과는 B. subtils 168 박테리오신에 의한 저해는 민감한 세균을 죽이는, 즉 살균(bactericidal) 기작임을 보여주는 것이다. 청국장과 같은 전통발효식품들의 단점인 안전성 문제를 보완하는 가장 좋은 방법은 발효균들중에서 유해균을 억제하는 균주들을 찾아서 종균으로 사용하는 것이다.
- amyloliquefaciens 균주들과 168을 청국장 제조에 사용한 결과들을 보면 비록 168의 α-amylase, α-galactosidase, β-glucosidase, 그리고 단백질 가수분해효소들(산성, 중성, 및 알칼리성) 역가는 타 균주들 보다 현저히 낮지만 168을 콩에 접종하여 청국장 발효를 2-3일 진행한 후에는 타 균들과 차이가 없는 양질의 청국장을 얻을수 있었다[5]. 이상 결과들로 볼 때 B. subtilis 168은 청국장 종균으로 사용 가능하며 특히 B. cereus 저해효과가 예상되어 발효식품 안전성 측면에서 유리할 것이 예상된다.
- 박테리오신은 민감한 균을 죽임으로써 생육을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 이상 결과들에서 B. subtilis 168은 청국장과 같은 B. cereus 오염이 문제되는 발효식품들의 종균으로 유용할 것으로 생각된다.
- 6 부근에 도달하였다. 항균력은 배양 16시간부터 20시간째 급격히 증가하다가 24시간 이후 급격히 감소됨을 알수 있었다. 27시간 이후로는 항균력이 100 AU/mg 단백질로 일정하게 유지됨을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- subtilis 168은 청국장 종균으로 가능성이 있는 것으로 생각된다. 앞으로 168보다 효소활성이 우수한 GRAS 간균들 중에서 유해균 억제능이 우수한 균들을 찾는 노력이 필요할 것으로 생각된다.
- 국내의 경우 된장, 간장과 같은 전통발효식품들에서 분리한 간균들(bacilli)이 만드는 박테리오신들의 분리와 이들의 특성 연구들이 일부 수행되었다[13, 20]. 이들의 박테리오신들이 식품 보존제로 개발될 경우 식용에 안전한 균들에서 유래한 장점이 있어서 앞으로 보다 많은 연구가 요구된다. Bacillus subtilis 168은 유전체 서열분석이 완료된 B.
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