[논문]인체이식용 무세포 진피 제조를 위한 바이러스 불활화 공정

배정은; 김진영; 안재형; 최다미; 정효선; 이동혁; 김인섭

인체이식용 무세포 진피 제조를 위한 바이러스 불활화 공정
Virus Inactivation Processes for the Manufacture of Human Acellular Dermal Matrix 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.38 no.2, 2010년, pp.168 - 176

배정은 (한남대학교 생명.나노과학대학 생명과학과 & 바이오의약품안전성검증센터) , 김진영 (한스바이오메드(주) 한스대덕연구소) , 안재형 (한스바이오메드(주) 한스대덕연구소) , 최다미 (한스바이오메드(주) 한스대덕연구소) , 정효선 (한스바이오메드(주) 한스대덕연구소) , 이동혁 (한남대학교 생명.나노과학대학 생명과학과 & 바이오의약품안전성검증센터) , 김인섭 (한남대학교 생명.나노과학대학 생명과학과 & 바이오의약품안전성검증센터)

초록
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사체 피부에서 면역반응을 일으킬 수 있는 세포들을 제거한 무세포 진피는 다양한 의료용 소재로 사용되고 있다. Trin-butyl phospahate(TnBP)와 deoxycholic acids를 세포제거 용액으로 사용하여 피부조직 내 진피층의 3차원적 구조를 손상시키지 않고 다양한 구조 단백질 및 성분들을 유지한 상태에서 면역반응의 대상인 세포성 항원만을 선별적으로 제거한 이식용 동종 무세포 진피인 $SureDerm^{TM}$을 개발하였다. $SureDerm^{TM}$ 제조공정은 감염성 위해인자 불활화 공정으로 70% 에탄올 처리와 산화에틸렌 가스 처리 공정을 포함하고 있다. 본 연구에서는 SureDermTM 제조공정 중 70% 에탄올 소독 공정, 세포제거용액(0.1% TnBP와 2% deoxycholic acids) 처리 공정, 산화에틸렌 가스 멸균의 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 국제적 가이드에 따라 5종의 바이러스 [human immunodeficiency virus type 1(HIV-1), bovine herpes virus(BHV), Bovine viral diarrhoea virus(BVDV), hepatitis A virus(HAV), porcine parvovirus(PPV)]를 생물학적 지표로 사용하였다. 피부조직에 각 생물학적 지표를 첨가한 후 불활화 공정을 실시한 다음 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 70% 에탄올 20분처리 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV 같은 외피 바이러스는 처리 시간 2.5분 안에 불활화되었지만, HAV와 PPV 같은 비-외피 바이러스는 에탄올에 저항성을 나타내어 20분 처리 후 log 바이러스 감소인수가 각각 1.85와 1.15였다. 세포제거용액 처리 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV는 각각 5분, 30분, 5분 안에 검출한계 이하로 불활화되었다. 산화에틸렌 가스처리에 의해 본 연구에 사용한 모든 바이러스가 검출한계 이하로 불활화되었다. 3가지 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV, HAV, PPV에 대한 log 바이러스 감소인수 합은 각각 $\geq12.71$, $\geq18.08$, $\geq14.92$, $\geq6.57$, $\geq7.18$이었다. 이와 같은 결과에서 $SureDerm^{TM}$ 제조공정은 바이러스 안전성을 보증할 수 있는 충분한 바이러스 불활화 능력을 갖고 있는 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Acellular dermal matrix (ADM), produced by decellularization from human cadaveric skin, has been used for various biomedical applications. A manufacturing process for ADM ($SureDerm^{TM}$) using tri-n-butyl phospahate (TnBP) and deoxycholic acids as the decellularization solution has been developed. The manufacturing process for $SureDerm^{TM}$ has 70% ethanol treatment and ethylene oxide gas sterilization for inactivating infectious microorganisms. The purpose of this study was to examine the efficacy of the 70% ethanol treatment, decellularization process using 0.1% TnBP and 2% deoxycholic acids, and EO gas sterilization process in the inactivation of viruses. A variety of experimental model viruses for human pathogens, including the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), bovine herpes virus (BHV), bovine viral diarrhoea virus (BVDV), hepatitis A virus (HAV), and porcine parvovirus (PPV) were all selected for this study. Enveloped viruses such as HIV-1, BHV, and BVDV were effectively inactivated to undetectable levels by 70% ethanol treatment. However HAV and PPV showed high resistance to 70% ethanol treatment with the log reduction factors of 1.85 and 1.15, respectively. HIV-1, BHV, and BVDV were effectively inactivated to undetectable levels by decellularization process. All the viruses tested were completely inactivated to undetectable levels by EO gas treatment. The cumulative log reduction factors of HIV-1, BHV, BVDV, HAV, and PPV were $\geq12.71$, $\geq18.08$, $\geq14.92$, $\geq6.57$, and $\geq7.18$, respectively. These results indicate that the production process for $SureDerm^{TM}$ has a sufficient virus-reducing capacity to achieve a high margin of the virus safety.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 SureDerm^TM의 바이러스 안전성을 평가하기 위해 70% 에탄올 처리, 세포제거용액 처리, 산화에틸렌 가스 처리에 의한 바이러스 불활화 효과를 검증하고자 하였다. 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 5종의 바이러스[HIV type 1(HIV-1), bovine herpes virus(BHV), Bovine viral diarrhoea virus(BVDV), HAV, porcine parvovirus(PPV)]를 생물학적 지표로 사용하였다.

제안 방법

바이러스를 첨가한 조직으로부터 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 0.1% TnBP와 2% deoxycholic acids로 구성된 세포제거용액을 처리한 후 5, 30, 60, 120분 간격으로 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다.
0.1% TnBP와 2% deoxycholic acids을 처리하면서, 처리 시간에 따른 바이러스 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 3). HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스는 5분 안에 검출한계이하로 완벽하게 불활화되었다.
Xylene을 이용하여 파라핀을 제거하고 다시 무수알코올로 xylene을 제거하였다. 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올에 각각 1분간 처리하고 증류수에 10분간 넣어 수화과정을 마친 뒤 hematoxylin으로 핵을 염색하였다. 다시 흐르는 물에 1분간 슬라이드 뒷면을 대고 세척하였다.
70% 에탄올 처리 공정에서 각 바이러스들의 불활화 정도를 비교하였다. 동결건조한 3×3 cm 피부에 바이러스를 1 mL 첨가하여 바이러스 용액을 조직속으로 침투시켰다.
동결건조한 무세포 진피를 포장용기에 넣어 포장한 후 산화에틸렌 가스로 멸균하여 최종 제품을 생산하였다. 70% 에탄올 처리, 세포제거용액 처리, 산화에틸렌 가스 멸균에 의한 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 SureDerm^TM 제조공정에서 각 단계별 조직을 확보하였다.
70% 에탄올 처리, 세포제거용액 처리, 산화에틸렌 가스 멸균에 의한 불활화 효과를 검증하기 위해 각 단계별로 확보한 피부조직을 동결건조한 후 각 바이러스를 첨가하여 바이러스 용액이 피부조직에 침투하도록 하였다. 각 불활화 공정을 실시한 후 조직에서 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다.
70% 에탄올을 처리하면서, 처리시간에 따른 바이러스 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 2). HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스는 2.
Eosin 염색을 3분간 하고 10초간 흐르는 물에 세척하였다. 70%에서 100% 알코올로 순차적으로 탈수를 하고 canada balsam으로 고정한 후 현미경으로 관찰 및 촬영을 하였다.
SureDerm^TM 제조공정을 통해 생산된 무세포 진피에서 진피층 매트릭스의 미세 구조 변화가 있는지와 세포가 제거되었는지의 여부를 확인하기 위해서 조직학적 평가를 실시하였다. 정상피부조직과 무세포 진피의 세포 배열과 형태학적 변화를 비교하기 위해 핵과 세포질을 구분해서 볼 수 있는 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 하였다.
바이러스 배양을 위해서는 2% FBS가 첨가된 배지를 사용하였다. T-175 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 HIV의 경우 거대세포(syncitium), 다른 바이러스들의 경우에는 세포병변효과(cytopatic effect)를 관찰하였다. 거대세포 또는 세포병변효과가 명백하게 관찰될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, 400×g에서 7분간 원심분리하여 상층액은 따로 모으고 침전물은 현탁하였다.
사체 피부에서 면역반응을 일으킬 수 있는 세포들을 제거한 무세포 진피는 다양한 의료용 소재로 사용되고 있다. Trin-butyl phospahate(TnBP)와 deoxycholic acids를 세포제거 용액으로 사용하여 피부조직 내 진피층의 3차원적 구조를 손상시키지 않고 다양한 구조 단백질 및 성분들을 유지한 상태에서 면역반응의 대상인 세포성 항원만을 선별적으로 제거한 이식용 동종 무세포 진피인 SureDerm^TM을 개발하였다. SureDerm^TM 제조공정은 감염성 위해인자 불활화 공정으로 70% 에탄올 처리와 산화에틸렌 가스 처리 공정을 포함하고 있다.
25 mL씩 접종하였다. 각 바이러스의 양성 대조구로 역가를 알고 있는 바이러스를 7배수로 희석하여 각 plate에 배양된 세포에 접종하였다. 음성대조군으로 바이러스가 첨가되지 않은 배양배지를 접종하였다.
70% 에탄올 처리, 세포제거용액 처리, 산화에틸렌 가스 멸균에 의한 불활화 효과를 검증하기 위해 각 단계별로 확보한 피부조직을 동결건조한 후 각 바이러스를 첨가하여 바이러스 용액이 피부조직에 침투하도록 하였다. 각 불활화 공정을 실시한 후 조직에서 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 조직으로부터 바이러스를 회수하기 위해 세포배양배지를 첨가한 후 혼합 실험기(vortex mixer)를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 바이러스를 추출하였다.
그 후 CO2 배양기에서 35°C로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 거대세포 또는 세포병변효과를 관찰하였다.
세포가 제거된 3×3 cm 무세포 진피에 바이러스를 3 mL 첨가한 후 동결건조를 하였다. 동결건조한 무세포 진피로부터 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스를 첨가한 무세포 진피에 산화에틸렌 가스를 처리한 후 바이러스를 회수하여 불활화 정도를 비교하였다.
바이러스를 첨가한 조직으로부터 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스가 첨가된 피부를 70% 에탄올에 2.5분, 5분, 10분, 20분간 처리한 후 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다.
동결건조한 무세포 진피로부터 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스를 첨가한 무세포 진피에 산화에틸렌 가스를 처리한 후 바이러스를 회수하여 불활화 정도를 비교하였다. 산화에틸렌 가스 멸균에 의한 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37°C, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리하였다.
생리식염수로 5분씩 6회에 걸쳐 세척하여 표피제거용액을 제거하였다. 면역거부반응을 일으키는 진피 내 세포를 제거하기 위해 0.1% TnBP와 2% Deoxycholic acids로 구성된 세포제거용액을 10시간동안 처리하였다. 세포제거가 끝난 후 생리식염수로 세척을 하여 세포제거용액을 제거하였다.
입고된 사체 피부는 원재료 시험 검사를 실시한 후 조직을 보호하는 보호 용액을 세척하고, 70% 에탄올을 20분간 처리하였다. 면역반응의 항원 대상인 표피를 제거하기위해 표피제거용액으로 24시간 처리하였다. 생리식염수로 5분씩 6회에 걸쳐 세척하여 표피제거용액을 제거하였다.
산화에틸렌 가스 멸균에 의한 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37°C, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리하였다. 무세포 진피에 잔존하는 산화에틸렌 가스가 바이러스 정량 분석을 위한 감염성 세포주에 독성을 일으킬 수 있기 때문에 무세포 진피로부터 바이러스를 회수하기 전에 산화에틸렌 가스를 제거하기 위해 상온에서 24시간 보관하였다. 산화에틸렌 가스 멸균 공정을 규정한 ISO 11135 규정에 준하여 검증을 실시하였다[18].
세포제거가 끝난 후 생리식염수로 세척을 하여 세포제거용액을 제거하였다. 무세포 진피의 보존 및 보관을 용이하게 하기 위해 동결건조를 실시하였다. 동결건조한 무세포 진피를 포장용기에 넣어 포장한 후 산화에틸렌 가스로 멸균하여 최종 제품을 생산하였다.
미국 FDA 및 미국조직은행연합회에서 승인한 조직은행을 통해 기증된 피부조직을 사용하여 인체이식용 무세포 진피인 SureDerm^TM을 생산하였다(Fig. 1). 인체조직 기증자의 혈액검사 검사를 통해 HBV, HCV, HIV, HTLV와 매독 감염 여부를 확인하고, 세균 검사를 통해 안전성이 확인된 피부를 재료로 사용하였다.
다른 세포들은 10% FBS를 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL)에 배양하였다. 바이러스 배양을 위해서는 2% FBS가 첨가된 배지를 사용하였다. T-175 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 HIV의 경우 거대세포(syncitium), 다른 바이러스들의 경우에는 세포병변효과(cytopatic effect)를 관찰하였다.
)]으로 나타내었다[20]. 바이러스 불활화 실험 시 바이러스 역가를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 바이러스를 첨가하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 먼저 실험하였다[17]. 바이러스 불활화 실험 중 취한 시료들을 세포독성과 간섭효과를 나타내지 않은 농도로 바이러스 배양 배지를 사용하여 희석하였다.
바이러스 불활화 실험 시 바이러스 역가를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 바이러스를 첨가하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 먼저 실험하였다[17]. 바이러스 불활화 실험 중 취한 시료들을 세포독성과 간섭효과를 나타내지 않은 농도로 바이러스 배양 배지를 사용하여 희석하였다. 희석된 시료를 7배수로 희석하여 HIV-1의 경우 96 well plate에 배양된 세포에 0.
바이러스 정량 분석이 끝난 후 그 결과를 기초로 각 공정에서 바이러스 감소인수를 구하였다. 바이러스 감소인수는 바이러스가 첨가된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정진행 후에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 감소인수(reduction factor)로 정의하였다[11, 17].
조직으로부터 바이러스를 회수하기 위해 세포배양배지를 첨가한 후 혼합 실험기(vortex mixer)를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 바이러스를 추출하였다. 바이러스 추출은 바이러스 회수율이 90% 이상이 되게 3차례이상 실시하였다.
동결건조한 3×3 cm 피부에 바이러스를 1 mL 첨가하여 바이러스 용액을 조직속으로 침투시켰다. 바이러스를 첨가한 조직으로부터 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스가 첨가된 피부를 70% 에탄올에 2.
바이러스에 대한 산화에틸렌 가스 멸균 효과를 조사하였다(Table 4). 산화에틸렌 가스 처리에 의해 HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스뿐만 아니라 HAV, PPV 같은 비-외피 바이러스 모두 검출한계 이하로 불활화되었다.
SureDerm^TM 제조공정은 감염성 위해인자 불활화 공정으로 70% 에탄올 처리와 산화에틸렌 가스 처리 공정을 포함하고 있다. 본 연구에서는 SureDerm^TM 제조공정 중 70% 에탄올 소독 공정, 세포제거용액(0.1% TnBP와 2% deoxycholic acids) 처리 공정, 산화에틸렌 가스 멸균의 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 국제적 가이드에 따라 5종의 바이러스 [human immunodeficiency virus type 1(HIV-1), bovine herpes virus(BHV), Bovine viral diarrhoea virus(BVDV), hepatitis A virus(HAV), porcine parvovirus(PPV)]를 생물학적 지표로 사용하였다. 피부조직에 각 생물학적 지표를 첨가한 후 불활화 공정을 실시한 다음 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다.
피부와 같은 인체조직은 단백질 용액과는 다른 고형성분이기 때문에 바이러스 불활화 검증 실험을 위해 첨가하는 바이러스가 조직속에 골고루 침투하기가 쉽지 않다. 본 연구에서는 피부조직 안에 바이러스가 고루 침투할 수 있도록 조직을 동결건조 후 바이러스를 첨가하였다.
산화에틸렌 가스 멸균에 의한 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37°C, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리하였다.
산화에틸렌 가스 멸균이 효과적으로 이루어지기 위해서는 적절한 노출시간(2-5시간), 산화에틸렌 가스 농도(450-1200 mg/L), 처리 온도(29-65°C), 상대 습도(45-85%)가 중요한데, 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37°C, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리한 후 바이러스 불활화 효과를 조사하였다(Table 4).
면역반응의 항원 대상인 표피를 제거하기위해 표피제거용액으로 24시간 처리하였다. 생리식염수로 5분씩 6회에 걸쳐 세척하여 표피제거용액을 제거하였다. 면역거부반응을 일으키는 진피 내 세포를 제거하기 위해 0.
각 바이러스의 양성 대조구로 역가를 알고 있는 바이러스를 7배수로 희석하여 각 plate에 배양된 세포에 접종하였다. 음성대조군으로 바이러스가 첨가되지 않은 배양배지를 접종하였다. 그 후 CO₂ 배양기에서 35°C로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 거대세포 또는 세포병변효과를 관찰하였다.
따라서 바이러스 안전성이 보증되고, 생체적합성과 치유 능력이 향상된 무세포 진피 제조 공정의 개발이 요구되었다. 이에 Tri-n-butyl phospahate(TnBP)와 deoxycholic acids를 사용하여 피부조직 내 진피층의 3차원적 구조를 손상시키지 않고 다양한 구조 단백질 및 성분들을 유지한 상태에서 면역 반응의 대상인 세포성 항원만을 선별적으로 제거한 이식용 동종 무세포 진피인 SureDerm^TM을 개발하였다. SureDerm^TM은 면역반응을 일으키는 표피와 진피에 있는 세포들을 제거한 후 급속 동결 및 건조하여 진피층의 3차원 구조를 그대로 유지한 인체이식재이다.
1). 인체조직 기증자의 혈액검사 검사를 통해 HBV, HCV, HIV, HTLV와 매독 감염 여부를 확인하고, 세균 검사를 통해 안전성이 확인된 피부를 재료로 사용하였다. 입고된 사체 피부는 원재료 시험 검사를 실시한 후 조직을 보호하는 보호 용액을 세척하고, 70% 에탄올을 20분간 처리하였다.
조직은행에서는 기증자의 안전성 확보를 위해 기증자의 병력을 검토하고, 기증자의 신체에 대한 육안 검사를 통해 감염의 증후, 외상 등 조직의 성상에 영향을 주는 요인의 유무를 확인하고, 또한 기증자의 혈액검사 및 조직에 대한 미생물학적 검사를 통해 감염질환에 대한 선별 검사를 실시한다. 인체조직에 오염될 수 있는 감염성 위해 인자 중 바이러스에 대한 안전성을 보증하기 위해 인체조직 기증자의 혈액검사 검사를 통해 HBV, HCV, HIV, HTLV를 검사한다[16]. 이러한 바이러스 검사는 혈액이나 조직에 존재할지도 모를 위해 바이러스를 모두 검사하기 보다는 특정 지표 바이러스들을 대상으로 수행된다.
인체조직 기증자의 혈액검사 검사를 통해 HBV, HCV, HIV, HTLV와 매독 감염 여부를 확인하고, 세균 검사를 통해 안전성이 확인된 피부를 재료로 사용하였다. 입고된 사체 피부는 원재료 시험 검사를 실시한 후 조직을 보호하는 보호 용액을 세척하고, 70% 에탄올을 20분간 처리하였다. 면역반응의 항원 대상인 표피를 제거하기위해 표피제거용액으로 24시간 처리하였다.
정상피부와 0.1% TnBP와 2% deoxycholic acids로 구성된 세포제거용액을 처리하여 생산된 무세포 진피의 조직학적 미세구조를 H&E 염색 후 비교하였다(Fig. 2).
정상피부조직과 무세포 진피의 세포 배열과 형태학적 변화를 비교하기 위해 핵과 세포질을 구분해서 볼 수 있는 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 하였다.
각 불활화 공정을 실시한 후 조직에서 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 조직으로부터 바이러스를 회수하기 위해 세포배양배지를 첨가한 후 혼합 실험기(vortex mixer)를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 바이러스를 추출하였다. 바이러스 추출은 바이러스 회수율이 90% 이상이 되게 3차례이상 실시하였다.
침지되어 고정된 조직을 4 μm 두께로 절편하여 슬라이드를 제작하였다.
표피가 제거된 진피를 4×5 cm로 자른 후 동결건조를 하였다.
1% TnBP와 2% deoxycholic acids) 처리 공정, 산화에틸렌 가스 멸균의 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 국제적 가이드에 따라 5종의 바이러스 [human immunodeficiency virus type 1(HIV-1), bovine herpes virus(BHV), Bovine viral diarrhoea virus(BVDV), hepatitis A virus(HAV), porcine parvovirus(PPV)]를 생물학적 지표로 사용하였다. 피부조직에 각 생물학적 지표를 첨가한 후 불활화 공정을 실시한 다음 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 70% 에탄올 20분 처리 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV 같은 외피 바이러스는 처리 시간 2.

대상 데이터

HIV-1(HBX2 strain)과 C8166-45 세포는 성균관대학교 배용수 교수에게 분양받아 사용하였다. C8166-45 세포는 10% fetal bovine serum(FBS: Gibco BRL, Gaithersburg, USA)를 첨가한 RPMI 1640 배지에 배양하였다. 다른 세포들은 10% FBS를 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL)에 배양하였다.
본 연구를 위해 사용한 바이러스들의 특성은 Table 1과 같다. HIV-1(HBX2 strain), BHV(ATCC VR 188), BVDV(ATCC VR 534), HAV(ATCC VR 1402), PPV(ATCC VR 742)의 배양과 정량을 위해 C8166-45 세포, Minipig Kidney(MPK) 세포(ATCC CCL 166), bovine turbinate(BT) 세포(ATCC CRL 1390), FRhK-4 세포(ATCC CRL 1688), Minipig Kidney(MPK) 세포(ATCC CCL 166)를 각각 사용하였다[11, 21, 22]. HIV-1(HBX2 strain)과 C8166-45 세포는 성균관대학교 배용수 교수에게 분양받아 사용하였다.
HIV-1(HBX2 strain), BHV(ATCC VR 188), BVDV(ATCC VR 534), HAV(ATCC VR 1402), PPV(ATCC VR 742)의 배양과 정량을 위해 C8166-45 세포, Minipig Kidney(MPK) 세포(ATCC CCL 166), bovine turbinate(BT) 세포(ATCC CRL 1390), FRhK-4 세포(ATCC CRL 1688), Minipig Kidney(MPK) 세포(ATCC CCL 166)를 각각 사용하였다[11, 21, 22]. HIV-1(HBX2 strain)과 C8166-45 세포는 성균관대학교 배용수 교수에게 분양받아 사용하였다. C8166-45 세포는 10% fetal bovine serum(FBS: Gibco BRL, Gaithersburg, USA)를 첨가한 RPMI 1640 배지에 배양하였다.
의 바이러스 안전성을 평가하기 위해 70% 에탄올 처리, 세포제거용액 처리, 산화에틸렌 가스 처리에 의한 바이러스 불활화 효과를 검증하고자 하였다. 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 5종의 바이러스[HIV type 1(HIV-1), bovine herpes virus(BHV), Bovine viral diarrhoea virus(BVDV), HAV, porcine parvovirus(PPV)]를 생물학적 지표로 사용하였다.
넷째, 선택된 생물학적 지표는 시험자에게 감염의 위험이 적어야 한다. 본 연구에서는 무세포 진피 제조공정의 바이러스 불활화 효과 검증을 위한 지표 바이러스로 HIV와 HTLV의 모델 바이러스인 HIV-1, Herpes virus와 Cytomegalovirus의 모델 바이러스인 BHV, HCV의 모델 바이러스인 BVDV, B19의 모델 바이러스인 PPV, 그리고 HAV를 선정하였다(Table 1). 이러한 바이러스들은 일반적으로 사람 체액, 혈액 및 조직 유래 바이오의약품 제조공정의 바이러스 안전성 검증을 위해 사용되고 있다[11, 21].

데이터처리

그 후 CO₂ 배양기에서 35°C로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 거대세포 또는 세포병변효과를 관찰하였다. 감염성 바이러스가 검출되지 않을 때, 즉 검출한계 이하로 관찰될 때에는 바이러스의 역가를 95% 신뢰도를 가지고 이론적 최소 검출량(a theoretical minimal detection level)을 사용하여 계산하였다[17, 23]. 바이러스의 농도가 낮을 경우 시료에 감염성 바이러스가 없을 확률은 c=ln p/-v라는 Poisson 분포를 따르게 되는데, c는 mL 당 감염성 바이러스의 농도, p는 시료에 감염성 바이러스가 없을 확률, v는 시료의 부피를 나타낸다.
바이러스 감소인수는 바이러스가 첨가된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정진행 후에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 감소인수(reduction factor)로 정의하였다[11, 17]. 모든 실험은 독립적으로 두 번 실시하여 평균값을 구하였다.

이론/모형

무세포 진피에 잔존하는 산화에틸렌 가스가 바이러스 정량 분석을 위한 감염성 세포주에 독성을 일으킬 수 있기 때문에 무세포 진피로부터 바이러스를 회수하기 전에 산화에틸렌 가스를 제거하기 위해 상온에서 24시간 보관하였다. 산화에틸렌 가스 멸균 공정을 규정한 ISO 11135 규정에 준하여 검증을 실시하였다[18].

성능/효과

3가지 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV, HAV, PPV에 대한 log 바이러스 감소인수 합은 각각 ≥12.71, ≥18.08, ≥14.92, ≥6.57, ≥7.18이었다.
피부조직에 각 생물학적 지표를 첨가한 후 불활화 공정을 실시한 다음 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 70% 에탄올 20분 처리 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV 같은 외피 바이러스는 처리 시간 2.5분 안에 불활화되었지만, HAV와 PPV 같은 비-외피 바이러스는 에탄올에 저항성을 나타내어 20분 처리 후 log 바이러스 감소인수가 각각 1.85와 1.15였다. 세포제거용액 처리 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV는 각각 5분, 30분, 5분 안에 검출한계 이하로 불활화되었다.
70% 에탄올을 처리하면서, 처리시간에 따른 바이러스 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 2). HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스는 2.5분 안에 검출한계이하로 완벽하게 불활화되었다. HIV-1, BHV, BVDV의 log 바이러스 감소인수는 각각 ≥3.
특정 불활화공정에서 감염성 위해인자 불활화 효과가 매우 크다고 할지라도, 부적절하게 공정이 진행될 수도 있고, 그 공정에 저항성을 갖는 새로운 감염성위해인자가 오염될 수도 있기 때문이다. SureDerm^TM 제조공정은 70% 에탄올 소독 공정, 용매/계면활성제 처리 공정, 산화에틸렌 가스 멸균 공정과 같이 서로 작용기작이 다른 바이러스 불활화 공정을 포함하고 있고, 각 공정의 바이러스 불활화 효율이 매우 크기 때문에 기증된 피부조직에 감염성 바이러스가 오염되어 있다 할지라도 안전성을 보증할 수 있는 충분한 바이러스 불활화 능력을 갖고 있는 것으로 판단된다.
셋째, 검증용 생물학적 지표는 되도록 쉽게 분석 가능하며 고농도로 배양할 수 있어야 한다. 넷째, 선택된 생물학적 지표는 시험자에게 감염의 위험이 적어야 한다. 본 연구에서는 무세포 진피 제조공정의 바이러스 불활화 효과 검증을 위한 지표 바이러스로 HIV와 HTLV의 모델 바이러스인 HIV-1, Herpes virus와 Cytomegalovirus의 모델 바이러스인 BHV, HCV의 모델 바이러스인 BVDV, B19의 모델 바이러스인 PPV, 그리고 HAV를 선정하였다(Table 1).
둘째, 선택된 생물학적 지표는 되도록 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것이어서 다른 미지의 또는 동정되지 않은 감염성 위해인자의 불활화를 보장할 수 있어야 한다.
무세포 진피를 제조하기 위해 면역원성 세포 제거 방법으로 trypsin 또는 dispase 같은 단백질 분해 효소를 사용하거나, 반복적인 동결-해동, NaCl과 SDS 처리 방법 등이 사용되어 왔는데, 이러한 공정으로 만들어진 무세포 진피는 많은 항원성분을 지니고 있어 수여부에 이식 시 면역거부반응을 일으켜 결과적으로 낮은 생착률을 초래하였다[27, 35, 38]. 또한 바이러스를 효과적으로 제거 또는 불활화시키는 공정을 포함하지 않고 있어 안전성을 보증할 수가 없었다. 따라서 바이러스 안전성이 보증되고, 생체적합성과 치유 능력이 향상된 무세포 진피 제조 공정의 개발이 요구되었다.
본 연구에서는 감염성 있는 바이러스의 역가를 50% 조직배양감염용량[50% tissue culture infectious dose(TCID₅₀)]으로 나타내었다[20]. 바이러스 불활화 실험 시 바이러스 역가를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 바이러스를 첨가하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 먼저 실험하였다[17].
바이러스에 대한 산화에틸렌 가스 멸균 효과를 조사하였다(Table 4). 산화에틸렌 가스 처리에 의해 HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스뿐만 아니라 HAV, PPV 같은 비-외피 바이러스 모두 검출한계 이하로 불활화되었다. EO 가스 멸균에 의한 HIV-1, BHV, BVDV, HAV, PPV의 log 바이러스 감소인수는 각각 ≥4.
세가지 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV, HAV, PPV에 대한 log 바이러스 감소인수 합은 각각 ≥12.71, ≥18.08, ≥14.92, ≥6.57, ≥7.18이었다(Table 5).
둘째, 선택된 생물학적 지표는 되도록 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것이어서 다른 미지의 또는 동정되지 않은 감염성 위해인자의 불활화를 보장할 수 있어야 한다. 셋째, 검증용 생물학적 지표는 되도록 쉽게 분석 가능하며 고농도로 배양할 수 있어야 한다. 넷째, 선택된 생물학적 지표는 시험자에게 감염의 위험이 적어야 한다.
18이었다. 이와 같은 결과에서 SureDerm^TM 제조공정은 바이러스 안전성을 보증할 수 있는 충분한 바이러스 불활화 능력을 갖고 있는 것으로 판단된다.
산화에틸렌 가스 처리에 의해 바이러스 모두 검출한계 이하로 불활화되었다. 이와 같은 결과에서 산화에틸렌 가스 공정은 바이러스를 모두 불활화할 수 있는 공정임을 확인하였다.
알코올은 인지질을 녹여내고, 단백질을 변성 시켜 살균 효과를 나타낸다[30]. 피부 조직을 소독하기 위해 70% 에탄올로 20분간 처리하는 공정은 외피 바이러스(HIV-1, BHV, BVDV)에 대해 완벽한 불활화 효과를 나타내지만, 비-외피 바이러스(HAV, PPV)에 대해서는 불활화 효과가 미미하였다(Table 2).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	무세포 진피는 무엇인가?	사체 피부에서 면역반응을 일으킬 수 있는 세포들을 제거한 무세포 진피는 다양한 의료용 소재로 사용되고 있다. Trin-butyl phospahate(TnBP)와 deoxycholic acids를 세포제거 용액으로 사용하여 피부조직 내 진피층의 3차원적 구조를 손상시키지 않고 다양한 구조 단백질 및 성분들을 유지한 상태에서 면역반응의 대상인 세포성 항원만을 선별적으로 제거한 이식용 동종 무세포 진피인 $SureDerm^{TM}$을 개발하였다.
	피부는 어떻게 구성되어 있는가?	피부는 바깥 면을 이루고 있는 얇은 층인 표피(epidermis)와 표피 밑의 보다 깊은 층인 진피(dermis)로 구성되어 있다. 표피는 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구성되며, 진피는 유두층, 망사층, 유두하층으로 구성된다.
	손상된 피부 조직을 재생시키기 위한 방법 중, 환자자신의 피부를 이식하는 자가이식의 문제점은 무엇인가?	손상된 피부 조직을 재생시키기 위한 방법으로는 환자자신의 피부를 이식하는 자가이식, 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식, 동물의 피부를 이식하는 이종이식의 세 가지 방법이 있다[3, 9, 10, 29, 33]. 이들 방법 중 자가이식이 가장 이상적이지만 손상부위가 광범위한 경우 조직을 확보할 수 있는 부위에 제한이 따르며 채취 부위가 새로운 상처 부위로 남게 되는 어려움이 있다. 동종이식은 영구적인 생착 보다는 상처 주변부 세포의 이동과 치유를 돕는 역할을 한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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