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문제 정의
- 본 연구는 항생제인 imipenem에 내성이 있는 Pseudomonas aeruginosa에 대한 차 폴리페놀(TPP)과 imipenem의 살균 상승효과와 세포반응을 조사하기 위하여 수행되었다. Imipenem 내성 Ps.
제안 방법
- 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 50~95%의 에탄올을 준비하여 저농도에서 점차 농도를 높여가면서 10분씩 연속적으로 탈수시켰다. 100%의 에탄올에서 30분씩 2회 최종 탈수하고, 100% hexamethyl disilazane에 20분간 2회 반응시켜 공기 중에서 건조하였으며, sputter coater(IB-3, Giko Engineering Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 2 mA로 3분간 gold coating한 후주사현미경(LEO 1455VP, ZEISS, Germany)으로 관찰하였다[4].
- Imipenem 감수성 균주와 내성 균주를 2,000 µg/mL 농도의 TPP에 각각 노출시켰을 때 나타나는 총 단백질 변화를 SDS-PAGE로 관찰하였으며, TPP에 의해 유도되는 스트레스 충격단백질(SSPs)인 DnaK와 GroEL의 발현 정도를 알아보기 위하여 Western blot을 통하여 조사하였다.
- Imipenem 내성 균주 배양액을 원심분리하여 얻어진 균체를 각각 2,000 µg/mL 농도의 TPP, 64 µg/mL 농도의 imipenem, 500 µg/mL 농도의 TPP와 4 µg/mL 농도의 imipenem 혼합액에 접종하여, 37℃에서 12시간 동안 노출시켰다.
- Imipenem 단독으로 4~512 µg/mL의 농도와 TPP 250~1,500 µg/mL의 농도를 imipenem과 병용한 Mueller-Hinton 고체 평판배지를 준비하고, 0.5 McFarland의 세균현탁액을 10배로 희석한 후, 2 µL를 취하여 생장 대조군부터 시작하여 저농도, 고농도의 배지 순으로 접종하였다.
- TPP에 의한 세균의 스트레스 충격 실험을 위하여 imipenem 감수성 균주와 내성 균주 배양액을 각각 4,000×g로 4℃에서 10분간 원심분리하였다.
- TPP와 imipenem에 노출된 세균의 세포 외부 형태의 변화를 알아보기 위하여 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. Imipenem 내성 균주 배양액을 원심분리하여 얻어진 균체를 각각 2,000 µg/mL 농도의 TPP, 64 µg/mL 농도의 imipenem, 500 µg/mL 농도의 TPP와 4 µg/mL 농도의 imipenem 혼합액에 접종하여, 37℃에서 12시간 동안 노출시켰다.
- TPP의 농도와 노출시간에 따른 세균의 LPS 변화를 관찰하기 위하여 TPP를 농도별(0, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500µg/mL)로 세균에 12시간 동안 노출시킨 후, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 농도별로 균체를 얻었다.
- 본 연구에서는 녹차추출물인 TPP를 이용하여 imipenem 내성 Ps. aeruginosa에 대한 항균효과를 확인하고, imipenem과 TPP를 병용처리 하였을 때의 항균효과를 비교하였으며, TPP에 의해 유도되는 스트레스 단백질인 DnaK와 GroEL의 유도를 SDS-PAGE와 Western blot을 통하여 조사하였다. 또한, 그람음성 세균이 가지는 외막의 주성분인 LPS의 양적인 변화를 관찰하기 위하여 TPP에 노출시킨 세균의 LPS를 추출하여 SDS-PAGE와 은 염색(silver stain)을 통하여 관찰하였으며, 세균이 TPP 또는 imipenem에 노출되었을 때 일어나는 세포의 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다.
- Imipenem 내성 Ps. aeruginosa의 time-kill 조사 결과에 따른 치사 농도의 TPP와 imipenem을 각각 단독으로 처리하였을 경우와 치사 농도의 TPP와 imipenem을 병용처리 하였을 때, 세균의 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 각각 관찰하였다. 정상적인 세포의 표면은 매끄러운 간균 형태이지만, 2,000 µg/mL의 TPP와 64 µg/mL의 imipenem을 각각 단독 투여하였을 때의 세포는 구멍이 생기거나 움푹 패이고, 주름진 표면을 가지는 것으로 관찰되었으며, 500 µg/ mL의 TPP와 4 µg/mL의 imipenem을 병용처리한 결과, TPP와 imipenem을 단독으로 투여하였을 때 보다 세포의 표면이 더 많이 손상되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 그리고 2,000 µg/mL의 동일한 농도의 TPP를 처리하고 노출시간의 변화를 주어 최대 18시간까지 노출시킨 균체를 얻었다.
- TPP와 imipenem의 감수성 시험은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)에서 권장하는 방법에 따라 한천희석법으로 시행하였다[6]. 대상 균주를 Mueller-Hinton 고체 평판배지에 18~24시간 동안 배양한 후, 생장한 세균집락을 0.5 McFarland의 혼탁도로 세균현탁액을 만들었다.
- aeruginosa에 대한 항균효과를 확인하고, imipenem과 TPP를 병용처리 하였을 때의 항균효과를 비교하였으며, TPP에 의해 유도되는 스트레스 단백질인 DnaK와 GroEL의 유도를 SDS-PAGE와 Western blot을 통하여 조사하였다. 또한, 그람음성 세균이 가지는 외막의 주성분인 LPS의 양적인 변화를 관찰하기 위하여 TPP에 노출시킨 세균의 LPS를 추출하여 SDS-PAGE와 은 염색(silver stain)을 통하여 관찰하였으며, 세균이 TPP 또는 imipenem에 노출되었을 때 일어나는 세포의 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다.
- 최종 균 농도가 106~107 CFU/mL가 되도록 균체를 접종한 후, 3시간 간격으로 고체배지에 100 µL씩 평판 도말하여 37℃에서 배양한 후 형성된 집락을 계수하였다. 또한, 위와 동일한 방법으로 TPP와 imipenem을 혼합하여 넣고, 3시간 간격으로 관찰하였다. TPP와 imipenem을 병용 사용하였을 때의 상승효과는 time-kill 조사에서 단독 투여 항균제 중 효과적인 항생제와 비교하여 병용투여 시 집락수가 2 log CFU/mL 이상 감소한 경우로 판단하였다.
- 이것을 37℃에서 24시간 배양한 후 세균의 생장을 관찰하였다. 상기과정을 3회 반복하여 최소억제농도(MIC)를 확인하였다.
- 세균에 다양한 농도의 TPP를 노출시켜 시간 경과에 따른 LPS의 양적인 변화를 SDS-PAGE와 은 염색을 통하여 조사하였다. 추출한 LPS가 순수하게 LPS만을 함유하고 있는지 여부를 확인하기 위하여 Bradford 방법으로 LPS에 함유된 단백질을 정량한 결과, 모두 0.
- 세균에 대한 TPP와 imipenem의 살균 상승작용을 조사하기 위하여 time-kill 조사를 실시하였다. 세균을 MuellerHinton 액체배지에 배양시킨 후, 대수생장기를 거치면서 파장 660 nm에서 혼탁도가 1.
- 원심분리 후 얻어진 균체를 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 3회 세척하였고, 세척 후 다시 원심분리하여 얻어진 균체를 각각 2,000 µg/mL 농도의 TPP에 동일한 양을 접종하여 현탁하였다.
- 5 McFarland의 세균현탁액을 10배로 희석한 후, 2 µL를 취하여 생장 대조군부터 시작하여 저농도, 고농도의 배지 순으로 접종하였다. 이것을 37℃에서 24시간 배양한 후 세균의 생장을 관찰하였다. 상기과정을 3회 반복하여 최소억제농도(MIC)를 확인하였다.
- Separating gel은 12%의 gel을 사용하였으며, stacking gel은 5%의 gel을 사용하였다. 전기영동 후 gel은 gel-staining solution(0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 45% 메탄올, 10% 아세트산)으로 2시간 동안 염색하였고, gel-destaining solution(10% 메탄올, 10% 아세트산)과 geldestaining solution(5% 메탄올, 7% 아세트산)으로 탈색하였다. TPP를 세균에 처리하였을 때 유도되는 스트레스 충격단백질(stress shock proteins, SSPs)을 조사하기 위하여 Sambrook 등[15]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다.
- 최종 균 농도가 106~107 CFU/mL가 되도록 균체를 접종한 후, 3시간 간격으로 고체배지에 100 µL씩 평판 도말하여 37℃에서 배양한 후 형성된 집락을 계수하였다.
- , Victoria, Canada)를 사용하였으며, 2차 항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate(Promega, Madison, USA)를 사용하였다. 항원-항체 반응을 검출하기 위해 West-Q chemilluminescent substrate kit(GenDEPOT, USA)를 사용하여 X-선 필름(AGFA, Belgium)에 현상한 후 스트레스 충격단백질의 발현을 분석하였다.
- 04% formaldehyde)에 30분간 반응시키고, 증류수로 1분씩 2회 세척하였다. 현상용액(2.5% sodium carbonate, 0.04% formaldehyde)에서 band가 뚜렷하게 나타날 때까지 반응시키고, 정지용액(1.46% EDTA)을 넣어 반응을 정지시킨 후 증류수로 세척하여 세균의 LPS 변화를 관찰하였다.
대상 데이터
- aeruginosa는 Mueller-Hinton 액체배지(Difco, USA)에 접종하였고, 감수성 검사의 표준 균주로 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 Ps. aeruginosa ATCC 27853을 사용하였다. 이 균주들은 MuellerHinton 액체배지에 각각 접종한 후, 분당 160회로 회전하는 37℃ 진탕배양기에서 배양 유지시키면서 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 imipenem 내성 Ps. aeruginosa 균주는 국내 종합병원 중환자실의 환자로부터 분리하였다. Imipenem 내성 Ps.
- TPP를 세균에 처리하였을 때 유도되는 스트레스 충격단백질(stress shock proteins, SSPs)을 조사하기 위하여 Sambrook 등[15]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 anti-DnaK와 anti-GroEL 단일항체(StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, Canada)를 사용하였으며, 2차 항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate(Promega, Madison, USA)를 사용하였다. 항원-항체 반응을 검출하기 위해 West-Q chemilluminescent substrate kit(GenDEPOT, USA)를 사용하여 X-선 필름(AGFA, Belgium)에 현상한 후 스트레스 충격단백질의 발현을 분석하였다.
- aeruginosa ATCC 27853을 사용하였다. 이 균주들은 MuellerHinton 액체배지에 각각 접종한 후, 분당 160회로 회전하는 37℃ 진탕배양기에서 배양 유지시키면서 실험에 사용하였다.
이론/모형
- LPS의 양적인 변화를 Hitchcock 등[8]의 방법에 따라 SDS-PAGE와 은 염색 방법을 통하여 확인하였다. Separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 5% acrylamide gel을 사용하였으며, 전기영동 후 gel은 은 염색하였다.
- 1% Coomassie brilliant blue R-250, 45% 메탄올, 10% 아세트산)으로 2시간 동안 염색하였고, gel-destaining solution(10% 메탄올, 10% 아세트산)과 geldestaining solution(5% 메탄올, 7% 아세트산)으로 탈색하였다. TPP를 세균에 처리하였을 때 유도되는 스트레스 충격단백질(stress shock proteins, SSPs)을 조사하기 위하여 Sambrook 등[15]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 anti-DnaK와 anti-GroEL 단일항체(StressGen Biotechnologies Corp.
- 또한, time-kill 조사를 통해 TPP와 imipenem의 항균효과를 조사하였으며, 병용처리 하였을 때 낮은 농도의 imipenem에서도 동일한 항균효과를 나타내는 것을 확인하였다. TPP에 의한 imipenem 감수성과 내성 균주의 스트레스 충격 단백질 발현을 조사하기 위하여 anti-DnaK와 antiGroEL 단일항체를 이용한 Western blot을 통해 관찰하였다. 스트레스 충격 단백질인 DnaK와 GroEL은 TPP의 노출시간이 증가함에 따라 발현양이 증가하다가 감소하는 것을 확인하였으며, 유도된 DnaK와 GroEL의 분자량은 각각 70 kDa과 60 kDa으로 나타났다.
- TPP와 imipenem의 감수성 시험은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)에서 권장하는 방법에 따라 한천희석법으로 시행하였다[6]. 대상 균주를 Mueller-Hinton 고체 평판배지에 18~24시간 동안 배양한 후, 생장한 세균집락을 0.
- 그리고 2,000 µg/mL의 동일한 농도의 TPP를 처리하고 노출시간의 변화를 주어 최대 18시간까지 노출시킨 균체를 얻었다. 얻어진 모든 균체를 PBS로 각각 3회 세척하여 준비하고, phenol-water 추출법에 근거한 LPS extraction kit (Intron, Korea)를 사용하였다. Lysis buffer를 넣어 완전히 현탁시킨 후, chloroform을 첨가하여 현탁시키고 실온에서 5분간 방치하였다.
- 0)를 넣고, 2분간 가열하여 LPS를 추출하였다. 추출한 LPS는 단백질 정량법을 통해 순도를 측정하였다.
- 추출한 단백질은 Bollag 등[3]의 방법에 따라 SDS-PAGE 를 실시하였다. Separating gel은 12%의 gel을 사용하였으며, stacking gel은 5%의 gel을 사용하였다.
성능/효과
- 4B). GroEL은 노출 3시간 이후부터 발현양이 급격히 증가하다가 점차 감소하였으며, 12시간 이후에는 발현되지 않는 것을 확인하였다(Fig. 4C). 또한, 내성 균주의 DnaK의 발현은 노출 3시간부터 발현되는 양이 점차 증가하였고, 6시간 이후에 점차 감소하다가 18시간이 경과한 후에는 DnaK의 발현이 관찰되지 않았으며(Fig 5B), GroEL의 경우, 3시간 이후부터 유도발현 양이 증가하여 9시간까지 유지하다가 노출 12시간 때부터 감소되어 18시간 이후 발현이 나타나지 않는 것을 확인하였다(Fig.
- Imipenem 감수성 균주에 TPP를 다양한 농도로 노출시켰을 때, 농도가 증가함에 따라 LPS의 양은 감소하였으며, 고농도인 2,500 µg/mL의 TPP에 노출되었을 때, 55 kDa 이하의 band가 완전히 사라지는 것이 관찰되었다(Fig. 6A).
- Imipenem 감수성 균주와 내성 균주는 각각 1,500 µg/mL의 TPP 농도에서 생존율이 점차적으로 감소하였으며, 감수성 균주는 18시간 이후에 집락이 관찰되지 않았으나, 내성균주에서는 약간의 집락이 관찰되었다(Fig. 1).
- Imipenem 감수성 균주와 내성 균주를 2,000 µg/mL 농도의 TPP에 각각 노출시켰을 때 나타나는 총 단백질 변화를 SDS-PAGE로 관찰하였으며, TPP에 의해 유도되는 스트레스 충격단백질(SSPs)인 DnaK와 GroEL의 발현 정도를 알아보기 위하여 Western blot을 통하여 조사하였다. Imipenem 감수성과 내성 균주 모두 TPP에 노출시켰을 때 SDS-PAGE한 gel에서 여러 종류의 단백질이 증가하거나 감소하는 변화가 관찰되었다(Fig. 4A, 5A). 동일한 단백질을 anti-DnaK와 anti-GroEL 단일항체에 특이적으로 반응하는 스트레스 충격단백질 발현양의 변화를 관찰한 결과, imipenem 감수성 균주에서 DnaK의 발현은 TPP 노출 3시간 후에는 발현양이 증가하다가, 노출 6시간부터는 발현양이 급격히 감소하였으며, 15시간 이후부터는 발현되지 않았다(Fig.
- 5C). TPP에 의한 스트레스 충격 실험 결과, 약 70 kDa의 DnaK와 60 kDa의 GroEL이 관찰되었으며, TPP에 노출된 시간이 증가할수록 DnaK와 GroEL의 발현양이 증가하다가 감소하였으며, 일정시간이 경과하면서 유도되는 양이 점차 사라지는 것으로 나타났다. 일반적으로 DnaK와 GroEL은 열충격 이외에 다른 스트레스 요인들에 의해서도 생성되는 것으로 알려져 있다.
- aeruginosa는 병원의 환자로부터 분리하였다. TPP와 imipenem을 단독으로 처리하였을 때와 병용으로 처리하였을 때의 최소억제농도(MIC)를 측정한 결과, imipenem 감수성과 내성 균주는 TPP와 imipenem을 병용처리 하였을 때, imipenem 농도가 각각 16배, 8배가 감소되는 것을 확인하였다. 또한, time-kill 조사를 통해 TPP와 imipenem의 항균효과를 조사하였으며, 병용처리 하였을 때 낮은 농도의 imipenem에서도 동일한 항균효과를 나타내는 것을 확인하였다.
- 또한, 위와 동일한 방법으로 TPP와 imipenem을 혼합하여 넣고, 3시간 간격으로 관찰하였다. TPP와 imipenem을 병용 사용하였을 때의 상승효과는 time-kill 조사에서 단독 투여 항균제 중 효과적인 항생제와 비교하여 병용투여 시 집락수가 2 log CFU/mL 이상 감소한 경우로 판단하였다.
- TPP와 imipenem을 병용하여 최소억제농도를 측정한 결과, imipenem 감수성과 내성 균주는 TPP 500 µg/mL일 때, imipenem 농도는 각각 16배, 8배가 감소 되어 병용효과가 매우 높은 것을 확인하였다(Table 1).
- TPP와 imipenem의 농도에 따른 imipenem 감수성과 내성균주의 최소억제농도를 알아보기 위해, 다양한 농도의 화합물로 최소억제농도를 측정한 결과, imipenem 감수성과 내성균주는 1,500 µg/mL의 TPP 농도에서 최소억제농도가 측정되었으며, imipenem의 최소억제농도 실험 결과, imipenem 감수성 균주는 2 µg/mL, imipenem 내성 균주는 32 µg/mL의 imipenem 농도에서 측정되었다.
- 스트레스 충격 단백질인 DnaK와 GroEL은 TPP의 노출시간이 증가함에 따라 발현양이 증가하다가 감소하는 것을 확인하였으며, 유도된 DnaK와 GroEL의 분자량은 각각 70 kDa과 60 kDa으로 나타났다. TPP의 농도와 시간에 따른 세균의 LPS 증감 변화를 SDS-PAGE와 은 염색을 통하여 확인하였고, TPP와 imipenem에 노출된 세균의 세포 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 결과, 움푹 패이고, 주름진 표면을 가지는 것으로 관찰되었다.
- 본 연구를 통해서 TPP에 의해 imipenem에 내성을 가지는 Ps. aeruginosa를 살균할 수 있었으며, TPP가 기존의 항생제와의 병용으로 뛰어난 살균 상승효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 천연살균제인 TPP가 합성화합물보다 비교적 독성이 적다는 점에서 활용 가능성이 크며, TPP와 항생제의 병용 사용이 살균의 상승효과를 가져올 수 있으므로 항생제의 사용을 줄일 수 있어 내성균에 대한 문제 해결에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
- 그리고 2,000 µg/mL의 동일한 농도의 TPP에 노출시켰을 때의 LPS의 변화는 노출시간이 증가함에 따라 LPS의 양이 점차 감소하여 18시간 이후에는 완전히 사라지는 것이 확인되었다(Fig. 6B).
- 4A, 5A). 동일한 단백질을 anti-DnaK와 anti-GroEL 단일항체에 특이적으로 반응하는 스트레스 충격단백질 발현양의 변화를 관찰한 결과, imipenem 감수성 균주에서 DnaK의 발현은 TPP 노출 3시간 후에는 발현양이 증가하다가, 노출 6시간부터는 발현양이 급격히 감소하였으며, 15시간 이후부터는 발현되지 않았다(Fig. 4B). GroEL은 노출 3시간 이후부터 발현양이 급격히 증가하다가 점차 감소하였으며, 12시간 이후에는 발현되지 않는 것을 확인하였다(Fig.
- 5%의 NaCl이 존재하는 배양조건에서 생장한 Lactococcus lactis에서 DnaK와 GroEL이 유도되는 것을 확인하였으며, Song 등[18]은 천연물질인 장미추출물에 노출된 Salmonella enteritidis가 스트레스 단백질인 DnaK와 GroEL을 유도한다는 결과를 발표한 바 있다. 따라서 imipenem 감수성과 내성 균주에서 TPP에 의해 발현되는 DnaK와 GroEL과 같은 스트레스 충격 단백질은 여러 가지 물리화학적 충격에 의해 발현되는 단백질과 동일한 것으로 확인되었다.
- 또한 TPP와 imipenem을 병용하여 imipenem 감수성과 내성 균주의 최소억제농도를 측정한 결과, imipenem 감수성 균주는 500 µg/mL의 TPP와 0.125 µg/mL의 imipenem에서, imipenem 내성 균주는 500 µg/mL의 TPP와 4 µg/mL의 imipenem에서 최소억제농도가 측정되었다.
- 또한, TPP와 imipenem을 병용하였을 경우, imipenem 감수성 균주는 TPP 2,000µg/mL와 imipenem 2 µg/mL의 농도에서 생존율이 점차적으로 감소하여 9시간 이후에는 모든 세균이 완전히 사멸되었으며, 내성 균주는 TPP 1,500 µg/mL와 imipenem 16µg/mL의 농도에서 점차적으로 감소하여 12시간 이후에 완전히 사멸되었다(Fig 3).
- 또한, imipenem 내성 균주에 다양한 농도의 TPP를 노출시켰을 때, 1,000 µg/mL의 농도에서부터 LPS band가 급격히 감소하는 것을 확인하였으며(Fig. 7A), 노출 시간에 따른 LPS의 변화를 관찰한 결과, 시간이 증가함에 따라 LPS의 양이 급격하게 감소하여 9시간 이후에는 LPS의 band가 거의 나타나지 않는 것이 관찰되었다(Fig. 7B).
- TPP와 imipenem을 단독으로 처리하였을 때와 병용으로 처리하였을 때의 최소억제농도(MIC)를 측정한 결과, imipenem 감수성과 내성 균주는 TPP와 imipenem을 병용처리 하였을 때, imipenem 농도가 각각 16배, 8배가 감소되는 것을 확인하였다. 또한, time-kill 조사를 통해 TPP와 imipenem의 항균효과를 조사하였으며, 병용처리 하였을 때 낮은 농도의 imipenem에서도 동일한 항균효과를 나타내는 것을 확인하였다. TPP에 의한 imipenem 감수성과 내성 균주의 스트레스 충격 단백질 발현을 조사하기 위하여 anti-DnaK와 antiGroEL 단일항체를 이용한 Western blot을 통해 관찰하였다.
- 4C). 또한, 내성 균주의 DnaK의 발현은 노출 3시간부터 발현되는 양이 점차 증가하였고, 6시간 이후에 점차 감소하다가 18시간이 경과한 후에는 DnaK의 발현이 관찰되지 않았으며(Fig 5B), GroEL의 경우, 3시간 이후부터 유도발현 양이 증가하여 9시간까지 유지하다가 노출 12시간 때부터 감소되어 18시간 이후 발현이 나타나지 않는 것을 확인하였다(Fig. 5C). TPP에 의한 스트레스 충격 실험 결과, 약 70 kDa의 DnaK와 60 kDa의 GroEL이 관찰되었으며, TPP에 노출된 시간이 증가할수록 DnaK와 GroEL의 발현양이 증가하다가 감소하였으며, 일정시간이 경과하면서 유도되는 양이 점차 사라지는 것으로 나타났다.
- 본 연구실에서는 녹차 폴리페놀이 항생제 내성세균인 methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)에 대해 우수한 항균효과를 나타내는 것을 확인하였으며, MRSA 균주에 대해 MIC 농도보다 낮은 농도의 oxacillin과 녹차 폴리페놀을 혼합하여 투여했을 때, 항균효과가 높게 나타났음을 확인하였다[5]. 또한, nalidixic acid 항생제에 내성을 지닌 Salmonella typhimurium에 녹차 폴리페놀을 단독으로 처리하였을 때와 nalidixic acid와 녹차 폴리페놀을 병용처리 하였을 때의 항균 효과를 비교하여 살균 상승효과를 확인한 바 있다[12].
- TPP에 의한 imipenem 감수성과 내성 균주의 스트레스 충격 단백질 발현을 조사하기 위하여 anti-DnaK와 antiGroEL 단일항체를 이용한 Western blot을 통해 관찰하였다. 스트레스 충격 단백질인 DnaK와 GroEL은 TPP의 노출시간이 증가함에 따라 발현양이 증가하다가 감소하는 것을 확인하였으며, 유도된 DnaK와 GroEL의 분자량은 각각 70 kDa과 60 kDa으로 나타났다. TPP의 농도와 시간에 따른 세균의 LPS 증감 변화를 SDS-PAGE와 은 염색을 통하여 확인하였고, TPP와 imipenem에 노출된 세균의 세포 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 결과, 움푹 패이고, 주름진 표면을 가지는 것으로 관찰되었다.
- 앞서 실험한 세균의 time-kill 조사 결과, 2,000µg/mL의 TPP에 노출시켰을 때, imipenem 감수성 균주는 15시간 만에 사멸하였으며, 내성 균주는 같은 농도에서 18시간 만에 세균이 완전히 사멸되는 것을 확인하였는데, 이와 동일한 조건에서 대부분의 LPS가 제거되는 것을 확인하였다.
- 또한, TPP와 imipenem을 병용하였을 경우, imipenem 감수성 균주는 TPP 2,000µg/mL와 imipenem 2 µg/mL의 농도에서 생존율이 점차적으로 감소하여 9시간 이후에는 모든 세균이 완전히 사멸되었으며, 내성 균주는 TPP 1,500 µg/mL와 imipenem 16µg/mL의 농도에서 점차적으로 감소하여 12시간 이후에 완전히 사멸되었다(Fig 3). 이를 통해 동일한 imipenem 농도의 항생제를 처리하였을 경우라 할지라도, 노출시킨 TPP의 농도가 증가함에 따라 더 효과적인 항균효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, TPP의 농도가 증가하고 imipenem의 농도는 낮아져도 동일한 항균효과를 나타내었다.
- 정상적인 세포의 표면은 매끄러운 간균 형태이지만, 2,000 µg/mL의 TPP와 64 µg/mL의 imipenem을 각각 단독 투여하였을 때의 세포는 구멍이 생기거나 움푹 패이고, 주름진 표면을 가지는 것으로 관찰되었으며, 500 µg/ mL의 TPP와 4 µg/mL의 imipenem을 병용처리한 결과, TPP와 imipenem을 단독으로 투여하였을 때 보다 세포의 표면이 더 많이 손상되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- 추출한 LPS가 순수하게 LPS만을 함유하고 있는지 여부를 확인하기 위하여 Bradford 방법으로 LPS에 함유된 단백질을 정량한 결과, 모두 0.3 µg/mL 이하로 극히 적은 양이 존재하였으므로 추출된 LPS가 비교적 순수한 상태임을 확인하였다.
후속연구
- aeruginosa를 살균할 수 있었으며, TPP가 기존의 항생제와의 병용으로 뛰어난 살균 상승효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 천연살균제인 TPP가 합성화합물보다 비교적 독성이 적다는 점에서 활용 가능성이 크며, TPP와 항생제의 병용 사용이 살균의 상승효과를 가져올 수 있으므로 항생제의 사용을 줄일 수 있어 내성균에 대한 문제 해결에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
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