[논문]Pichia pastoris에서 Zobellia galactanivorans 유래 재조합 <tex>$\\beta$</tex>-Agarase의 고효율 분비생산

석지환; 박희균; 이상현; 남수완; 전숭종; 김종현; 김연희

Pichia pastoris에서 Zobellia galactanivorans 유래 재조합 $\\beta$-Agarase의 고효율 분비생산
High-level Secretory Expression of Recombinant $\\beta$-Agarase from Zobellia galactanivorans in Pichia pastoris 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.38 no.1, 2010년, pp.40 - 45

석지환 (동의대학교 생명공학과) , 박희균 (동의대학교 생명공학과) , 이상현 (신라대학교 제약공학과) , 남수완 (동의대학교 생명공학과) , 전숭종 (동의대학교 생명공학과) , 김종현 (오사카대학 응용생물공학과) , 김연희 (동의대학교 생명공학과)

초록
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Agarose의 $\beta$-1,4결함을 분해하는 Zobellia galactanivorans 유래의 $\beta$-agarase 유전자(agaB)는 클로닝 되었고, AOX1(alcohol oxidase 1, methanol inducible) promoter 하류에 Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha-1 secretion signal($MF{\alpha}1$)를 연결하여 $MF{\alpha}1$-AgaB를 구축하였다. 구축된 plasmid pPIC-AgaB(9 kb)를 Pichia pastoris genome에 HIS4 gene 위치에 integration하였고, colony PCR을 통해 확인하였다. Methanol 첨가 배지에서 자란 형질전환체는 iodine solution의 첨가에 의해 red halos를 보였으며, P.pastoris에서 agaB의 효율적 분비 발현을 확인하였다. SDS-PAGE와 zymographic analysis에서 $\beta$-agarase의 분자량은 약 53 kDa으로 추정되었으며, 15% 정도의 N-linked glycosylation이 일어났음을 알 수 있었다. P.pastoris GS115/pPIC-AgaB의 48시간 baffled flask culture에서 세포외 $\beta$-agarase의 활성은 각각 0.1, 0.5, 1% methanol의 유도에 의해 1.34, 1.42 그리고 1.53 units/mL의 활성을 보였다. 대부분의 $\beta$-agarase의 활성은 세포 외에서 관찰되었고, 분비효율은 98%였으며 분비시의 glycosylation에 의해 열안정성도 증가되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The gene encoding $\beta$-agarase (agaB) which hydrolyzes $\beta$-1,4 linkages of agarose from Zobellia galactanivorans was cloned and fused to Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha-1 secretion signal ($MF{\alpha}1$), in which the transcription of $MF{\alpha}1$-AgaB was under the control of AOX1 (alcohol oxidase 1, methanol inducible) promoter. The constructed plasmid pPIC-AgaB (9 kb) was integrated into HIS4 gene locus of Pichia pastoris genome. Successful integration was confirmed by performing colony PCR. The transformed cells showed red halos around its colonies in methanol agar plate by adding iodine solution, indicating the active expression of agaB in P.pastoris. By SDS-PAGE and zymographic analysis, the molecular weight of $\beta$-agarase was estimated to be a 53 kDa and about 15% N-linked glycosylation was occurred. The activity of extracellular $\beta$-agarase reached 1.34, 1.42 and 1.53 units/mL by inducing 0.1, 0.5, and 1% methanol, respectively, at baffled flask culture of P.pastoris GS115/pPIC-AgaB for 48 hr. Most of the enzyme activity was found in the extacellular fraction and the secretion efficiency showed 98%. Thermostability of recombinant $\beta$-agarase was also increased by glycosylation.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

pastoris에서 β-agarase의 대량생산, 분비 및 생산 최적화에 관한 연구는 보고된 적이 없다. 이에 본 연구에서는 β-agarase 단백질의 분비생산을 위한 효모 mating factor α-l(MFαl)의 분비 신호서열(secretory signal sequence)을 이용하여 Z. galactanivorans 유래의 유전자를 P. pastoris^ 도입해 분비 효율을 조사하고 β-agarase의 과발현을 유도하여 생산된 β-agarase 효소를 산업적으로 이용하기 위한 연구를 수행하였다.
등 여러 해양미생물에서 분리가 되어 그 특성이 보고되어 있고[5, 14, 21, 26], 관련 특허도 다수 보고되고 있다. 이에 본 연구에서는 두 가지 agarase효소 중 대부분을 차지하는 β-agarase의 대량 생산 최적화를 위해 효모 Pichia pastoris에서 재조합 agarase를 분비 생산 하고자 하였다. 사용된 agaB 유전자 (ORF 1, 062 bp)는 해양미생물 Zobellia galactanivorans 유래의 extracellular endo-β-agarase를 코드하고, agarose Bagmenl를 효율적으로 분해한다고 보고되어 있으며 , 대장균에서 재조합 agarase가 유도 발현되었을 때 100 unit/㎍의 specific activity를 보였다[9].

제안 방법

Agarose의 β-1, 4결합을 분해하는 Zobellia galactanivorans 유래의 β-agarase 유전자(agaB)는 클로닝되었고, AOX1 (alcohol oxidase 1, methanol inducible) promoter 하류에 Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha-1 secretion signal(MFΩl) 연결하여 MFαl-AgaB를 구축하였다. 구축된 plasmid pPIC-AgaB(9 kb)를 Pichia pastoris genome에 HIS4 gene 위치에 integration하였고, colony PCR을 통해 확인하였다.
12M KI)을 이용하여 agar의 분해 정도를 측정하였다[14]. BMMY plate 배지에서 자란 형질전환체의 균체를 증류수로 washing한 후 , 적당량의 h solution을 배지 위에 부어 β-agarase가 분해한 agar의 분해환 크기를 비교 조사하였다.
0 kb)를 구축하였다. Cloning된 agaB 유전자의 서열을 ABI 3730XL DNA analyzer(Applied Bio systems, Vernon Hills, Illinois, USA)로 확인한 후, pPIC- AgaB plasmid를 Pichia 균주 염색체내 HIS4 gene locus에 integration하기 위해 HIS4 유전자내의 SalI으로 처리한 후, P. pastoris GS115 균주에 electroporation법을 이용하여 형질 전환하였다 [12].
Colony PCR은 94℃에서 5분간 lcycle의 pre denaturation 후, 94°C에서 30초간 denaturation, 58°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1 분간의 polymerization으로 30cycles을 수행했고, 마지막으로 72°C에서 5분간 post polymerization을 수행했다. Colony PCR로 agaB 유전자의 integration이 확인된 재조합 형질전환체를 선별한 후 단백질의 발현 여부를 확인하였다. Test tube와 flask 배양에서 종균 배양시 BMGY 배지 (pH 6.
Methanol 첨가에 의해 발현 유도된 β-agarase는 자체 signal sequence대신 고효율 분비서열인 MFαl s.s를 가지고 있어 배양 상등액으로의 분비가 가능함으로 배양 상등액을 이용하여 재조합 β-agarase의 단백질을 확인해 보았다(Fig. 2). 10% polyacrylamide gel을 이용한 SDS-PAGE 결과, Pagarase 단백질로 추정되는 위치에 두 개의 band가 관찰되었고, iodine용액을 이용한 zymographic analysis에서 이 두 개의 band는 58kDa과 67 kDg 분자량을 가진 재조합 β- agarase임을 확인하였다(Fig.
각 효소들의 분비효율 (secretion efficiency)은 전체 효소활성 (세포외 활성 + 세포 내 활성)에 대한 세포외 효소 활성비를 백분율로 나타내었다. Plate 상에서의 효소활성도를 확인하기 위한 정성분석(plate active staining)에는 I2 solution(0.05M I2/0.12M KI)을 이용하여 agar의 분해 정도를 측정하였다[14]. BMMY plate 배지에서 자란 형질전환체의 균체를 증류수로 washing한 후 , 적당량의 h solution을 배지 위에 부어 β-agarase가 분해한 agar의 분해환 크기를 비교 조사하였다.
0) 용액 에 서 10분간 washing 한 후, 20% isopropanol 용액에서 10분, 증류수에서 10분간 2번의 washing을 통해 SDS를 제거하였다. SDS가 제거된 gel은 TAPS buff&에서 10분간 담근 후, 1.5% agar plate에 중층한 후, 40℃에서 40분간 반응하고, I₂ solution을 이용하여 활성을 확인하였다.
Colony PCR로 agaB 유전자의 integration이 확인된 재조합 형질전환체를 선별한 후 단백질의 발현 여부를 확인하였다. Test tube와 flask 배양에서 종균 배양시 BMGY 배지 (pH 6.0 100 mM 인산완충액, 1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% yeast nitrogen without amino acid, 0.004% biotin, 1% glycerol)를 사용하여 30°C, 190 rpm 조건으로 0&0=2정도 일 때 까지 배양 후, 10분간 원심분리하여 균체만(pH 6.0, 100 mM 인산완충액 5mL 에 현탁) BMMY 배지 (BMGY 배지의 glycerol 대신 0.05% 메탄올 첨가)로 옮겨 30°C, 190 rpm에서 48시간 동안 배양하였다. 이때 메탄올 첨가에 의한 효율적 단백질 발현 유도를 위해 12시간 마다 BMMY 배지에 각각 0.
Z galactamvoransfKC^C #12921genomic DNA를 주형으로 agaB 유전자의 자체 signal sequence(54 bpp} 제거된 1, 008 bp의 agaB 유전자를 PCR로 중폭한 뒤, pGEM Teasy vector 에 subckming하여, pGEM-agaB plasmid를 구축하였다. P.
5 mm)를 사용하여 crude extracts 분획을 얻었으며 [18], 이들 분획과 상등액을 사용하여 각 분획에서의 효소활성을 측정하였다. β-agarase 효소 활성은 DNS법 (3, 5-dinitrosalicylic acid)[20]을 이용하여 측정하였는데, 0.25%(w/v) agar(Junsei chemical Co., Tokyo, Japan)가 포함된 기질 용액 (50mM TAPS(N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid) buffer, pH 8.5)에 효소용액을 첨가해서 40℃에서 15 분간 반응시킨 후 DNS용액을 첨가하였다. 5분간 boiling하고 ice에서 5분간 cooling 후에 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
구축된 pPIC-AgaB plasmid를 Sall 처리한 후, Pichia GS115 균주에 형질전환하여 MD배지에서 1차 선별하였다. 13개의 형질전환체를 선별하여 agaB 유전자의 integration 여부를 확인해보기 위해 colony PCR을 수행한 결과, 13개 중 8개의 형질전환체에서 1 kb의 agaB 유전자가 증폭되었고, agaB 유전자를 가진 cassette가 성공적으로 Pichia 균주 염색체 내로 integration 되었음을 확인할 수 있었다.
구축된 plasmid pPIC-AgaB(9 kb)를 Pichia pastoris genome에 HIS4 gene 위치에 integration하였고, colony PCR을 통해 확인하였다. Methanol 첨가 배지에서 자란 형질전환체는 iodine solutions] 첨가에 의해 red halos를 보였으며, R pastoris에서 agaB의 효율적 분비 발현을 확인하였다.
균체 외 재조합 β-agarase를 사용하여 열안정성을 조사하였다. 재조합 β-agarase의 열안정성은 45℃에서 4시간 후에도 약 70% 정도로 활성을 유지하며, 50℃에서는 반감기가 약 40분이었다(Fig.
균체 침전물은 beadbeater(Biospec, Thailand)와 glass beads (0.5 mm)를 사용하여 crude extracts 분획을 얻었으며 [18], 이들 분획과 상등액을 사용하여 각 분획에서의 효소활성을 측정하였다. β-agarase 효소 활성은 DNS법 (3, 5-dinitrosalicylic acid)[20]을 이용하여 측정하였는데, 0.
Carbohydrate chains의 제거는 SDS-PAGE 를 통해 확인되었다. 또한 재조합 β-agarase의 열 안정성은 효소액을 각각 40, 45, 50, 55, 60°C에서 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, O/N으로 반응시킨 후, 효소활성을 측정함으로써 조사되었다.
34 unit/mL)를 선별하여 50 mL baffled flask 배양을 수행하였다. 먼저 BMGY 배지에서 세포의 성장을 중가시키고 methanol 포함된 BMMY 배지에서 단백질의 발현을 유도하였다. 이때 methanol의 농도에 따른 β- agarase활성에의 영향을 비교하기 위해 매 12시간마다 methanol 0.
5, 1%의 농도로 발현을 유도하였다. 배양이 끝난 배양액을 회수하여 배양 상등액, 균체 파쇄물로 분획하여 효소 활성을 측정하였다. Methanol 유도농도에 따른 효소 활성은 배양시간에 따라 증가되어 배양 48시간째 최대 1.
agaB 유전자를 Pichia 균주 내에서 발현 . 분비시키기 위한 plasmid를 구축하기 위해서, agaB유전자의 자체 signal sequence가 제거된 agaB 유전자를 S. cerevisiae MFαl signal sequence(ss) 하류에 연결시켜 AOX1 promoter하류에 agaB유전 자를 cloning한 pPIC-AgaB plasmid(9.0 kb)를 구축하였다. MFal 분비신호서열과 agaB 유전자와의 연결 부위 는 5'-CTCGAGAAAAGAGGCGACAATTCAAAA-3' 서열을 가지고 있어 XhoI으로 절단하여 연결함으로서 LQKRGDNSK의 아미노산 서열을 가지게 되어, 번역 후 분비 과정에서 KEX2 protease에 의해서 절단되어 β-agarase 단백질을 분비할 수 있게 된다.
0 kb)를 주형으로 양쪽에 Xhol시과 EcoRI site를 가진 agaB 유전자를 PCR로 증폭하였다. 얻어진 단편을 Xhol과 EcoRl으로 처리한 후, Pichia 발현용 vector, pPIC₉에 cloning 하여 pPIC-AgaB plasmid(9.0 kb)를 구축하였다. Cloning된 agaB 유전자의 서열을 ABI 3730XL DNA analyzer(Applied Bio systems, Vernon Hills, Illinois, USA)로 확인한 후, pPIC- AgaB plasmid를 Pichia 균주 염색체내 HIS4 gene locus에 integration하기 위해 HIS4 유전자내의 SalI으로 처리한 후, P.
pastoris에서 agaB 유전자의 분비 발현을 위한 plasmid 구축을 위해서는 먼저 forward primer(5'-J-GCGCTC- GAGAAAAGAGGCGACAATTCAAAATT-3')와 reverse primer(5' -CGCGAATTCTTArTTCTCTACAGGrTT-3')를 제작했다. 이 primer 이용하여 pGEM-agaB plasmid(4.0 kb)를 주형으로 양쪽에 Xhol시과 EcoRI site를 가진 agaB 유전자를 PCR로 증폭하였다. 얻어진 단편을 Xhol과 EcoRl으로 처리한 후, Pichia 발현용 vector, pPIC₉에 cloning 하여 pPIC-AgaB plasmid(9.
먼저 BMGY 배지에서 세포의 성장을 중가시키고 methanol 포함된 BMMY 배지에서 단백질의 발현을 유도하였다. 이때 methanol의 농도에 따른 β- agarase활성에의 영향을 비교하기 위해 매 12시간마다 methanol 0.1, 0.5, 1%의 농도로 발현을 유도하였다. 배양이 끝난 배양액을 회수하여 배양 상등액, 균체 파쇄물로 분획하여 효소 활성을 측정하였다.
05% 메탄올 첨가)로 옮겨 30°C, 190 rpm에서 48시간 동안 배양하였다. 이때 메탄올 첨가에 의한 효율적 단백질 발현 유도를 위해 12시간 마다 BMMY 배지에 각각 0.1%, 0.5%, 1% 농도로 메탄올이 첨가되었다.

대상 데이터

Colony active staining에서 분해환을 보이는 P. pastoris GS115/pPIC-AgaB 균주 8개를 10 mL te마 tube에서 배양하였다. 그 중 가장 높은 활성을 보이는 P.
Stand ard 단백질로는 bovine serum albumin(BSA)을 사용하였다. SDS-PAGE는 Laemmli법 [16]에 따라 0.
Z galactanivorans 유래의 β-agarase 유전자(agaB) 발현 plasmid 구축 및 증푸을 위한 숙주세포로 E. coli DH₅oc가 사용되었고, 효모숙주세 포는 histidine 영양요구성 변이 주인 P. pastoris GS115(his4, Mut+) 균주(Invitrogen Co., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. Plasmid 구축에 사용된 vectoi는 대장균용 pGEM T-easy vector(Promega, Madison, WI, USA)와 메탄올 자화효모 발현 vector인 pPIC₉ vector (Invitogen Co.
pastoris GS115/pPIC-AgaB 균주 8개를 10 mL te마 tube에서 배양하였다. 그 중 가장 높은 활성을 보이는 P. pastoris GS115/ pPIC-AgaB 균주(0.34 unit/mL)를 선별하여 50 mL baffled flask 배양을 수행하였다. 먼저 BMGY 배지에서 세포의 성장을 중가시키고 methanol 포함된 BMMY 배지에서 단백질의 발현을 유도하였다.
효모 형질전환체의 선별을 위한 배지로 MD 배지(1.34% yeast nitrogen base without amino acids(YNB), 2% dextrose, 0.004% biotin, 18.2% sorbitol)# 사용하였다. 선별된 형질전환체는 colony PCR과 plate active staining법을 통해 1차 선별되었다.

이론/모형

Stand ard 단백질로는 bovine serum albumin(BSA)을 사용하였다. SDS-PAGE는 Laemmli법 [16]에 따라 0.4% sodium dodecyl sulfate(SDS)의 존재 하에서 10% polyacrylamide gel 농도로 PAGE를 수행하였고, 전기영동 후 gel을 coomassie brilliant Blue R로 염색하여 분석하였다. β-agarase 활성의 zymographic analysis를 위해 SDS-PAGE가 끝난 gel은 2.
β-agarase 단백질의 농도는 세포 배양 후 13, 000 g에서 5 분간 원심분리한 배양 상등액을 회수하여 Bio-Rad protein assay kit를 이용한 Bradford method로 측정하였다. Stand ard 단백질로는 bovine serum albumin(BSA)을 사용하였다.
2% sorbitol)# 사용하였다. 선별된 형질전환체는 colony PCR과 plate active staining법을 통해 1차 선별되었다. Colony PCR은 94℃에서 5분간 lcycle의 pre denaturation 후, 94°C에서 30초간 denaturation, 58°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1 분간의 polymerization으로 30cycles을 수행했고, 마지막으로 72°C에서 5분간 post polymerization을 수행했다.

성능/효과

2). 10% polyacrylamide gel을 이용한 SDS-PAGE 결과, Pagarase 단백질로 추정되는 위치에 두 개의 band가 관찰되었고, iodine용액을 이용한 zymographic analysis에서 이 두 개의 band는 58kDa과 67 kDg 분자량을 가진 재조합 β- agarase임을 확인하였다(Fig. 2A). 효모를 숙주세포로 이용하여 외래 단백질을 생산하는 경우에는 번역 후 수식 (post- translational modification) 과정의 중]-나로 N-linked glycosy lation^] 일어나 발현된 단백질의 분자량 증가를 보이는 경우가 많다.
선별하였다. 13개의 형질전환체를 선별하여 agaB 유전자의 integration 여부를 확인해보기 위해 colony PCR을 수행한 결과, 13개 중 8개의 형질전환체에서 1 kb의 agaB 유전자가 증폭되었고, agaB 유전자를 가진 cassette가 성공적으로 Pichia 균주 염색체 내로 integration 되었음을 확인할 수 있었다. 또한 integratiori된 agaB 유전자의 발현 유무를 plate active staining을 통해 확인해 본 결과, 선별된 재조합 균주에서 선명한 agar 분해환이 나타나 $-agarase가 성공적으로 분비 .
4). E.coli에서 발현된 재조합 β-agarase 가 45℃, 50℃에서 반감기가 20분 이하임을 감안하면(data not shown), 에서 발현된 재조합 β-agarase의 열 안정성은 매우 향상되었음을 알 수 있고, 이는 재조합 효소에 발생한 hyper-glycosylation에 기인하는 것으로 판단된다. 실제로 세균의 glucanase와 glucoamylase를 효모에서 발현시켰을 경우 glycosylation에 의한 열안정성 증가가 보고 되어있다[6, 23].
배양이 끝난 배양액을 회수하여 배양 상등액, 균체 파쇄물로 분획하여 효소 활성을 측정하였다. Methanol 유도농도에 따른 효소 활성은 배양시간에 따라 증가되어 배양 48시간째 최대 1.34〜L53 units/mL을 보였고, 최대 균체농도는 OD₆₀₀ = 27〜32에 도달하였다(Fig. 3). 첨가된 methanol은 탄소원으로 이용될 수 있으므로 methanol 농도 증가에 따른 균체 농도의 증가 및 효소활성은 비례적인 증가를 보임을 알 수가 있었고, 균체 농도당 효소활성 (specific activity)을 측정해 보았을 때, 그 차이 가 나지 않는 것으로 보아(약 0.
구축된 plasmid pPIC-AgaB(9 kb)를 Pichia pastoris genome에 HIS4 gene 위치에 integration하였고, colony PCR을 통해 확인하였다. Methanol 첨가 배지에서 자란 형질전환체는 iodine solutions] 첨가에 의해 red halos를 보였으며, R pastoris에서 agaB의 효율적 분비 발현을 확인하였다. SDS-PAGE와 zymographic analysis에서 β-agarase의 분자량은 약 53 kDa 으로 추정되었으며, 15% 정도의 N-linked glycosylation0] 일어났음을 알 수 있었다.
SDS-PAGE와 zymographic analysis에서 β-agarase의 분자량은 약 53 kDa 으로 추정되었으며, 15% 정도의 N-linked glycosylation0] 일어났음을 알 수 있었다. P. pastoris GS115/pPIC-AgaB의 48시간 baffled flask culture에서 세포외 β-agarase의 활성은 각각 0.1, 0.5, 1% methanol의 유도에 의해 1.34, 1.42 그리고 1.53 units/mL의 활성을 보였다. 대부분의 β-agarase의 활성은 세포 외에서 관찰되었고, 분비효율은 98%였으며 분비 시의 glycosylation에 의해 열안정성도 증가되었다.
Methanol 첨가 배지에서 자란 형질전환체는 iodine solutions] 첨가에 의해 red halos를 보였으며, R pastoris에서 agaB의 효율적 분비 발현을 확인하였다. SDS-PAGE와 zymographic analysis에서 β-agarase의 분자량은 약 53 kDa 으로 추정되었으며, 15% 정도의 N-linked glycosylation0] 일어났음을 알 수 있었다. P.
또한 당 제거에 의한 β- agarase 활성의 변화는 보이지 않았다. 따라서 53 kDa 재조합 p-agarase 단백질의 asparagine 잔기 (AsmX-Ser/Thr)에 high mannose type의 N-linked glycosylation0] 발생하여 약 15% 정도의 glycosylation이 일어나 단백질의 분자량 증가를 보였음을 알 수 있었다. 또한 E.
13개의 형질전환체를 선별하여 agaB 유전자의 integration 여부를 확인해보기 위해 colony PCR을 수행한 결과, 13개 중 8개의 형질전환체에서 1 kb의 agaB 유전자가 증폭되었고, agaB 유전자를 가진 cassette가 성공적으로 Pichia 균주 염색체 내로 integration 되었음을 확인할 수 있었다. 또한 integratiori된 agaB 유전자의 발현 유무를 plate active staining을 통해 확인해 본 결과, 선별된 재조합 균주에서 선명한 agar 분해환이 나타나 $-agarase가 성공적으로 분비 . 발현됨을 확인할 수 있었다(Fig.
1 %의 methanol 농도로도 충분히 유전자의 발현을 유도시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한 최종 선별된 재조합 균주에서 발현된 β-agarase는 AOX1 promoter와 MFαl s.s 의 조절 하에 안정적으로 배양상등액으로 분비됨을 확인하였고, 세포 내 효소활성은 약 0.02 units/mL로 활성이 거의 없어 모든 유도조건에서 약 98% 이상의 분비효율(secretion efficiency)을 보임을 알 수 있었다.
이상의 결과로 재조합 β-agarase는 Pichia 효모균주에서 A OXI promoter와 MFαl 분비신호를 이용하여 효율적으로 과 발현 분비 생산되며 , 분비 시의 glycosylation에 의해 재조합 단백질의 열안정성도 크게 향상됨을 알 수 있었다.
효모를 숙주세포로 이용하여 외래 단백질을 생산하는 경우에는 번역 후 수식 (post- translational modification) 과정의 중]-나로 N-linked glycosy lation^] 일어나 발현된 단백질의 분자량 증가를 보이는 경우가 많다. 재조합 P-agarasef- Endo-H 처리를 하여 분자량의 변화를 확인해 본 결과, 이ycosylation이 되었을 거라 생각되는 67 kDa의 단백질은 약 53 kDa으로 분자량이 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 또한 당 제거에 의한 β- agarase 활성의 변화는 보이지 않았다.
3). 첨가된 methanol은 탄소원으로 이용될 수 있으므로 methanol 농도 증가에 따른 균체 농도의 증가 및 효소활성은 비례적인 증가를 보임을 알 수가 있었고, 균체 농도당 효소활성 (specific activity)을 측정해 보았을 때, 그 차이 가 나지 않는 것으로 보아(약 0.05 unit/mL/ OD₆₀₀), 0.1 %의 methanol 농도로도 충분히 유전자의 발현을 유도시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한 최종 선별된 재조합 균주에서 발현된 β-agarase는 AOX1 promoter와 MFαl s.

후속연구

한천은 국내에 풍부하게 존재하고 있어 오래 전부터 젤리 등을 생산하는 식품산업과 다이어트 식품으로 널리 이용되고 있으몌3], 의약품, 그리고 미생물 및 식물배양을 위한 배지 고형제 등 중요한 산업 원료로 사용되고 있다. 더욱이, 지구온난화에 따른 친환경 바이오 연료의 공급이 시급해짐에 따라 바이오에탄올 생산을 위한 새로운 바이오매스로서 해조류 유래 다당류의 이용도 기대할 수 있을 것이다. 또한, agarose로부터의 분해산물인 agarooligosaccharide 및 neoagarooligosaccharide는 항산화, 항염증, 항암효과 및 세포사멸유도와 같은 생리적 활성 및 전분 노화에 대한 억제작용, 보습효과 그리고 미백효과 등 많은 유용한 기능을 나타내며 이들을 활용한 제품은 부가가치가 매우 높은 것으로 알려져 있다[7, 11, 17, 25],

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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