Methylotrophic Yeast, Pichia pastoris에서 사람 락토페린의 발현 및 항균성 연구 Expression and Antibacterial Activity of Recombinant Human Lactoferrin in Methylotrophic Yeast, Pichia pastoris원문보기
사람의 모유에 많이 함유된 human lactoferrin(hLF)은 항균 및 항 바이러스 작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 hLf를 메탄올자화 효모인 Pichia pastoris에 cloning하고 그 발현을 RT-PCR, Northern blotting, SDS-PAGE및 Western blotting으로 확인하였다. 그 결과 2.1 kb의 hLf 유전자가 P.pastoris의 염색체 DNA로 끼어들어가 안정적으로 hLf를 발현하였다. 이 재조합 P.pastotis로부터 hLf를 포함하는 세포 추출액을 얻어 항균 작용을 연구하였다. 발현된 재조합 hLf는 Staphylococcus aureus, Micrococcus flavus 등의 그람 양성균에 대해 강력한 항균작용을 보일 뿐만 아니라 그람 음성 동물성 병원균인 Pseudomonas fluorescens ID 9631, E. coli ATCC8739, 25922,35 등과 Salmonella typhimurium 114,115 등 다양한 균에 대해서도 강력한 항균작용을 보였다. 이는 재조합 hLf가 생물학적 활성이 있다는 것을 보여준다.
사람의 모유에 많이 함유된 human lactoferrin(hLF)은 항균 및 항 바이러스 작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 hLf를 메탄올자화 효모인 Pichia pastoris에 cloning하고 그 발현을 RT-PCR, Northern blotting, SDS-PAGE및 Western blotting으로 확인하였다. 그 결과 2.1 kb의 hLf 유전자가 P.pastoris의 염색체 DNA로 끼어들어가 안정적으로 hLf를 발현하였다. 이 재조합 P.pastotis로부터 hLf를 포함하는 세포 추출액을 얻어 항균 작용을 연구하였다. 발현된 재조합 hLf는 Staphylococcus aureus, Micrococcus flavus 등의 그람 양성균에 대해 강력한 항균작용을 보일 뿐만 아니라 그람 음성 동물성 병원균인 Pseudomonas fluorescens ID 9631, E. coli ATCC8739, 25922,35 등과 Salmonella typhimurium 114,115 등 다양한 균에 대해서도 강력한 항균작용을 보였다. 이는 재조합 hLf가 생물학적 활성이 있다는 것을 보여준다.
The expression and antibacterial. activity of recombinant human lactoferrin (hLf) was studied from methylotrophic yeast Pichia pastoris. The gene encoding hLf, isolated from human breast cDNA library, was subcloned into the expression vector, pPIC3.5K under the control of AOX1 promoter. The gene wa...
The expression and antibacterial. activity of recombinant human lactoferrin (hLf) was studied from methylotrophic yeast Pichia pastoris. The gene encoding hLf, isolated from human breast cDNA library, was subcloned into the expression vector, pPIC3.5K under the control of AOX1 promoter. The gene was integrated into the host chromosome and was identified by Southern blotting. The expression of the integrated gene was investigated by RT-PCR, Northern blotting, SDS-PAGE and Western blotting. Discrete band corresponding to hLf was detected from the SDS-PAGE, which was confirmed by Western blotting. The expression was also confirmed by RT-PCR and Northern blotting. The antibacterial activity of the recombinant hLf (rhLf) was investigated using Staphylococcus aureus ATCC 6538P and Micrococcus flavus ATCC 10240 as test organisms. The rhLf showed strong antibacterial activities against the bacteria. Furthermore, many Gram-negative animal pathogens such as E.coli ATCC8739, 25922, and Salmonella typhimurium 114 and 115, Pseudomonas fluorescens ID 963 I, P. aeruginosa KCCM 11802, and Gram-positive bacteria Bacillus mesentericus were also inhibited in their growth by the rhLf.
The expression and antibacterial. activity of recombinant human lactoferrin (hLf) was studied from methylotrophic yeast Pichia pastoris. The gene encoding hLf, isolated from human breast cDNA library, was subcloned into the expression vector, pPIC3.5K under the control of AOX1 promoter. The gene was integrated into the host chromosome and was identified by Southern blotting. The expression of the integrated gene was investigated by RT-PCR, Northern blotting, SDS-PAGE and Western blotting. Discrete band corresponding to hLf was detected from the SDS-PAGE, which was confirmed by Western blotting. The expression was also confirmed by RT-PCR and Northern blotting. The antibacterial activity of the recombinant hLf (rhLf) was investigated using Staphylococcus aureus ATCC 6538P and Micrococcus flavus ATCC 10240 as test organisms. The rhLf showed strong antibacterial activities against the bacteria. Furthermore, many Gram-negative animal pathogens such as E.coli ATCC8739, 25922, and Salmonella typhimurium 114 and 115, Pseudomonas fluorescens ID 963 I, P. aeruginosa KCCM 11802, and Gram-positive bacteria Bacillus mesentericus were also inhibited in their growth by the rhLf.
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제안 방법
CCTGAGAAATTCACAGX 사용하여 PCR 로 증폭하였다 (Thermal cycler: Perkin Elmer Co). 증폭된 2.
Northern blotting을 위해 수획된 RNA를 1% formaldehyde agarose gel에서 전기영동한 후, nylon membrane에 transfer하여 probe와 hybridization하였다. Northern blottinge 위해서 사용한 probe는 hLf의 2.
pastoris 의 염색체 DNA 내로 integration시켰으며 나타난 형질 전환 체중 His+ Mut+ 표현형을 보이는 균주들을 선별하고 이들을 여러 방법을 사용하여 확인하고 동정하였다. P. pastoris genome에 hLf gene이 integration되어 있는지를 확인하기 위해 형질전환체의 genomic DNA를 분리한 흐 primer Lf-SF와 Lf-ERB를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 선별된 형질전환체로부터 2.
PCR과 Southern blotting, Northern blotting 및 RT-PCR에 의해 hLf 유전자의 integration 및 전사가 확인된 SM5-3KS로부터 hLf를 발현시키기 위하여, BMGY에서 2일간 배양하여 후,BMMY에 옮겨서 inducer인 methanol을 첨가하였다. 배양시간에 따라 배양액을 원심분리하여 배양액을 취하고, 또한 세포를 용해시킨 후 상등액을 취하여 SDS-PAGE를 수행하였다.
5K-S를 제한 효소 Sall으로 절단하여 직선형으로 만든 후 2 pastoris SMD1168에 형질전환하였다. Plasmid DNA는 재료 및 방법에서술한 대로 P. pastoris 의 염색체 DNA 내로 integration시켰으며 나타난 형질 전환 체중 His+ Mut+ 표현형을 보이는 균주들을 선별하고 이들을 여러 방법을 사용하여 확인하고 동정하였다. P.
SDS-PAGE 에서 확인된 band가 hLf인지를 알아보기 위하여 Western blotting을 수행하였다. Primary antibody는 polyclonal anti-hLf antibody를 사용하였으며, anti-rabbit AP-conjugate에 의한 NBT/ BCIP non-isotopic coloring (Roche Co.)으로 detection하였다. 그 결과 80 kDa의 rhLf band를 확인할 수 있었다 (Fig.
45 ADVANTEC MFS, Inc)하여 용해되지 않은 whole cell debris들을 제거하였다. TGY(1% typtone, 1 % yeast extract, 1% Glucose, 0.5% NaCl) agar plate 위에 M. flavus ATCC 10240와 S. aureus ATCC 6538P를 각각 2%(V/V) 포함한 TGY soft agart- 부어 표면을 건조시킨 후 위에 준비한 세포 추출액 10㎕를 점적한 다음, 하룻밤 배양하여 colony 주위에 생기는 투명환(clear halo)을 확인하였다.
상 등액을 ice/ethanol bath에서 incubation한 뒤 phenol/chloroform을 넣어 다시 한번 추출하고 상등액 만 회수하여 2V의 ethanol로 total RNA를 침전시켰다. 얻어진 total RNA는 DEPC-treated water0!] 녹인 후 RT-PCR을 수행하였다. 이때 primer로는 Lf-SF와 Lf- ERB를 사용하였다.
hLf cDNA 를 포함한 pPIC3.5K-S는 제한효소 Sall 으로 digestion하여 직선형으로 만들어준 후, lithium chloride 방법을 사용하여 P. pastoris SMD1168에 형질전환시켜 Pichia의 염색체내로 Fig. 2와 같이 삽입시켰다. 삽입이 일어나게 되면 His auxotroph이던 P.
RT-PCR을 위해 RNA를 재조합 균주로부터 분리하였다 (16). hLf gene의 integration0] 확인된 형질전환체를 BMMY에서 3일간 배양한 다음, 원심분리하여 균체를 회수하였다.수획된 균체를 AE buffer (50 mM sodium acetate, pH 5.
hLf 유전자를 P. pastoris 의 발현벡터에 subcloning 하기 위하여, 본 실험실에서 제작한 hLf full-length 유전자가 cloning 되어 있는 phLf-8을 주형으로 하여 primer Lf-SF와 Lf-ERB를 사용해서 PCR로 증폭하였다. primer Lf-SF와 Lf-ERB는 hLf gene에 불필요한 부분이 삽입되는 것을 최소로 하고, hLf 유전자의 분비서열과 단백질 coding region을 포함할 수 있는 primer이다.
hLf 유전자의 integration이 확인된 형질전환체 SM5-3KS로부터 total RNA를 분리하여 Northern blotting을 수행하였다. Fig.
1A와 같다. pPIC3.5K-S를 제한 효소 Sall으로 절단하여 직선형으로 만든 후 2 pastoris SMD1168에 형질전환하였다. Plasmid DNA는 재료 및 방법에서술한 대로 P.
5% agar]를 사용하였다. 그리고 hLf 유전자의 발현은 BMGY배지 [1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH6.0), 1.34% YNB, 4x10-5% B, 1% glycerol]와 BMMY배지 (10g yea이 extract, 20 g peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0),1.34% YNB, 4X IO'% B, 0.5% methanol/L)를 이용하여 30 ℃ 에서 진탕배양하였다.
이를 형질전환시킨 후 Southern blotting, PCR, RT-PCR, Northern blotting, SDS-PAGE 및 Western blotting 등의 방법을 통하여 genomic DNA상에 hLf 유전자의 삽입(integration) 여부 및 발현을 확인하였다. 또한 발현된 재조합 hLf(rhLf)가 강력한 항균 작용을 가지고 있음을 생물학적 활성검증방법을 통해 확인하였다.
5C) SM5-3KS의 세포 추출액에 있는 rhLf가 항균 작용을 일으켰음을 알 수 있다. 또한 위의 두 가지 미생물 외 에도 다른 다양한 병원성 균을 이용하여 rhLf의 항균력을 알아보았다. 그 결과 Fig.
pastoris를 hLf protein의 발현숙주로 사용하였다. 먼저 2.1kb의 성숙형 hLf cDNA-S- 얻어cloning을 시도하였으며, P. pasfcwis에 발현시키기 위해 expression vector를 제작하였다. 이를 형질전환시킨 후 Southern blotting, PCR, RT-PCR, Northern blotting, SDS-PAGE 및 Western blotting 등의 방법을 통하여 genomic DNA상에 hLf 유전자의 삽입(integration) 여부 및 발현을 확인하였다.
발현이 확인된 rhLf의 생물학적 활성을 알아보기 위해 여러 균주에 대한 항균 활성을 알아보았다. 대표적인 균주로는 패혈증을 일으키는 S.
PCR과 Southern blotting, Northern blotting 및 RT-PCR에 의해 hLf 유전자의 integration 및 전사가 확인된 SM5-3KS로부터 hLf를 발현시키기 위하여, BMGY에서 2일간 배양하여 후,BMMY에 옮겨서 inducer인 methanol을 첨가하였다. 배양시간에 따라 배양액을 원심분리하여 배양액을 취하고, 또한 세포를 용해시킨 후 상등액을 취하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 음성 대조군으로는 host인 P.
pasfcwis에 발현시키기 위해 expression vector를 제작하였다. 이를 형질전환시킨 후 Southern blotting, PCR, RT-PCR, Northern blotting, SDS-PAGE 및 Western blotting 등의 방법을 통하여 genomic DNA상에 hLf 유전자의 삽입(integration) 여부 및 발현을 확인하였다. 또한 발현된 재조합 hLf(rhLf)가 강력한 항균 작용을 가지고 있음을 생물학적 활성검증방법을 통해 확인하였다.
재조합 P. pastoris 세포를 용해하여 얻은 주줄액(crude extract)을 여과(pore size 0.45 ADVANTEC MFS, Inc)하여 용해되지 않은 whole cell debris들을 제거하였다. TGY(1% typtone, 1 % yeast extract, 1% Glucose, 0.
CCTGAGAAATTCACAGX 사용하여 PCR 로 증폭하였다 (Thermal cycler: Perkin Elmer Co). 증폭된 2.1 kb hLf 유전자는 전기영동을 수행하여 확인한 후 electroelution 방법과 Wizard™ Clean-Up system (Promega, Co. USA.)을 사용하여 회수하였으며, pGEM-T vector (Promega Co.)에 subcloning 하였다.
3A와 B에서 보는 바와 같이 hLf 특이적mRNA가 SM5-3KS에서 만 나타나는 것을 알 수 있으며 이는 integrated hLf 유전자가 transcription 되어 발현된다는 것을 나타낸다. 한편 분리된 total RNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. 이때 primer는 LF-SF와 LF-ERB를 사용하였다.
형질전환체 의 genomic DNA는 lysis buffer (2, 5 M LiCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 4% Triton X-100, 62.5 mM N%EDTA)와 glass bead를 이용하여 분리하였다. 즉, P.
형질전환체의 genomic DNA에 2.1 kb hLf gene이 제대로 삽입되어 있는지 확인하고자, Lf-SF와 Lf-ERB를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이들 각 primer sequence는 위에 기술하였다.
대상 데이터
5% NaCl)를 사용하였고, 필요시 50의 ampicillin을 첨가하여 사용하였으며, 37℃에서 배양하였다. P. pastaris는 YPD배지 [1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose(D)] 에서 배양하였으며, 형질전환체의 선별을 위해서는 MD agar배지 [1.34% yeast nitrogen base (YNB), 4 X 10'5% biotin (B), 2% dextrose, 1.5% agar]와 MM agar배지 [1.34% YNB, 4x IO'5% B, 0.5% methanol (M), 1.5% agar]를 사용하였다. 그리고 hLf 유전자의 발현은 BMGY배지 [1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH6.
발현이 확인된 rhLf의 생물학적 활성을 알아보기 위해 여러 균주에 대한 항균 활성을 알아보았다. 대표적인 균주로는 패혈증을 일으키는 S. aureus ATCC 6538P와 식중독균인 M. flavus ATCC 10240을 사용하였다. 그 결과 대조군에 대해 SM5-3KS의 세포 추출액 만이 두 균주에 대한 항균 활성을 나타내었다.
본 실험에서 사용된 균주인 P. pastorise 발현벡터인 pPIC3.5K는 Invitrogen에서 구입하였으며 그 외 사용된 균주와 플라스미드는 Table 1에 나타내었다. 본 실험에서 사용한 미생물 균주는 특별한 언급이 없는 한 LB배지(1% Bacto-tryptone, 0.
5K는 Invitrogen에서 구입하였으며 그 외 사용된 균주와 플라스미드는 Table 1에 나타내었다. 본 실험에서 사용한 미생물 균주는 특별한 언급이 없는 한 LB배지(1% Bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl)를 사용하였고, 필요시 50의 ampicillin을 첨가하여 사용하였으며, 37℃에서 배양하였다. P.
(7, 17).본 실험에서는 이러한 다수의 강점을 갖고 있는 P. pastoris를 hLf protein의 발현숙주로 사용하였다. 먼저 2.
배양시간에 따라 배양액을 원심분리하여 배양액을 취하고, 또한 세포를 용해시킨 후 상등액을 취하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 음성 대조군으로는 host인 P. pastorise pPIC3.5K가 integration 되어 있는 형질전환체를 사용하였으며, 양성대조군으로는 본 실험실에서 모유로부터 정제한 hLf를 사용하였다. Fig.
5K-S에 포함되어 있던 HIS4 gene의 발현으로 histidine이 첨가되지 않은 배지에서 자랄 수 있게 된다. 이들 형질전환체 중에서 MD와 MM agar 배지에서 모두 잘 자라게 되는 형 질전환체 (His+ Mk)를 선별하였다.
이론/모형
4A에서 보는 바와 같이, 음성 대조군에서는 아무런 band도 나타나지 않은 반면, 각각의 Pichia 형질 전환체에서는 양성대조군인 hLf protein과 같은 위치(약 80 kDa)에서 hLf band를 확인할 수 있었다. SDS-PAGE 에서 확인된 band가 hLf인지를 알아보기 위하여 Western blotting을 수행하였다. Primary antibody는 polyclonal anti-hLf antibody를 사용하였으며, anti-rabbit AP-conjugate에 의한 NBT/ BCIP non-isotopic coloring (Roche Co.
1% bromophenol blue, 10% glycerol) 를 넣은 후 끓는 물에서 5분간 중탕한 뒤 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 한편 발현된 hLf를 분석하기 위하여 electrophoresis 후 SDS-FAGE 상의 단백질을 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane에 electrophoretic transfer 한 후 Western blotting을 수행하였다 (15). Primary antibody는 rabbit anti-hLf (Sigma Co.
성능/효과
한편 Southern blot을 통해서도 SM5-3KS의 genomic DNA내에 hLf 유전자가 integration되어 있음을 다시 확인하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 SM5-3K의 염색체 DNA를 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 hLf 유전자를 분리시키고, 다시 이를 Bg/II로 절단한 다음 probe로 탐색한 결과 hLf의 BglⅡ에 해당하는 절편들을 찾을 수 있었다. 이는 hLf 유전자가 P.
그 결과 재조합P. pastoris인 SM5-3KS에서 2.1kb hLf 유전자의 band가 증폭되어 나타났으며, 이를 통해 hLf 유전자가 P. pastoris 내에서 안정적으로 발현되는 것을 알 수 있다. (Fig.
)으로 detection하였다. 그 결과 80 kDa의 rhLf band를 확인할 수 있었다 (Fig. 4B).그러나 Northern blotting이나 RT-PCR에서 나타난 것과 다르게 발현된 hLf는 그 양이 적은 것으로 생각된다.
flavus ATCC 10240을 사용하였다. 그 결과 대조군에 대해 SM5-3KS의 세포 추출액 만이 두 균주에 대한 항균 활성을 나타내었다. Fig.
pastoris genome에 hLf gene이 integration되어 있는지를 확인하기 위해 형질전환체의 genomic DNA를 분리한 흐 primer Lf-SF와 Lf-ERB를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 선별된 형질전환체로부터 2.1kb hLf cDNA의 band가 증폭되어 나타났으며, 이는 2.1 kb hLf cDNA가 P. pastoris의 염색체 내에 integration되어 있음을 나타낸다 (Fig. IB). 이 재조합 P.
이와 같은 유추의 간접적인 증거로서 배양시간이 길어질수록 hLf의 degradation fragment로 보이는 band 들이 SDS-PAGE 상에 많이 나타나며, 또한 Western blotting시에 이들 small fragment들이 anti-hLf antibody 에 의해 검줄된다는 점이다(자료 미제시). 한편 pPIC3.5K는 외부 단백질을 세포 내에 축적시키는 발현벡터로서 분비signal을 가지고 있지 않기 때문에, 본 실험에서는 hLf를 세포 외로 분비시키고자 hLf cDNA의 분비signal을 포함하여 cloning 하였으나 세포 안에 존재하는 rhLf만이 확인되었으며 세포배양액으로 분비된 rhLf는 확인할 수 없었다. 그러나 발현된 hLf를 세포배양액에서 확인할 수 없다는 사실만으로는 hLf의 분비signal이 P.
후속연구
(11, 13). 따라서 본 연구에서 발현된 rhLf 를 이용하여 항바이러스성을 연구하고, 더 나아가 이를 이용하여 치명적 바이러스에 대한 항바이러스 제제로 개발에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구실의 연구에 의하면 배양조건을 달리하면 발현율이나 분비가 증가할 수 있는 것으로 나타났기 때문이다. 따라서 향후 이들에 대한 보다 진전된 연구가 필요할 것으로 보인다.
따라서 이러한 항균 활성을 가진 rhLf의 발현은 therapeutic glycoprotein으로서의 hLf의 산업적 이용 시에 매우 유용한 고부가가치를 가질 것으로 예상된다. 물론 앞으로 정제를 통한 정확한 rhLf의 발현량 측정과 사람 및 동물의 병원성 균을 포함한 더욱 다양한 미생물들에 대한 항균 활성 연구 수행이 필요할 것으로 사료된다. 한편 "은 HIV나 HCV, HSV-1, human cyto- megalovirus등 사람에게 치명적인 virus에 대하여 억제 작용이 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 Northern blotting이나 RT-PCR에서 나타난 것과 다르게 발현된 hLf는 그 양이 적은 것으로 생각된다. 이는 추후 확인해야 할 사항이기는 하지만 아마도 발현된 hLf의 세포 내 안정성이 떨어지거나, 또는 intracellular 혹은 extracellular protease에 의해 분해되는 것으로 생각된다. 이와 같은 유추의 간접적인 증거로서 배양시간이 길어질수록 hLf의 degradation fragment로 보이는 band 들이 SDS-PAGE 상에 많이 나타나며, 또한 Western blotting시에 이들 small fragment들이 anti-hLf antibody 에 의해 검줄된다는 점이다(자료 미제시).
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