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문제 정의
- 본 연구는 AuNPs의 세포 생존 및 세포 증식, 이동, 신생혈관 형성 등의 억제효과에 초점을 맞추었다.
- 1989; Cleaver and Melton 2003). 우리는 VEGF로 유도된 신생혈관 형성에 있어서 AuNPs와 PEDF의 효과를 알아보았다. 그 결과는 VEGF로 유도된 신생혈관 형성에 있어서 AuNPs와 PEDF의 억제효과를 확인하였다.
제안 방법
- 6 well plate에 10% FBS가 첨가된 배양액을 이용하여 세포를 1 × 106 cell well-1의 농도로 24시간 동안 부착시킨 후 FBS가 없는 무혈청 배양액으로 갈아준 다음 AuNPs을 처리하였다. 24시간 후 무혈청 배양액을 효소액으로 하여 gelatin이 함유된 10% SDS-PAGE을 이용하여 전기영동 하였다. 4℃에서 60 V 로 12시간 전기영동이 끝난 후에 겔은 SDS를 제거하기 위해 washing buffer 용액으로 30분간 2회 세척한 후 반응 액에 18시간 동안 37℃에 반응시켜 기질분해를 유도하였다.
- 그런 다음 37℃, 5% CO2가 있는 배양기에서 배양하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 혈관을 떼어내고 세포 찌꺼기와 죽은 세포를 MEM 배지로 제거한 다음 매 3일마다 IMDM 배지로 교환해 주었다.
- 4시간 후 배양액을 버리고 DMSO를 200 μL well-1씩을 넣어 5분간 실온 방치하여 푸른색 결정인 formazan을 용해시킨 후 microplate spectrophotometer (Bio-Tech, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 6 well plate에 10% FBS가 첨가된 배양액을 이용하여 세포를 1 × 106 cell well-1의 농도로 24시간 동안 부착시킨 후 FBS가 없는 무혈청 배양액으로 갈아준 다음 AuNPs을 처리하였다.
- 70% 이상의 밀도를 지닌 BRECs를 VEGF (50 ng mL-1) 를 처리하기 전, 정해진 시간에 AuNPs 혹은 양성대조군으로써 PEDF (10 nM)의 존재유무에 따라 무혈청 IMDM 를 12시간 처리하였다. 배지만 처리한 세포를 대조군으로써 사용하였다.
- AuNPs가 MMP-9 효소 활성이 있는지 VEGF로 종양을 촉진시켜 상승 발현된 MMP-9 활성이 억제 여부를 gelatin zymography를 이용해 확인해보았다. 그 결과, 종양 촉진제인 VEGF 처리군에서는 많은 양의 MMP-9 효소의 활성이 나타남을 관찰할 수 있으며 24시간 동안 100, 200 nM의 AuNPs로 처리한 결과 MMP-9 효소의 활성이 농도 의존적으로 억제되었다(Fig.
- AuNPs에 의해 MMP-9 효소의 활성을 억제하였는데 이러한 효소활성이 유전자 발현 조절에 의한 것인지 확인하기 위해 AuNPs가 MMP-9 유전자 발현에 저해 활성이 있는지 VEGF로 종양을 촉진시켜 상승 발현된 MMP-9활성 억제 여부를 RT-PCR로 측정하였다. 그 결과, AuNPs의 처리농도가 증가함에 따라 MMP-9의 발현이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- AuNPs와 PEDF의 역할을 확인하기 위해 우리는 VEGF 로 유도된 BRECs의 증식에 있어서 AuNPs의 억제효과를 확인하였다. BRECs는 24시간 동안 여러 농도(50, 100, 200, 300 nM)로 AuNPs를 처리한 결과, 300 nM 이상의 AuNPs의 처리 농도에서 BRECs의 성장을 억제하였다 (Fig.
- AuNPs의 BRECs에서의 신생혈관 형성 효과를 확인하기 위해 tube formation assay를 시행하였다. BRECs의 신생혈관 형성은 AuNPs의 존재 유무에 따라 현미경 사진기를 통해 관의 길이를 측정하였다.
- AuNPs의 BRECs에서의 신생혈관 형성 효과를 확인하기 위해 tube formation assay를 시행하였다. BRECs의 신생혈관 형성은 AuNPs의 존재 유무에 따라 현미경 사진기를 통해 관의 길이를 측정하였다. Fig.
- PBS로 2회 세척 후 시간별로 BRECs의 이동을 보는 cell migration assay를 시행하였다. BRECs의 이동성은 위상차현미경으로 관찰하였고, 상처 가장자리에서 세포 단일층의 증식을 막는 5-flurouracil (Sigma, USA)의 존재 하에 거리를 측정하였다.
- MMP-9 활성을 알아보기 위해 gelatin zymography를 실시하였다(Herron et al. 1986). 6 well plate에 10% FBS가 첨가된 배양액을 이용하여 세포를 1 × 106 cell well-1의 농도로 24시간 동안 부착시킨 후 FBS가 없는 무혈청 배양액으로 갈아준 다음 AuNPs을 처리하였다.
- Plate 상에서 BRECs의 이동성을 알아보기 위해 plate에 scraper를 이용하여 배양한 세포의 일부분을 제거하였다. PBS로 2회 세척 후 시간별로 BRECs의 이동을 보는 cell migration assay를 시행하였다. BRECs의 이동성은 위상차현미경으로 관찰하였고, 상처 가장자리에서 세포 단일층의 증식을 막는 5-flurouracil (Sigma, USA)의 존재 하에 거리를 측정하였다.
- 5 mm dNTP, 10X buffer, DEPC water, premixed primer 및 Taq DNA polymerase를 넣고 polymerase chain reaction (PCR: Corbett Research, Australia)을 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후에는 증폭된 DNA를 1.2% agrose gel을 이용하여 전기영동하였고 ethidium bromide (EtBr: Sigma, USA)으로 염색한 다음 Alpha ImagerTM (Alpha Innotech Corp, CA)을 이용하여 염색된 DNA를 확인하였다.
- Plate 상에서 BRECs의 이동성을 알아보기 위해 plate에 scraper를 이용하여 배양한 세포의 일부분을 제거하였다. PBS로 2회 세척 후 시간별로 BRECs의 이동을 보는 cell migration assay를 시행하였다.
- Plate 상에서 BRECs의 이동성을 알아보기 위해 plate에 임의로 일정한 굵기의 통로를 만들어 시간별로 BRECs의 이동을 보는 wound healing migration assay를 시행하였다. 200 nM의 AuNPs는 VEGF로 유도된 BRECs의 이동을 시간 의존적으로 감소시켰다.
- VEGF가 유도된 BRECs에서 AuNPs의 영향을 확인하기 위해서 BRECs에 AuNPs (50, 100, 200, 300 nM)와 VEGF (50 ng mL-1)을 동시에 처리하였다. 이때 VEGF를 처리하기 30분전에 AuNPs를 처리했다.
- VEGF와 PEDF, AuNPs 추가하여 24시간 동안 처리한 BRECs는 0.05% trypsin-EDTA 처리, 세척한 후 1×105 cells well-1 수준으로 분주하였다.
- 신생혈관 형성에 있어 AuNPs의 역할을 알아보기 위해 신생혈관 형성과 연관된 많은 과정을 연구해야 한다. 내피세포가 대부분의 치료에서 주로 표적이 되므로 우리는 BRECs에서 VEGF로 유도된 신생혈관 형성에 AuNPs 의 역할을 확인하였다.
- 1A). 따라서 신생혈관관련 실험은 세포독성이 없는 200 nM 이하의 농도에서 수행하였다. BRECs에서 VEGF 로 유도된 세포증식에 대한 AuNPs의 효과를 측정한 결과, AuNPs는 VEGF로 유도된 증식을 억제하였고, AuNPs 와 VEGF를 모두 넣은 처리군은 대조군과 상당한 차이가 있었다(Fig.
- 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 2 μg의 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 만들어진 RT product에 2.5 mm dNTP, 10X buffer, DEPC water, premixed primer 및 Taq DNA polymerase를 넣고 polymerase chain reaction (PCR: Corbett Research, Australia)을 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후에는 증폭된 DNA를 1.
- 미세혈관이 있는 조직을 최종적으로 Isvove’s modified dulbeccos’s medium (IMDM: Sigma, USA) 배지에서 배양하는데 이 배지에는 추가적으로 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco, USA)과 150 μg mL-1의 heparin (Sigma, USA), 10 μg mL-1의 ascorbic acid, 100 U mL-1의 penicillin-G, 100 μg mL-1의 streptomycin, 2.5μg mL-1의 amphotericin-B를 추가하였다.
- 본 연구에서는 금 나노입자(gold nanoparticles, AuNPs) 에 초점을 맞추었다. AuNPs는 소망막내피세포(bovine retinal endothelial cells, BRECs)에서 VEGF로 유도된 신생 혈관 형성을 억제하였다.
- 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 2 μg의 RNA에서 cDNA를 합성하였다.
- 10% FBS가 들어있는 IMEM에 BRECs를 2×103 cells mL-1 세포수로 계수한 다음 96 well plate (Nunc, USA)에 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 세포 증식에 있어서 VEGF, PEDF, AuNPs의 영향을 알아보기 위해 FBS가 들어있는 배양액으로 교환한 다음 다양한 농도의 물질을 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 약 40~50 nm의 AuNPs를 B. licheniformis를 이용하여 합성하였다. 입자의 크기는 평균 50 nm 의 크기로 합성하였고, VEGF나 FGF2로 유도된 신생혈관 형성에서 다양한 탄소 물질의 항신생혈관 형성 효과는 이미 chick chorioallantoic membrane에서 확인되었다 (Murugesan et al.
데이터처리
- 실험 결과의 유의성 검증은 Student’s t test 방법에 따라 실시하였으며, p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- BRECs는 Banumathi et al. (2009)의 방법에 따라 시행하였다. 간단히 말하면 분리한 망막을 세척하고 3 mm로 잘라냈고, 조직은 효소로 분해하였다.
- MTT assay는 Mosmann (1983) 방법에 따라 시행하였다. 10% FBS가 들어있는 IMEM에 BRECs를 2×103 cells mL-1 세포수로 계수한 다음 96 well plate (Nunc, USA)에 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 AuNPs는 미생물을 이용한 정제법을 사용하였다. 실험 방법으로는 먼저, B.
성능/효과
- 1 mM 질산금(AuNO3) 용액은 탈 이온수를 이용해 조제되었고 혼합 용액 100 mL에 생물량이 추가된 후 플라스크를 24시간 동안 37℃, 200 rpm shaker에서 보관 하였다. AuNPs의 크기를 확인하기 위해 UV-vis spectum을 이용하여 440 nm로 조사한 후 그 값을 조사한 결과 직경이 2 nm에서 100 nm의 AuNPs가 분포되었다. 이 중 직경이 40~50 nm의 AuNPs 만을 취하여 냉장 보관하였고, 0.
- AuNPs와 PEDF의 역할을 확인하기 위해 우리는 VEGF 로 유도된 BRECs의 증식에 있어서 AuNPs의 억제효과를 확인하였다. BRECs는 24시간 동안 여러 농도(50, 100, 200, 300 nM)로 AuNPs를 처리한 결과, 300 nM 이상의 AuNPs의 처리 농도에서 BRECs의 성장을 억제하였다 (Fig. 1A). 따라서 신생혈관관련 실험은 세포독성이 없는 200 nM 이하의 농도에서 수행하였다.
- 따라서 신생혈관관련 실험은 세포독성이 없는 200 nM 이하의 농도에서 수행하였다. BRECs에서 VEGF 로 유도된 세포증식에 대한 AuNPs의 효과를 측정한 결과, AuNPs는 VEGF로 유도된 증식을 억제하였고, AuNPs 와 VEGF를 모두 넣은 처리군은 대조군과 상당한 차이가 있었다(Fig. 1B). 또한 VEGF와 PEDF를 함께 배양한 BRECs에서 VEGF로 유도된 증식을 억제한다는 결과를 보여준다.
- AuNPs에 의해 MMP-9 효소의 활성을 억제하였는데 이러한 효소활성이 유전자 발현 조절에 의한 것인지 확인하기 위해 AuNPs가 MMP-9 유전자 발현에 저해 활성이 있는지 VEGF로 종양을 촉진시켜 상승 발현된 MMP-9활성 억제 여부를 RT-PCR로 측정하였다. 그 결과, AuNPs의 처리농도가 증가함에 따라 MMP-9의 발현이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 100, 200 nM의 AuNPs에서 MMP-9의 발현이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig.
- AuNPs가 MMP-9 효소 활성이 있는지 VEGF로 종양을 촉진시켜 상승 발현된 MMP-9 활성이 억제 여부를 gelatin zymography를 이용해 확인해보았다. 그 결과, 종양 촉진제인 VEGF 처리군에서는 많은 양의 MMP-9 효소의 활성이 나타남을 관찰할 수 있으며 24시간 동안 100, 200 nM의 AuNPs로 처리한 결과 MMP-9 효소의 활성이 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 5).
- 우리는 VEGF로 유도된 신생혈관 형성에 있어서 AuNPs와 PEDF의 효과를 알아보았다. 그 결과는 VEGF로 유도된 신생혈관 형성에 있어서 AuNPs와 PEDF의 억제효과를 확인하였다.
- 200 nM의 AuNPs는 VEGF로 유도된 BRECs의 이동을 시간 의존적으로 감소시켰다. 따라서 AuNPs는 VEGF로 유도된 BRECs의 이동을 억제함을 알 수 있었다(Fig. 2).
- AuNPs는 소망막내피세포(bovine retinal endothelial cells, BRECs)에서 VEGF로 유도된 신생 혈관 형성을 억제하였다. 또한 AuNPs가 신생혈관 형성과 세포사멸 기전을 밝혔고, 이러한 결과로 볼 때, 나노입자의 항신생혈관 형성은 당뇨망막병증이나 암과 같은 질환 치료에 있어서 큰 역할을 할 것으로 사료된다.
- 1B). 또한 VEGF와 PEDF를 함께 배양한 BRECs에서 VEGF로 유도된 증식을 억제한다는 결과를 보여준다. 본 실험에서 VEGF로 유도된 증식은 BRECs에서 AuNPs와 PEDF에 의해 억제된다는 결과를 보여주었다.
- 또한 VEGF와 PEDF를 함께 배양한 BRECs에서 VEGF로 유도된 증식을 억제한다는 결과를 보여준다. 본 실험에서 VEGF로 유도된 증식은 BRECs에서 AuNPs와 PEDF에 의해 억제된다는 결과를 보여주었다.
- 본 실험 결과 대부분의 신생혈관 형성 억제자 중 하나인 PEDF는 인간에 있어 가장 강력한 항신생혈관 형성인자 중 하나이다. 본 연구에서 AuNPs와 PEDF 는 BRECs에서의 증식을 억제하고 이것은 즉 BRECs에 직접 작용하여 항신생혈관 형성 효과가 있다는 것을 암시한다. VEGF는 이미 내피세포의 분열에 관여한다고 알려져 있다(Leung et al.
- 현재 PEDF가 항 신생혈관 형성 물질로 제안되고 있다. 본 연구에서 우리는 AuNPs가 BRECs에서 VEGF로 유도된 세포의 증식 및 이동, 신생혈관의 형성을 억제하였고 이는 세포의 성장과 침윤 및 전이와 관련된 신생혈관 형성을 억제한다고 사료된다.
- 또한 VEGF와 PEDF를 동시에 처리한 결과에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 이러한 결과는 AuNPs와 PEDF가 VEGF로 유도된 신생혈관 형성을 억제하는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과, AuNPs의 처리농도가 증가함에 따라 MMP-9의 발현이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 100, 200 nM의 AuNPs에서 MMP-9의 발현이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).
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