Outbreak of contagious diseases to livestock animals is becoming prevalent worldwide and consequently, tremendous numbers of the infected or culled stocks are buried on the ground as the most common disposal method. The buried animals can generate a wide range of detrimental components such as leach...
Outbreak of contagious diseases to livestock animals is becoming prevalent worldwide and consequently, tremendous numbers of the infected or culled stocks are buried on the ground as the most common disposal method. The buried animals can generate a wide range of detrimental components such as leachate, nutrient salts, and pathogenic bacteria, consequently contaminating the surround environment. This implies that regular investigations are required to monitor any possible detrimental environmental aspect occurred around burial sites. Therefore, the current study was conducted to investigate whether the soil and groundwater nearby the burial sites had been contaminated by the substances originated from the burial sites, which can be applied for the establishment of the ideal burial site construction design and post management scheme. For this, two different burial sites located in Cheonan and Pyeongtaek were selected. Cheonan and Pyeongtaek sites were constructed in 2004 and 2008, respectively and both contained dead poultry infected by avian influenza (AI). Soil and groundwater samples were collected around the sites followed by determination of the nutrient concentrations and bacteria (Salmonella, Camphylobacter, and Bacillus) existence in both soil and groundwater. Some of the soil samples showed higher EC, $NH_4$-N, $NO_3$-N concentration compared to those of the background (control) soils. Also the concentration of $NH_4$-N in some of the groundwater samples appeared to exceed the USEPA guideline value for drinking water (10 mg $L^{-1}$). These results indicated that the soil and groundwater were influenced by the burial site originated nutrients. In the soil, Bacillus was isolated in most soil samples while there were no detections of Salmonella and Camplylobacter. Due to the Bacillus existing mainly as a spore in the soils, it was considered that the frequent detection of Bacillus in the soil samples was attributed to the nutrients originated from the burial sites.
Outbreak of contagious diseases to livestock animals is becoming prevalent worldwide and consequently, tremendous numbers of the infected or culled stocks are buried on the ground as the most common disposal method. The buried animals can generate a wide range of detrimental components such as leachate, nutrient salts, and pathogenic bacteria, consequently contaminating the surround environment. This implies that regular investigations are required to monitor any possible detrimental environmental aspect occurred around burial sites. Therefore, the current study was conducted to investigate whether the soil and groundwater nearby the burial sites had been contaminated by the substances originated from the burial sites, which can be applied for the establishment of the ideal burial site construction design and post management scheme. For this, two different burial sites located in Cheonan and Pyeongtaek were selected. Cheonan and Pyeongtaek sites were constructed in 2004 and 2008, respectively and both contained dead poultry infected by avian influenza (AI). Soil and groundwater samples were collected around the sites followed by determination of the nutrient concentrations and bacteria (Salmonella, Camphylobacter, and Bacillus) existence in both soil and groundwater. Some of the soil samples showed higher EC, $NH_4$-N, $NO_3$-N concentration compared to those of the background (control) soils. Also the concentration of $NH_4$-N in some of the groundwater samples appeared to exceed the USEPA guideline value for drinking water (10 mg $L^{-1}$). These results indicated that the soil and groundwater were influenced by the burial site originated nutrients. In the soil, Bacillus was isolated in most soil samples while there were no detections of Salmonella and Camplylobacter. Due to the Bacillus existing mainly as a spore in the soils, it was considered that the frequent detection of Bacillus in the soil samples was attributed to the nutrients originated from the burial sites.
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문제 정의
따라서, 과학적 근거를 바탕으로 현행 매립 규정을 보완하고 통일하여 환경적 부담을 최소화하는 노력이 필요하다. 본 연구는 이와 같은 노력의 일환으로 기존의 매립 규정에 따라 조성된 가축 매몰지 주변의 토양 및 지하수를 대상으로 환경오염인자들을 조사하고 환경적 위해성을 검토하여 매립지 조성 및 관리방안을 모색하는데 있어 추후 고려해야 할 사항들을 제안하고자 수행하였다.
이와 같은 결과는 가금류를 포함한 이들 가축 유래 세균들은 가축 매몰지에서 인체 위해성 환경영향평가를 (세균에 의한 전염병) 위한 조사 대상 세균으로 활용할 수 있음을 시사한다. 본 연구에서는 가금류 매몰지의 내부토양 및 지하수 중 살모넬라균 (Salmonella) 및 캄필로박터균 (Camphylobacter)의 존재 여부를 파악하는 것으로부터 시작하였다.
제안 방법
분리한 16S rDNA에 대해서 자동염기서열분석을 이용하여 클로닝한 16S rDNA유전자의 염기서열을 결정하였다. BLAST program을 이용하여 분석한 16S rDNA 유전자에 대해서 라이브러리를 구축하였다.
각 Primer 20 pmol과, 토양 및 침출수에서 분리한 세균 DNA를 멸균수를 이용하여 최종부피가 되도록 맞춘 후 PCR-premix을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 이용하여 증폭된 16S 유전자 산물을 1.2% agarose gel에 전기영동한 후, Quiaex를 이용하여 분리하였다. 증폭 산물은 QIAEX II gel extraction kit (Qiagen)로 정제하여 자동 염기서열 결정에 사용하였다.
토양 및 침출수에서 분리한 세균의 DNA에서 세균의 16S rDNA 염기서열 증폭은 기존에 알려져 있는 대부분의 세균의 16S rDNA 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 (primer)인 27f (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'), 1492r (5'GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3')를 이용하였다 (Lane, 1991). 각 Primer 20 pmol과, 토양 및 침출수에서 분리한 세균 DNA를 멸균수를 이용하여 최종부피가 되도록 맞춘 후 PCR-premix을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 이용하여 증폭된 16S 유전자 산물을 1.
5 m 깊이에서 각각 채취하였다. 또한 각 매몰지에서 200 m 떨어진 지점의 토양을 대조구 시료로 이용하기 위해서 매몰지 시료와 동일한 깊이의 토양을 채취하였다. 채취한 토양 시료 약 1 kg을 아이스박스를 이용하여 실험실로 운반한 후, 일부는 세균 동정을 위해서 수분을 함유한 상태로 4℃에서 보관하였고 나머지는 화학성 분석을 위해서 풍건한 후 2 mm 체로 걸러서 상온에서 보관하였다.
4303153, Perkin-Elmer Applied Biosystems) 4 μL를 넣고 증류수로 최종 부피가 10 μL가 되게 하였다. 반응은 Perkin Elmer Cetus 9600을 사용하였으며 (95℃ 15초, 50℃ 5초, 그리고 60℃ 4분) 30 cycle을 시행하였다. 반응이 끝난 시료는 Quick Spin Columns for DNA purification (Sephadex G-50 (fine), 1 273 973, Roche Diagnostics Corporation) kit를 이용하여 정제한 후 6.
증폭된 유전자의 산물은 TA 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝한 후, 16S rDNA가 들어있는 세균 집락 (Colony)중 20개를 무작위로 고른 후 클로닝된 16S rDNA 분리하였다. 분리한 16S rDNA에 대해서 자동염기서열분석을 이용하여 클로닝한 16S rDNA유전자의 염기서열을 결정하였다. BLAST program을 이용하여 분석한 16S rDNA 유전자에 대해서 라이브러리를 구축하였다.
수거한 토양 및 침출수에 있는 세균의 DNA를 추출한 후 연쇄중합반응 (PCR)법을 이용하여 세균의 분자유전학적 동정 및 분류에 사용하는 세균의 16S rDNA 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자의 산물은 TA 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝한 후, 16S rDNA가 들어있는 세균 집락 (Colony)중 20개를 무작위로 고른 후 클로닝된 16S rDNA 분리하였다.
T-P, T-N, NH4-N, NO3-N는 Methods of soil analysis (Sparks, 1996)에 준하여 T-P는 유도결합 플라즈마 발광광도기 (ICPS-1000IV, Shimadzu)를 이용하였고, T-N 및 NH4-N, NO3-N는 단백질/질소 자동분석기 (Kjeltec auto 1035/1038 System, Tecator AB)를 이용하여 분석하였다. 수질시료는 수질오염공정 시험법에 준하여 pH는 pH meter (US/550A, Orion), EC는 EC meter (US/Orion 720, Orion), T-P는 유도결합 플라즈마 발광광도기 (ICPS-7500, Shimadzu), T-N와 NH4-N는 단백질/질소 자동분석기 (Kjeltec auto 1035/1038 System, Tecator AB), NO3-N는 이온크로마토그래프 (US/ICS-2500, Dionex)를 이용하여 분석하였다.
증폭 산물은 QIAEX II gel extraction kit (Qiagen)로 정제하여 자동 염기서열 결정에 사용하였다. 염기서열은 정확성을 기하기 위하여 Applied Biosystems automated sequencer (3100 Genetic Analyzer, ABI PRISM)와 BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems)을 사용하여 정방향과 역방향으로 확인하였다. Sequencing reaction은 이미 보고된 방법 (Suzuki and Giovannoni, 1996)에 따라 정제한 PCR 증폭 산물 30 ng, 각 프라이머 2.
수거한 토양 및 침출수에 있는 세균의 DNA를 추출한 후 연쇄중합반응 (PCR)법을 이용하여 세균의 분자유전학적 동정 및 분류에 사용하는 세균의 16S rDNA 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자의 산물은 TA 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝한 후, 16S rDNA가 들어있는 세균 집락 (Colony)중 20개를 무작위로 고른 후 클로닝된 16S rDNA 분리하였다. 분리한 16S rDNA에 대해서 자동염기서열분석을 이용하여 클로닝한 16S rDNA유전자의 염기서열을 결정하였다.
토양 및 지하수 중 세균 DNA 추출은 Power soil DNA Isolation kit (Cat. 12888-100, MO BIO Lab)를 사용하여 추출하였다.
대상 데이터
본 연구는 2004년과 2008년에 각각 조성된 두 곳의 매몰지를 대상으로 실시하였으며, 각 매몰지의 세부 현황은 Table 1에 나타내었다. 두 곳 모두 조류인플루엔자에 감염된 닭의 사체를 ʻ조류인플루엔자 긴급행동지침ʼ에 따라 매몰한 지역으로 매몰 후 경과 시간에 따른 오염 기여 정도의 차이를 알아보고자 조성 시기가 다른 두 곳을 대상으로 하였다.
본 연구는 2004년과 2008년에 각각 조성된 두 곳의 매몰지를 대상으로 실시하였으며, 각 매몰지의 세부 현황은 Table 1에 나타내었다. 두 곳 모두 조류인플루엔자에 감염된 닭의 사체를 ʻ조류인플루엔자 긴급행동지침ʼ에 따라 매몰한 지역으로 매몰 후 경과 시간에 따른 오염 기여 정도의 차이를 알아보고자 조성 시기가 다른 두 곳을 대상으로 하였다.
평택지역에서는 2008년의 계속된 가뭄으로 관측정에 지하수가 수집되지 않아 시료를 채취하지 못하였고 천안매몰지에서만 2곳의 관정에서 지하수 시료를 채취할 수 있었다. 시료는 살균된 수질 시료 채취용 병에 채취하여 아이스박스를 이용하여 실험실로 운반한 후 여과지(Whatman No. 6)로 여과하여 분석용 시료로 이용하였다.
시험 시료의 채취는 2008년 10월에 실시하였다. 천안매몰지의 토양 시료는 매몰지의 중심에서 경사면 아래 방향으로 15 m와 30 m, 두 지점에서 채취하였고, 평택매몰지에서는 매몰지 중심에서 15 m, 30 m, 45 m 떨어진 지점에서 토양시료를 채취하였다.
지하수 시료는 매몰지 조성 당시 설치된 조사용 관정에서 베일러 시료 채취기를 이용하여 채취하였다. 평택지역에서는 2008년의 계속된 가뭄으로 관측정에 지하수가 수집되지 않아 시료를 채취하지 못하였고 천안매몰지에서만 2곳의 관정에서 지하수 시료를 채취할 수 있었다.
천안매몰지의 토양 시료는 매몰지의 중심에서 경사면 아래 방향으로 15 m와 30 m, 두 지점에서 채취하였고, 평택매몰지에서는 매몰지 중심에서 15 m, 30 m, 45 m 떨어진 지점에서 토양시료를 채취하였다.
토양 및 침출수에서 분리한 세균의 DNA에서 세균의 16S rDNA 염기서열 증폭은 기존에 알려져 있는 대부분의 세균의 16S rDNA 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 (primer)인 27f (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'), 1492r (5'GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3')를 이용하였다 (Lane, 1991).
천안매몰지의 토양 시료는 매몰지의 중심에서 경사면 아래 방향으로 15 m와 30 m, 두 지점에서 채취하였고, 평택매몰지에서는 매몰지 중심에서 15 m, 30 m, 45 m 떨어진 지점에서 토양시료를 채취하였다. 토양 시료의 채취를 위해서 Geoprobe system (Geoprobe 4220, Geoprobe)을 이용하였으며 천안매립지에서는 토심 2 - 2.5 m 깊이에서, 평택매몰지에서는 4 - 4.5 m 깊이에서 각각 채취하였다. 또한 각 매몰지에서 200 m 떨어진 지점의 토양을 대조구 시료로 이용하기 위해서 매몰지 시료와 동일한 깊이의 토양을 채취하였다.
데이터처리
자동염기 서열로 확보하는 염기서열은 BLAST program을 이용하여 분석하였다 (Fig. 1).
이론/모형
Sequencing reaction은 이미 보고된 방법 (Suzuki and Giovannoni, 1996)에 따라 정제한 PCR 증폭 산물 30 ng, 각 프라이머 2.5 pmol 그리고 BigDye Terminator RR mix (part no. 4303153, PerkinElmer Applied Biosystems) 4 μL를 넣고 증류수로 최종 부피가 10 μL가 되게 하였다.
토양 시료의 분석은 농업과학기술원 토양 및 식물체분석법(NIAST, 2000)에 준하여, 토양 pH는 토양과 증류수를 1:5로 추출 후 pH meter (US/550A, Orion)로 측정하였으며, EC는 포화추출액을 EC meter (US/Orion 720, Orion)를 이용하여 측정했다. T-P, T-N, NH4-N, NO3-N는 Methods of soil analysis (Sparks, 1996)에 준하여 T-P는 유도결합 플라즈마 발광광도기 (ICPS-1000IV, Shimadzu)를 이용하였고, T-N 및 NH4-N, NO3-N는 단백질/질소 자동분석기 (Kjeltec auto 1035/1038 System, Tecator AB)를 이용하여 분석하였다. 수질시료는 수질오염공정 시험법에 준하여 pH는 pH meter (US/550A, Orion), EC는 EC meter (US/Orion 720, Orion), T-P는 유도결합 플라즈마 발광광도기 (ICPS-7500, Shimadzu), T-N와 NH4-N는 단백질/질소 자동분석기 (Kjeltec auto 1035/1038 System, Tecator AB), NO3-N는 이온크로마토그래프 (US/ICS-2500, Dionex)를 이용하여 분석하였다.
자동 염기서열분석은 이미 보고된 방법 (Suzuki and Giovannoni, 1996)에 따라 정제된 16S rDNA PCR 증폭 산물 30 ng, 프라이머 2.5 pmol 그리고 BigDye Terminator RR mix (part no. 4303153, Perkin-Elmer Applied Biosystems) 4 μL를 넣고 증류수로 최종 부피가 10 μL가 되게 하였다.
토양 시료의 분석은 농업과학기술원 토양 및 식물체분석법(NIAST, 2000)에 준하여, 토양 pH는 토양과 증류수를 1:5로 추출 후 pH meter (US/550A, Orion)로 측정하였으며, EC는 포화추출액을 EC meter (US/Orion 720, Orion)를 이용하여 측정했다. T-P, T-N, NH4-N, NO3-N는 Methods of soil analysis (Sparks, 1996)에 준하여 T-P는 유도결합 플라즈마 발광광도기 (ICPS-1000IV, Shimadzu)를 이용하였고, T-N 및 NH4-N, NO3-N는 단백질/질소 자동분석기 (Kjeltec auto 1035/1038 System, Tecator AB)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
7배 높게 조사되었다. 매몰 후 4년이 경과한 천안매몰지의 경우 30 m 지점의 각 화학성 분석 항목은 대조구와 차이가 없었으나 15 m 지점에서 NH4-N 함량이 대조구 (1.1 mg L-1)에 비해서 월등히 높은 것으로 (87.6 mg L-1) 조사되었고 EC 또한 대조구에 비해서 높았다.
매몰지 내부 지하수에서 분류한 세균들의 16S rDNA 유전자 분석결과, 이들 분리된 균들이 대부분 토양에서 주로 발견되는 균들이며, 예상과는 달리 살모넬라균 및 캄필로박터균은 발견되지 않았다. 한 가지 특이점은 평택 매몰지 내부 토양에서 높은 빈도 (89%)로 바실러스균속 (Bacillus)이 확인되었다는 사실이다.
그러나 규정된 방법 간에 서로 상이한 부분이 있으며, 또한 과학적 근거를 바탕으로 한 검증이 이루어지지 않았다. 조사 대상지가 두 곳에 국한되어 있기는 하나, 본 조사 결과는 지금까지 조성된 매몰지가 주변 환경에 오염부하를 증가시킬 수 있다는 것을 보여주고 있다. 따라서 지금까지 조성된 각 매립지에 대한 환경오염도 평가가 필요하며, 이를 바탕으로 사후 관리 방안을 모색하고 매몰관련 규정의 보완이 이루어져야 한다.
평택매몰지에서는 예상과 달리 매몰지 중심부와 가장 멀리 떨어진 지점에서 대조구에 비해서 높은 EC와 NO3-N가 분석되었다. 이 결과는 오염원과 오염물질의 거리 분포간 관계를 감안할 때, 매몰지의 직접적 영향으로 판단할 수는 없다.
후속연구
이와 같은 결과는 바실러스균속의 존재 유무를 동물사체에 의한 토양 오염 척도 및 지표로 사용할 수 있음을 시사한다. 그러나 본 연구의 시험조사는 두 곳의 매몰지에 국한되어 실시되었기 때문에 본 가설을 뒷받침할 수 있는 추가연구가 필요하다.
따라서 매몰지의 토양 및 지하수를 온도가 높은 여름철에 채취하여 이들 균들이 매몰지에서 나오는지를 반드시 확인하고, 또한 실험실에서 인위적으로 온도를 다르게 했을 때 살모넬라균 및 캄필로박터균의 증식여부 확인도 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
우리나라 농림수산식품부령에는 1종 가축전염병이 몇 종이 고시되어있는가?
OIE에 등록되어 있는 가축전염병의 종류는 2008년 현재 다종동물인 소, 면양, 산양, 말, 돼지, 가금, 꿀벌 및 기타 가축 등을 대상으로 한 118종이다 (World Organisation for Animal Health, 2010). 우리나라에서도 농림수산식품부령에 64종의 가축전염병이 고시되어 있는데, 여기에는 즉각 살처분을 명할 수 있는 1종 가축전염병 15종, 2종 가축전염병 31종, 3종 가축전염병 18종이 포함된다 (농림수산식품부, 2010a).
매년 세계 각국에서 신고한 가축전염병을 토대로 방역 및 질병 전염 관리를 하고 있는 기관은 어디인가?
근래에 전 세계적으로 조류인플루엔자 (AI) 및 구제역 (FMD)과 같은 가축전염병의 만연으로 각 국가는 경제적 손실 및 국민의 건강과 직결된 사회적 부담을 안고 있다. 이에 국제수역사무국 (World Organisation for Animal Health, OIE)에서는 매년 세계 각국에서 신고한 가축전염병을 토대로 방역 및 질병 전염 관리를 하고 있다. OIE에 등록되어 있는 가축전염병의 종류는 2008년 현재 다종동물인 소, 면양, 산양, 말, 돼지, 가금, 꿀벌 및 기타 가축 등을 대상으로 한 118종이다 (World Organisation for Animal Health, 2010).
국제수역사무국에 기록되어있는 가축전염병의 종류는 2008년 기준, 몇 가지인가?
이에 국제수역사무국 (World Organisation for Animal Health, OIE)에서는 매년 세계 각국에서 신고한 가축전염병을 토대로 방역 및 질병 전염 관리를 하고 있다. OIE에 등록되어 있는 가축전염병의 종류는 2008년 현재 다종동물인 소, 면양, 산양, 말, 돼지, 가금, 꿀벌 및 기타 가축 등을 대상으로 한 118종이다 (World Organisation for Animal Health, 2010). 우리나라에서도 농림수산식품부령에 64종의 가축전염병이 고시되어 있는데, 여기에는 즉각 살처분을 명할 수 있는 1종 가축전염병 15종, 2종 가축전염병 31종, 3종 가축전염병 18종이 포함된다 (농림수산식품부, 2010a).
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