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문제 정의
- 저자들은 黃精과 그 성분인 kaempferol이 지질대사에 관여하는 지와 그 분자적 기전을 규명하기 위하여 지방세포의 분화에 억제 효과를 나타내는 지를 검토하고 분화에 관련된 유전자의 발현을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고한다.
제안 방법
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2. 3T3-L1 세포 분화에서 triglyceride (TG)의 축적 양 측정
3T3-L1 세포를 분화 유도한 후 축적된 TG의 양을 측정하였다. 黃精추출물을 500 ㎍/ml농도로 처리한 실험에서는 축적되는 TG의 양이 24.
- 3T3-L1 세포는 heat inactivation한 10% (v/v)bovine serum, antibiotics/antimyotics (Invitrogen)를 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 혼합하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 3T3-L1 세포의 분화 유도는 6 well plate에서 100%로 자란 세포를 2일간 더 배양하였고, 100 mM IBMX, 5㎍/ml insulin, 0.5 mM dexamethasone, heat inactivation된 10% FBS가 첨가된 배지에서 2일간 배양한 후, 5㎍/ml insulin 10% FBS가 첨가된 배지를 2일마다 교체하며 배양하여 10～12일 후 실험에 사용하였다. 黃精추출물, kaempferol, DMSO는 분화 유도와 함께 처리하여 2일마다 배지 교체 시에 지속적으로 처리 하였다.
- 3T3-L1의 분화 유도 후 성숙된 지방세포에서 발견되는 유전자의 발현을 확인하였다. Adipsin, adipocyteprotein 2 (aP2), lipoprotein lipase (LPL) 유전자들의 발현은 黃精추출물과 kaempferol을 처리한 실험 모두에서 감소하였으며 黃精추출물보다 kaempferol을 처리한 실험에서 더 감소되었다(Fig.
- 黃精과 그 성분인 kaempferol이 지질대사에 관여하는 지와 그 분자적 기전을 규명하기 위하여 지방세포의 분화에 억제 효과를 나타내는 지를 검토하고 분화에 관련된 유전자의 발현을 관찰하였다. 黃精과 kaempferol은 3T3-L1 지방전구세포의 분화 과정 중에서 세포 내에 지방 축적을 억제하였고, 지방세포 분화를 알려주는 지표인 adipsin, LPL, aP2 유전자의 발현을 억제하였다.
- 5 mM dexamethasone, heat inactivation된 10% FBS가 첨가된 배지에서 2일간 배양한 후, 5㎍/ml insulin 10% FBS가 첨가된 배지를 2일마다 교체하며 배양하여 10～12일 후 실험에 사용하였다. 黃精추출물, kaempferol, DMSO는 분화 유도와 함께 처리하여 2일마다 배지 교체 시에 지속적으로 처리 하였다.
- 黃精추출물이 3T3-L1 세포에 독성을 나타내는 농도를 확인하고자 0.1, 0.2, 0.5, 1, 10, 50, 100, 200, 500, 1000 ㎍/ml 농도에서 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 黃精추출물은 1000 ㎍/ml 농도에서도 세포에 독성을 나타내지 않았다.
- Oil Red O working solution을 가하여 10분간 반응시킨 후 DW를 이용하여 5회 세척하였다. 염색된 세포는 현미경 사진을 찍었고, 100% isopropanol을 가하여 세포 내에 축적된 lipid를 용출하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 3’, GAPDH, 5’-CTGCACCACCAACTGCTTAGC-3’ and 5’-GGGCCATCCACAGTCTTCTGG-3’. 증폭된 PCR product는 1.5% agarosegel 전기영동을 진행하였고, chemiluminescent detection system (ChemiDoc XRS system, Bio-Rad Laboratories,USA)을 이용하여 사진을 얻고 분석하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. FBS (Fetal bovine serum), BS(Bovine serum)는 GIBCO (Grand Island, NY) 제품을 사용하였다.
- Kaempferol, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Oil-red-O Dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), insulin, imethysulfoxide(DMSO)는 Sigma (ST. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. FBS (Fetal bovine serum), BS(Bovine serum)는 GIBCO (Grand Island, NY) 제품을 사용하였다.
- RNA는 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 분리하였고, 1 mg의 RNA를 MMLV reverse transcriptase와 random oligo (dT) primers(Invitrogen)를 이용하여 역전사 반응을 진행하여 cDNA를 준비하였다. PCR은 cDNA를 주형으로 하여 다음의 primers를 이용하여 진행하였다.
- 黃精을 시중 (태원당약업사, 대구, 대한민국)에서 구입하고 정선하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계 처리는 각 실험 결과의 평균값과 평균 오차를 이용하여 표시하였고, student t-test를 통하여 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 14%로 黃精추출물에 비해 더 감소되었다.(Fig. 2) 현미경을 이용하여 관찰한 결과 DMSO 대조군에 비해 kaempferol을 처리한 경우 분화가 일어난 3T3-L1 세포의 수가 감소되어 있음을 확인할수 있었다.(Fig.
- 3T3-L1 세포에 黃精추출물과 kaempferol을 처리하여 분화 억제 효과가 나타났을 때 SREBP-1c의 발현이 감소됨을 확인하였고, 그 표적 유전자인 LPL의 발현 억제도 확인하였다. 이와 같은 결과들은 黃精이 지질대사에 관여하여 작용할 것이며, 약리 효능이 PPARγ, SREBP family 등의 발현 조절 및 활성 조절에 의한 기전을 통하여 나타날 것임을 시사한다.
- 3T3-L1의 분화 유도 후 성숙된 지방세포에서 발견되는 유전자의 발현을 확인하였다. Adipsin, adipocyteprotein 2 (aP2), lipoprotein lipase (LPL) 유전자들의 발현은 黃精추출물과 kaempferol을 처리한 실험 모두에서 감소하였으며 黃精추출물보다 kaempferol을 처리한 실험에서 더 감소되었다(Fig. 4). PPARγ와 SREBP-1c의 mRNA 발현도 DMSO를 처리한 대조군에 비하여 감소되었다(Fig.
- Kaempferol을 50 μM 처리했을 경우 축적되는 TG의 양은 76.14%로 黃精추출물에 비해 더 감소되었다.
- 黃精과 그 성분인 kaempferol이 지질대사에 관여하는 지와 그 분자적 기전을 규명하기 위하여 지방세포의 분화에 억제 효과를 나타내는 지를 검토하고 분화에 관련된 유전자의 발현을 관찰하였다. 黃精과 kaempferol은 3T3-L1 지방전구세포의 분화 과정 중에서 세포 내에 지방 축적을 억제하였고, 지방세포 분화를 알려주는 지표인 adipsin, LPL, aP2 유전자의 발현을 억제하였다. 또한 黃精은 분화 과정 내에서 핵심 전사인자인 SREBP-1c와 PPARγ의 발현을 감소시켰다.
- 2A). 黃精의 활성물질 중 하나인 kaempferol은 黃精추출물보다 더욱 지방 축적을 억제하여 76.14%의 감소를 보였다(Fig. 2B).
- 黃精추출물 또한 이러한 PPARγ의 발현을 감소시켰으며, kaempferol에 의한 PPARγ의 발현 감소도 확인하였다(Fig. 5).
- 3T3-L1 세포를 분화 유도한 후 축적된 TG의 양을 측정하였다. 黃精추출물을 500 ㎍/ml농도로 처리한 실험에서는 축적되는 TG의 양이 24.57% 감소되었다. Kaempferol을 50 μM 처리했을 경우 축적되는 TG의 양은 76.
- 본 실험 결과 黃精의 이러한 효능은 실제 지방세포분화에서 지방 축적을 24.57% 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 2A). 黃精의 활성물질 중 하나인 kaempferol은 黃精추출물보다 더욱 지방 축적을 억제하여 76.
- 임상에서 脾胃虛弱으로 小食하거나 肺虛乾咳病後虛羸體倦乏力消渴등의 치료에 활용되고 있다10). 실험 연구에 의하면 黃精추출물을 당뇨병에 유발된 쥐에게 장기 복용시켰을 때 혈당 및 체중이 감소되었고, 고지방 식이를 섭취시켜 고지혈증이 유도된 쥐에게 장기 복용시켰을 때 체중 및 간 중량 감소 현상이 나타났고 혈중 콜레스테롤, 중성지방, 지방산의 수치가 감소되어 고지혈증이 완화되었다11,13,14,18,19).
- PPARγ는 지방세포 분화에 필요한 유전자들의 발현을 조절하는 핵심 전사인자로서 작용하며, 그 표적 유전자로는 aP2와 adipsin 등이 있고 PPARγ에 의해 그 발현이 증가된다1,32-34). 이 표적 유전자들은 黃精추출물과 kaempferol을 처리한 경우에 그 발현이 감소됨을 확인하였다(Fig. 4).
- 이와 같은 결과들은 黃精이 지질대사에 관여하여 작용할 것이며, 약리 효능이 PPARγ, SREBP family 등의 발현 조절 및 활성 조절에 의한 기전을 통하여 나타날 것임을 시사한다.
후속연구
- 이와 같은 결과들은 黃精이 지질대사에 관여하여 작용할 것이며, 약리 효능이 PPARγ, SREBP family 등의 발현 조절 및 활성 조절에 의한 기전을 통하여 나타날 것임을 시사한다. 또한 지방세포 분화 시 黃精에 의해 발현이 변화되는 유전자들의 패턴 변화를 micro array 등의 방법을 이용하여 분석한다면 黃精의 작용 기전을 이해하는데 도움이 될 것이다.
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또한 黃精은 분화 과정 내에서 핵심 전사인자인 SREBP-1c와 PPARγ의 발현을 감소시켰다. 이상의 결과로 黃精과 kaempferol은
PPARγ, SREBP family 등의 발현 및 활성 조절에 의한 기전을 통하여 지질대사에 관여할 것임을 시사한다.
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