고지방 식이 유도 비만 마우스 모델에서 황정 추출물의 지방질 및 에너지 대사 관련 유전자에 대한 효능 연구 Effects of Polygonatum sibiricum rhizome extract on lipid and energy metabolism in high-fat diet-induced obese mice원문보기
황정 주정 추출물 ID1216의 고지방 식이 유도 비만 마우스에서의 체중 증가 억제 효과에 대한 분자생물학적 기전을 확인하고자 단백질과 mRNA 수준에서 지질 및 에너지 대사 관련 유전자들의 발현 변화를 관찰하였다. 본 연구에서 확인된 지표들 간의 상호 작용 및 ID1216의 조절 여부에 관해 Fig. 10에 나타내었다. 실험 결과 ID1216은 고지방 식이 유도 비만 마우스에서 체중 증가 억제를 나타내었으며, 비만 대사 관련 pathway의 상위 유전자로 사료되는 SIRT1과 AMPK의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 활성화된 SIRT1과 AMPK는 $PGC1{\alpha}$의 활성화에 관여하고, 이를 통해 열 발산 대사와 관련된 UCP 단백질과 핵 수용체 단백질인 $PPAR{\alpha}$의 발현이 백색지방, 갈색지방, 간 및 근육에서 증가되는 것이 확인되었다. 각 조직 별로 RT-PCR을 진행한 결과에서는 $PPAR{\alpha}$의 하위 유전자인 aP2, ACO, Acadl, Acadm, CPT1a, CPT1b의 mRNA 발현 수준을 향상시켜 주어 ID1216이 지방산 산화 대사인 ${\beta}$-oxidation의 활성화에 기여할 가능성을 보여주었다. 이와는 별개로 ID1216은 중성지질을 분해하는 것으로 알려진 ATGL의 mRNA 발현 또한 증가시키는 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 ID1216이 조직에 따라 지질 및 에너지 대사와 관련된 인자의 발현에 영향을 주는 체중 조절에 효과적인 소재임을 알 수 있었다. 또한 비만 치료제와의 기전적 차별성과 생약 특유의 섭취 안전성을 특징으로 하는 체중 또는 체지방 조절 기능성 소재로의 활용 가능성도 충분히 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
황정 주정 추출물 ID1216의 고지방 식이 유도 비만 마우스에서의 체중 증가 억제 효과에 대한 분자생물학적 기전을 확인하고자 단백질과 mRNA 수준에서 지질 및 에너지 대사 관련 유전자들의 발현 변화를 관찰하였다. 본 연구에서 확인된 지표들 간의 상호 작용 및 ID1216의 조절 여부에 관해 Fig. 10에 나타내었다. 실험 결과 ID1216은 고지방 식이 유도 비만 마우스에서 체중 증가 억제를 나타내었으며, 비만 대사 관련 pathway의 상위 유전자로 사료되는 SIRT1과 AMPK의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 활성화된 SIRT1과 AMPK는 $PGC1{\alpha}$의 활성화에 관여하고, 이를 통해 열 발산 대사와 관련된 UCP 단백질과 핵 수용체 단백질인 $PPAR{\alpha}$의 발현이 백색지방, 갈색지방, 간 및 근육에서 증가되는 것이 확인되었다. 각 조직 별로 RT-PCR을 진행한 결과에서는 $PPAR{\alpha}$의 하위 유전자인 aP2, ACO, Acadl, Acadm, CPT1a, CPT1b의 mRNA 발현 수준을 향상시켜 주어 ID1216이 지방산 산화 대사인 ${\beta}$-oxidation의 활성화에 기여할 가능성을 보여주었다. 이와는 별개로 ID1216은 중성지질을 분해하는 것으로 알려진 ATGL의 mRNA 발현 또한 증가시키는 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 ID1216이 조직에 따라 지질 및 에너지 대사와 관련된 인자의 발현에 영향을 주는 체중 조절에 효과적인 소재임을 알 수 있었다. 또한 비만 치료제와의 기전적 차별성과 생약 특유의 섭취 안전성을 특징으로 하는 체중 또는 체지방 조절 기능성 소재로의 활용 가능성도 충분히 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
In this study, factors involved in lipid and energy metabolism following treatment with ethanolic extract of the Polygonatum sibiricum rhizome (ID1216) were evaluated in high-fat diet-induced obese mice. ID1216-treated mice showed a significant reduction in weight gain compared to non-treated mice. ...
In this study, factors involved in lipid and energy metabolism following treatment with ethanolic extract of the Polygonatum sibiricum rhizome (ID1216) were evaluated in high-fat diet-induced obese mice. ID1216-treated mice showed a significant reduction in weight gain compared to non-treated mice. ID1216 treatment increased the protein levels of AMP-dependent protein kinase, sirtuin1, peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ coactivator 1-${\alpha}$ ($PGC1{\alpha}$), peroxisome proliferator-activated receptor ${\alpha}$ ($PPAR{\alpha}$) and uncoupling proteins in the adipose tissue, liver and muscle compared to vehicle treatment. Analysis of downstream signals of the sirtuin1 $PGC1{\alpha}$-$PPAR{\alpha}$ pathway showed that ID1216 regulates the expression of ${\beta}$-oxidation related genes such as acyl-CoA oxidase, carnitine palmitoyltransferase1, acyl-CoA dehydrogenase and adipocyte protein 2. In addition, ID1216 increased the expression of adipose triglyceride lipase. These results suggest that ID1216 has anti-obesity effects by regulating the genes involved thermogenesis, ${\beta}$-oxidation and lipolysis in a diet-induced obesity model.
In this study, factors involved in lipid and energy metabolism following treatment with ethanolic extract of the Polygonatum sibiricum rhizome (ID1216) were evaluated in high-fat diet-induced obese mice. ID1216-treated mice showed a significant reduction in weight gain compared to non-treated mice. ID1216 treatment increased the protein levels of AMP-dependent protein kinase, sirtuin1, peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ coactivator 1-${\alpha}$ ($PGC1{\alpha}$), peroxisome proliferator-activated receptor ${\alpha}$ ($PPAR{\alpha}$) and uncoupling proteins in the adipose tissue, liver and muscle compared to vehicle treatment. Analysis of downstream signals of the sirtuin1 $PGC1{\alpha}$-$PPAR{\alpha}$ pathway showed that ID1216 regulates the expression of ${\beta}$-oxidation related genes such as acyl-CoA oxidase, carnitine palmitoyltransferase1, acyl-CoA dehydrogenase and adipocyte protein 2. In addition, ID1216 increased the expression of adipose triglyceride lipase. These results suggest that ID1216 has anti-obesity effects by regulating the genes involved thermogenesis, ${\beta}$-oxidation and lipolysis in a diet-induced obesity model.
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문제 정의
그러나 열 발산과 지방산 대사에 관련한 연구 결과는 고지방 식이로 비만 대사의 불균형이 초래된 비만 예방 모델이 아닌 정상 마우스에서 확인한 결과였기 때문에 앞서 나타난 열발산과 지방산 산화 대사 활성화에 따른 효과라고 단정하기에는 무리가 있었다. 따라서 본 연구는 고지방식이에 의해 비만이 유도된 마우스에 황정 주정 추출물을 급여한 뒤 체중 증가 억제 효과를 확인하며 지질대사와 관련된 조직에서의 비만 관련 대사 바이오마커의 분자적 작용 메카니즘을 규명하고자 수행되었다.
선행 연구에서는 UCP에 대한 영향을 mRNA 수준에서만 확인하였으며 실제 비만 환자와 대사적 특성이 유사한 HFD 유도 비만 마우스 모델에서는 확인하지 못한 한계점이 존재하였다. 따라서 본 연구에서는 처음으로 HFD 마우스 조직을 활용하여 UCP isoform의 단백질 발현 변화를 확인함으로써 ID1216의 기전을 검증하였다. UCP 단백질 분석은 열발산 대사 및 UCP 유전자에 의한 산화 과정이 보고된 조직에 대해서만 분석을 실시하였으며 각 조직 별로 발현도가 높은 것으로 알려진 isoform을 선정하여 단백질 발현 변화를 관찰하였다(41).
본 연구에서는 ID1216이 지질 분해 대사에 미치는 영향을 확인하기 위해서 지질 분해 효소로 알려진 adipose triglyceride lipase(ATGL) 유전자에 대한 발현 분석을 실시하였다. 지질은 체내에서 중성지방의 형태로 여러 조직 내에 저장되며 외부 자극이나 내부 항상성 작용에 의해 분해 되거나 재합성되는 과정을 거친다.
유사한 연구 사례로서, HFD를 설치류에게 급여 시, 갈색지방 조직 내 열 발산 관여 인자의 mRNA 발현이 증가했다는 보고가 있으며(21,22) 이는 체내 항상성의 작용으로 인해 발생한 것으로 보인다. 본 연구의 목적은 ID1216이 HFD 급여 동물에게 미치는 영향을 확인하는 것으로서, 데이터 해석 혼동 여지를 예방하고 HFD 급여 동물간의 차이를 일관적으로 보여주고자 정상군의 결과를 배제하였다.
제안 방법
이후 5% skim milk solution으로 1시간 동안 blocking한 후 1차 항체 anti-SIRT1 antibody (Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-PGC1α antibody (Abcam, Cambridge, UK), anti-PPARα antibody (Cell signaling Technology), anti-pAMPK antibody (Cell signaling Technology), antiAMPK antibody (Cell signaling Technology), anti-UCP1 antibody(Cell signaling Technology), anti-UCP2 antibody(Cell signaling Technology), anti-UCP3 antibody (Abcam)을 4oC에서 24시간 동안 반응시켰다. 2차 항체(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)는 2시간 동안 반응시켰고 이후 WEST-ZOL plus (Intron Biotechnology, Sung-nam, Korea)으로 발색시킨 후 단백질의 발현은 Chemi-doc XRS+ (Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 GAPDH 발현량으로 보정하여 정량 분석하였다.
6주간 고지방식이(high fat diet: HFD)와 ID1216을 동시에 투여하면서 C57BL/6J 마우스의 체중 증가에 대한 영향을 관찰하였다. 정상식이군(normal diet: ND)대비 HFD를 급여한 군에서 발생한 현저한 체중 증가는 양성대조물질로 사용된 orlistat 투여에 의해 약 26% 억제되었다(Fig.
ID1216 was treated with high-fat diet for 6 weeks. On the last day of experiment, total RNA was extracted and RNA expression was analyzed by RT-PCR. (A) and B shows a representative PCR results of White adipose tissue(WAT) and liver.
PCR 반응 조건은 초기 변성 95oC 5분, 변성 95oC 20초, 붙임 56-64oC 20초, 신장 72oC 20초 조건으로 하여 30 cycle 실시한 후 최종 신장 72oC 5분 반응시켰다. PCR 반응이 완료된 후 PCR 최종 산물은 2% 아가로스젤(agarose gel)에 전기영동하여 확인하였고 정량 분석을 위해 Chemi-doc XPS+ (Bio-Rad)을 이용하였다. RT-PCR에서 확인된 각각의 유전자에 대한 프라이머 서열(primer sequences)은 Table 1과 같다.
SIRT1 이외에도 PGC1α를 조절하여 PGC1α 하위 유전자들의 전사 조절에 영향을 미칠 수 있는 상위 기전인 AMP-dependent protein kinase (AMPK) 유전자에 대해서도 추가 규명이 필요할 것으로 사료되어 AMPK 유전자에 대한 ID1216의 영향을 확인하였다.
따라서 본 연구에서는 처음으로 HFD 마우스 조직을 활용하여 UCP isoform의 단백질 발현 변화를 확인함으로써 ID1216의 기전을 검증하였다. UCP 단백질 분석은 열발산 대사 및 UCP 유전자에 의한 산화 과정이 보고된 조직에 대해서만 분석을 실시하였으며 각 조직 별로 발현도가 높은 것으로 알려진 isoform을 선정하여 단백질 발현 변화를 관찰하였다(41). 실험결과 6주간의 ID1216 투여는 백색지방조직에서는 UCP2를, 갈색지방조직에서는 UCP1을, 근육조직에서는 UCP3의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(Fig.
각 조직에서 지질 및 에너지 대사 관련 mRNA의 발현을 확인하기 위해 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription PCR)을 이용하여 측정 및 결과 분석 하였다. 조직으로부터 mRNA는 RNAisoplus (Takara, Otsu, Japan)로 추출하였고 흡광도 260 nm와 280 nm에서 정량 한 후 약 0.
상기 언급된 바와 같이, 체중 증가 억제 기전을 규명하기 위해 실시된 선행 연구결과에서, ID1216의 8주 투여가 SIRT1-PGC1α-PPARα pathway를 조절하는 것을 mRNA 분석을 통해 확인하였으며, 단회 투여 시 단백질 발현에 영향을 주는 것으로 확인되었다(15-17). 본 연구에서는 HFD와 ID1216을 6주간 투여한 후 상기 pathway가 단백질 수준에서 동일하게 조절되는지 검증하였다. 연구 결과 백색지방, 갈색지방, 간 및 근육 조직 내 SIRT1(Fig.
7) 이를 통해 간 조직에서 나타나는 PGC1α와 PPARα의 발현 촉진 효과가 SIRT1 이외에도 AMPK를 통해 조절될 가능성이 있음을 확인하였다. 본 연구에서는 ID1216에 의한 AMPK의 활성 증진 효과를 간 조직에서만 확인하였다. 향후 지방조직과 근육조직에서도 ID1216이 AMPK의 활성을 조절하여 지질 및 에너지 대사 등에 영향을 미치는지 여부에 대해 추가 연구를 통해 검증할 필요가 있다.
1 mM EDTA, 1% Triton X100)로 균질화기(homogenizer)를 이용하여 파쇄한 후 22,000×g에서 10분간 원심 분리하였다. 수득된 단백질은 BCA 법을 사용하여 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)로 표준곡선을 그린 뒤 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader; Bio-tek, Winooski, VT, USA)로 흡광도를 측정하여 정량 분석 하였다. 이후 8% SDS PAGE gel에서 100 V로 전기영동(Bio-rad, Hercules, CA, USA)하였다.
Louis, MO, USA)을 고지방식이군은 45% fat이 함유된 고지방식이 사료(Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)와 함께 ID1216 30, 100, 300 mg/kg을 멸균수에 현탁하여 매일 동일한 시간대에 경구 투여하였다. 양성대조물질로 사용된 오르리스타트(orlistat)은 24 mg/kg로 0.3% tween 80용액에 현탁하여 ID1216과 동일한 시간대에 투여하였다. 투여물질의 급여는 6주간 수행되었으며 3-4일 간격으로 체중 및 사료섭취량을 측정하였다.
이후 5% skim milk solution으로 1시간 동안 blocking한 후 1차 항체 anti-SIRT1 antibody (Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-PGC1α antibody (Abcam, Cambridge, UK), anti-PPARα antibody (Cell signaling Technology), anti-pAMPK antibody (Cell signaling Technology), antiAMPK antibody (Cell signaling Technology), anti-UCP1 antibody(Cell signaling Technology), anti-UCP2 antibody(Cell signaling Technology), anti-UCP3 antibody (Abcam)을 4oC에서 24시간 동안 반응시켰다.
2-2 μg의 total RNA를 M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)와 Oligo dT primer (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 이후 PCR 반응은 Dream Taq polymerase (Thermo Scientific)을 사용하여 PCR하였다. PCR 반응 조건은 초기 변성 95oC 5분, 변성 95oC 20초, 붙임 56-64oC 20초, 신장 72oC 20초 조건으로 하여 30 cycle 실시한 후 최종 신장 72oC 5분 반응시켰다.
, Shizuoka, Japan)을 구입한 후 1주일간 순화시켰다. 이후 정상식이군은 Picolab Rodent diet 20 (PicoLab, St. Louis, MO, USA)을 고지방식이군은 45% fat이 함유된 고지방식이 사료(Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)와 함께 ID1216 30, 100, 300 mg/kg을 멸균수에 현탁하여 매일 동일한 시간대에 경구 투여하였다. 양성대조물질로 사용된 오르리스타트(orlistat)은 24 mg/kg로 0.
조직으로부터 mRNA는 RNAisoplus (Takara, Otsu, Japan)로 추출하였고 흡광도 260 nm와 280 nm에서 정량 한 후 약 0.2-2 μg의 total RNA를 M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)와 Oligo dT primer (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
3% tween 80용액에 현탁하여 ID1216과 동일한 시간대에 투여하였다. 투여물질의 급여는 6주간 수행되었으며 3-4일 간격으로 체중 및 사료섭취량을 측정하였다. 6주간의 투여 및 체중 측정이 완료된 다음 날 백색지방, 갈색지방, 가자미근육 및 간 조직을 적출하여 분석 전까지 −70oC에서 보관하였다.
황정 주정 추출물 ID1216의 고지방 식이 유도 비만 마우스에서의 체중 증가 억제 효과에 대한 분자생물학적 기전을 확인하고자 단백질과 mRNA 수준에서 지질 및 에너지 대사 관련 유전자들의 발현 변화를 관찰하였다. 본 연구에서 확인된 지표들 간의 상호 작용 및 ID1216의 조절 여부에 관해 Fig.
대상 데이터
상기 결과에서 ID1216이 SIRT1, PGC1α, PPARα의 단백질 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며 따라서 하위 유전자들의 조절을 통해 에너지 대사 및 지방산 대사에 관여할 가능성이 높다고 판단하였고 관련 mRNA의 발현을 확인하였다. 구체적인 선정 기준으로서, 단백질 발현과의 상관관계가 입증되어 있거나 기존 연구에서 지방 감소 기전의 근거로서 사용된 mRNA 지표를 선정하였다(28-33).
본 동물 시험은 일동제약㈜의 동물윤리위원회의 승인(승인번호: A1603-5)을 받아 수행되었다. 동물은 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(SLC Inc., Shizuoka, Japan)을 구입한 후 1주일간 순화시켰다. 이후 정상식이군은 Picolab Rodent diet 20 (PicoLab, St.
실험에 사용한 황정 에탄올 추출물 시료인 ID1216은 선행연구에 사용된 추출물과 동일한 과정으로 제조되었다(15-17). 훈증과 건조과정을 거친 P.
실험에 사용한 황정 에탄올 추출물 시료인 ID1216은 선행연구에 사용된 추출물과 동일한 과정으로 제조되었다(15-17). 훈증과 건조과정을 거친 P. sibiricum을 (주)동의보감(Jecheon, Korea)에서 구입한 후 80% 에탄올을 이용하여 추출 및 여과하였다. 이후 농축과 건조 과정을 거쳐 최종적으로 얻은 건조물을 ID1216으로 명명하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 평균±표준오차(means±SEM)로 표시하였으며 실험군 간의 통계적 유의성 검정은 2가지 통계분석법을 이용하였다.
체중, 사료섭취량, 식이효율에 대한 통계 분석은 One-way ANOVA followed by Tukey’s test를 이용하였고 유전자 지표 분석에 대한 통계 분석은 Student’s t-test를 이용하였다.
이론/모형
각 조직에서 지질 및 에너지 대사 관련 단백질의 발현을 확인하기 위해 Western blotting법을 이용하여 분석 하였다. 조직으로부터 단백질을 추출하기 위해 protease inhibitor (10 mM NaF)와 phosphatase inhibitor (1 mM NA3VO4)를 함유하는 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.
성능/효과
2가지 통계분석법 모두 p<0.05 미만의 경우만 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
특히 ID1216 300 mg/kg 투여군은 투여 3주차 때부터 유의적인 체중 증가 억제 효과를 나타내기 시작했고 시험 종료 시, HFD군 대비 체중 증가를 약 47% 억제함으로써 orlistat보다 우수한 효능을 보였다. ID1216 100 mg/kg 투여군과 30 mg/kg 투여군은 각각 투여 4주차와 5주차 때 HFD군 대비 체중 증가 억제 효능을 보이기 시작하였으며 최종 체중 증가 억제율은 각각 41%와 33%로 나타났다. 시험 기간 동안 각군의 체중 변화는 HFD군에서 11.
ID1216은 PPARα가 전사를 조절하는 것으로 알려진 β-oxidation 대사 과정에 참여하는 효소들 중 ACO, Acdal, Acdam의 mRNA 발현을 백색지방조직에서 증가시켰으며 간 조직 내 ACO, Acdal의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(Fig. 5).
각 조직 별로 RT-PCR을 진행한 결과에서는 PPARα의 하위 유전자인 aP2, ACO, Acadl, Acadm, CPT1a, CPT1b의 mRNA 발현 수준을 향상시켜 주어 ID1216이 지방산 산화 대사인 β-oxidation의 활성화에 기여할 가능성을 보여주었다.
8). 각 조직에서의 UCP 발현은 백색지방조직과 근육조직에서는 ID1216 투여 용량에 의존적으로 증가하였으나 갈색지방조직에서는 ID1216 30 mg/kg군에서 이미 발현이 상당히 증가되며 더 높은 용량 투여 시에도 증가하지 않았다. 이는 갈색지방이 다른 조직에 비해 상대적으로 ID1216 투여에 민감하게 반응하나 UCP의 발현량 증가에는 한계가 있는 것으로 추정하였다.
ID1216이 지방산 산화 대사 기전을 활성화 시키는 효능을 갈색지방 및 근육 조직에서도 확인하였다. 갈색지방 조직과 근육조직에서는 CPT1b와 aP2의 mRNA 발현이 촉진되는 것으로 나타났다(Fig. 6C, 6D). 따라서 갈색지방 및 근육 조직에서는 지방산 이동에 이은 β-oxidation이 주요 기전인 것을 확인하였다.
따라서 갈색지방 및 근육 조직에서는 지방산 이동에 이은 β-oxidation이 주요 기전인 것을 확인하였다.
사람을 대상으로 수행된 연구에서 UCP2의 발현이 비만 및 당뇨 환자에게서 유의적으로 감소되며 UCP2의 감소는 비만 환자의 허리 둘레 수치와 중성지방 및 adipokine 수치와도 유의적인 연관성이 있는 것으로 보고 되었다(42). 따라서 백색지방 내 UCP2 감소 기전은 ID1216이 차세대 비만 치료제로서 적용 가능한 추출물임을 기대할 수 있게 한다.
본 논문에서 확인된 지표들 중 대부분은 HFD군에 비해 ID1216 처리군에서 증가된 발현량을 보였으며 서로 다른 용량 처리군 간에 통계적으로 유의한 차이가 확인되지 않았다. 따라서 이번 연구 결과는 ID1216의 농도의존적 효능에 비해 동물 개체 차이가 크게 반영되었을 가능성도 존재하는 것으로 사료된다. 또한 단백질 및 mRNA 측정 결과, ND군과 HFD군 간에 차이가 발생하지 않는 경우가 존재하였으며 역전 현상이 발생한 경우도 있었다.
또한 ID1216은 β-oxidation의 필수 효소인 CPT1a의 mRNA 발현을 백색지방과 간 조직에서 촉진시키는 것으로 확인되었다(Fig. 6E, 6G).
또한 SIRT1, PGC1α, PPARα 증가는 백색지방의 베이지색 지방으로의 변화를 유발할 가능성이 있는 것으로 보고되었으며 상기 3종에 대해서 발현 증가 효과를 확인하였기에 ID1216은 백색지방의 베이지색화를 통해 열 발산 대사에 영향을 줄 가능성이 있을 것으로 예상된다.
또한 베타산화(β-oxidation)대사와 관련된 adipocyte protein 2 (aP2)나 acyl-CoA oxidase (ACO)의 발현에도 영향을 주어 지방산 대사에 관여할 가능성 또한 확인되었다.
본 연구를 통해 ID1216이 조직에 따라 지질 및 에너지 대사와 관련된 인자의 발현에 영향을 주는 체중 조절에 효과적인 소재임을 알 수 있었다. 또한 비만 치료제와의 기전적 차별성과 생약 특유의 섭취 안전성을 특징으로 하는 체중 또는 체지방 조절 기능성 소재로의 활용 가능성도 충분히 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
이같은 현상은 천연물 추출물의 생리학적 효능을 검증한 선행 논문에서도 종종 발견되며(19,20), 본 논문에서 확인한 mRNA 발현 결과에서도 나타난다. 본 논문에서 확인된 지표들 중 대부분은 HFD군에 비해 ID1216 처리군에서 증가된 발현량을 보였으며 서로 다른 용량 처리군 간에 통계적으로 유의한 차이가 확인되지 않았다. 따라서 이번 연구 결과는 ID1216의 농도의존적 효능에 비해 동물 개체 차이가 크게 반영되었을 가능성도 존재하는 것으로 사료된다.
이와는 별개로 ID1216은 중성지질을 분해하는 것으로 알려진 ATGL의 mRNA 발현 또한 증가시키는 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 ID1216이 조직에 따라 지질 및 에너지 대사와 관련된 인자의 발현에 영향을 주는 체중 조절에 효과적인 소재임을 알 수 있었다. 또한 비만 치료제와의 기전적 차별성과 생약 특유의 섭취 안전성을 특징으로 하는 체중 또는 체지방 조절 기능성 소재로의 활용 가능성도 충분히 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 ID1216을 고지 방식이와 함께 6주간 투여한 마우스의 간 조직에서 AMPK의 단백질이 농도의존적으로 인산화 됨으로써 활성화 되는 것을 확인하였으며(Fig. 7) 이를 통해 간 조직에서 나타나는 PGC1α와 PPARα의 발현 촉진 효과가 SIRT1 이외에도 AMPK를 통해 조절될 가능성이 있음을 확인하였다.
상기 결과에서 ID1216이 SIRT1, PGC1α, PPARα의 단백질 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며 따라서 하위 유전자들의 조절을 통해 에너지 대사 및 지방산 대사에 관여할 가능성이 높다고 판단하였고 관련 mRNA의 발현을 확인하였다.
상기 언급된 바와 같이, 체중 증가 억제 기전을 규명하기 위해 실시된 선행 연구결과에서, ID1216의 8주 투여가 SIRT1-PGC1α-PPARα pathway를 조절하는 것을 mRNA 분석을 통해 확인하였으며, 단회 투여 시 단백질 발현에 영향을 주는 것으로 확인되었다(15-17).
10에 나타내었다. 실험 결과 ID1216은 고지방 식이 유도 비만 마우스에서 체중 증가 억제를 나타내었으며, 비만 대사 관련 pathway의 상위 유전자로 사료되는 SIRT1과 AMPK의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 활성화된 SIRT1과 AMPK는 PGC1α의 활성화에 관여하고, 이를 통해 열 발산 대사와 관련된 UCP 단백질과 핵 수용체 단백질인 PPARα의 발현이 백색지방, 갈색지방, 간 및 근육에서 증가되는 것이 확인되었다.
UCP 단백질 분석은 열발산 대사 및 UCP 유전자에 의한 산화 과정이 보고된 조직에 대해서만 분석을 실시하였으며 각 조직 별로 발현도가 높은 것으로 알려진 isoform을 선정하여 단백질 발현 변화를 관찰하였다(41). 실험결과 6주간의 ID1216 투여는 백색지방조직에서는 UCP2를, 갈색지방조직에서는 UCP1을, 근육조직에서는 UCP3의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(Fig. 8). 각 조직에서의 UCP 발현은 백색지방조직과 근육조직에서는 ID1216 투여 용량에 의존적으로 증가하였으나 갈색지방조직에서는 ID1216 30 mg/kg군에서 이미 발현이 상당히 증가되며 더 높은 용량 투여 시에도 증가하지 않았다.
이는 ATGL 발현 감소 또는 억제가 세포 내 free fatty acid의 절대적인 양을 감소시켜 PPARs의 발현에 영향을 주는 결과를 초래하는 것으로 해석할 수 있다. 실험결과를 보면 ID1216은 백색지방, 갈색지방 및 간 조직에서 ATGL의 mRNA 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 9). ID1216이 ATGL의 발현을 증가시킬 수 있는 원인으로 SIRT1의 발현 증가 효능을 예상할 수 있다.
연구 결과 백색지방, 갈색지방, 간 및 근육 조직 내 SIRT1(Fig. 2), PGC1α (Fig. 3), PPARα (Fig. 4) 단백질 발현이 ID1216 투여에 의해 증가함을 확인하였다.
5). 이 결과는 ID1216이 지방산 산화의 시작을 유도함으로써 대사 변화를 이끌어 내 체중 감소 작용을 할 수 있음을 의미한다. 또한 ID1216은 β-oxidation의 필수 효소인 CPT1a의 mRNA 발현을 백색지방과 간 조직에서 촉진시키는 것으로 확인되었다(Fig.
6주간 고지방식이(high fat diet: HFD)와 ID1216을 동시에 투여하면서 C57BL/6J 마우스의 체중 증가에 대한 영향을 관찰하였다. 정상식이군(normal diet: ND)대비 HFD를 급여한 군에서 발생한 현저한 체중 증가는 양성대조물질로 사용된 orlistat 투여에 의해 약 26% 억제되었다(Fig. 1). 선행연구와 마찬가지로 ID1216 투여군은 30, 100, 300 mg/kg 모든 용량에서 HFD군 대비 체중 증가를 유의적으로 억제하였다.
종합하면, ID1216은 조직마다 발현이 우세하다고 알려진 CPT1 isoform에 대해 선택적으로 mRNA 발현 증가 효과를 나타냈다. 이와 같은 발현 조절 효과는 지질 대사와 관련된 백색지방, 갈색지방, 간 및 근육 조직에서 관찰되었고 ID1216이 나타내는 체지방 감소 효과의 주요 작용 기전 중 하나로 β-oxidation이 관여하고 있음을 의미한다.
종합하면, ID1216은 지방 및 간 조직에서 ATGL의 mRNA 발현을 증가시킴으로써 지질 분해를 유발하였다. 따라서 비만으로 인한 체중 증가 억제 효능은 지질 분해 기전을 통해 작용하였을 가능성이 존재한다.
선행된 두 차례의 연구에서(15-16) 부고환 지방의 무게를 유의적으로 감소시켰으며, 근육 소실을 억제하는 SIRT1과 PGC1α의(18-19) mRNA 발현을 증가시켰기 때문이다. 추가적으로 본 연구에서 상기 mRNA 지표의 단백질 발현 역시 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
선행연구와 마찬가지로 ID1216 투여군은 30, 100, 300 mg/kg 모든 용량에서 HFD군 대비 체중 증가를 유의적으로 억제하였다. 특히 ID1216 300 mg/kg 투여군은 투여 3주차 때부터 유의적인 체중 증가 억제 효과를 나타내기 시작했고 시험 종료 시, HFD군 대비 체중 증가를 약 47% 억제함으로써 orlistat보다 우수한 효능을 보였다. ID1216 100 mg/kg 투여군과 30 mg/kg 투여군은 각각 투여 4주차와 5주차 때 HFD군 대비 체중 증가 억제 효능을 보이기 시작하였으며 최종 체중 증가 억제율은 각각 41%와 33%로 나타났다.
활성화된 SIRT1과 AMPK는 PGC1α의 활성화에 관여하고, 이를 통해 열 발산 대사와 관련된 UCP 단백질과 핵 수용체 단백질인 PPARα의 발현이 백색지방, 갈색지방, 간 및 근육에서 증가되는 것이 확인되었다.
흥미로운 사실로, 백색 지방 조직에서 UCP2의 발현이 p<0.01 수준에서 증가한 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 8B).
후속연구
mRNA 발현 수준으로 미루어 보아 ID1216의 투여는 β-oxidation을 증가 시킬 것으로 예측되나 실제로 발생하는지 여부에 대해 추가적인 검증이 필요할 것으로 보인다.
또한 SIRT1, PGC1α, PPARα 증가는 백색지방의 베이지색 지방으로의 변화를 유발할 가능성이 있는 것으로 보고되었으며 상기 3종에 대해서 발현 증가 효과를 확인하였기에 ID1216은 백색지방의 베이지색화를 통해 열 발산 대사에 영향을 줄 가능성이 있을 것으로 예상된다. 다만 백색지방의 베이지색화를 명확히 검증하기 위하여 조직 내 UCP1에 대한 발현 증가 여부를 후속 연구를 통해 확인할 필요성이 존재한다. 흥미로운 사실로, 백색 지방 조직에서 UCP2의 발현이 p<0.
본 연구에서는 ID1216에 의한 AMPK의 활성 증진 효과를 간 조직에서만 확인하였다. 향후 지방조직과 근육조직에서도 ID1216이 AMPK의 활성을 조절하여 지질 및 에너지 대사 등에 영향을 미치는지 여부에 대해 추가 연구를 통해 검증할 필요가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비만이란?
비만은 에너지 섭취량과 소비량의 불균형으로 인해 나타나는 질환으로 조직 내 지질이 과다 축적된 상태를 말한다. 비만이 원인이 되어 나타나는 대표적인 질환인 대사증후군은 국내에서 1998년 25.
지방조직의 종류는?
지방조직은 백색지방조직(white adipose tissue)과 갈색지방조직(brown adipose tissue)으로 분류되는데 백색지방조직은 지질을 중성지방(triglyceride)의 형태로 저장하여 에너지로 활용하지만 갈색지방조직은 백색지방조직에 비해 매우 적은 양의 지방을 저장하는 반면 많은 양의 미토콘드리아를 보유함으로써 열 발산 대사(thermogenesis)에 주로 참여한다. 최근에는 이러한 조직 특이성을 근거로 하여 지방조직과 근육조직의 지방대사조절 기능 이외에도 에너지 대사 조절을 통한 체중 조절 기능성 탐색이 제시되고 있다.
UCP 단백질 중 거의 모든 조직에 존재하는 것은?
열 발산 대사에 관여하는 대표적인 유전자인 UCP 단백질은 크레브스 회로(Kreb’s cycle)을 거쳐 생성되는 양성자(proton)가 ATP 합성효소(synthase)에 의해 ATP 생성반응에 이용되는 것을 막음으로써 열방출 반응을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. UCP1은 주로 갈색지방조직에, UCP2는 거의 모든 조직에 존재하나 특히 에너지 대사의 주요 기관인 근육과 간, 지방조직 및 췌장의 베타세포에 존재하며 UCP3는 갈색지방조직과 골격근조직에서 주로 발현된다(12-14).
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