선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 저자는 본 처방의 효능이 모낭에 분포하는 모발 성장인자에 미치는 영향 및 모낭에 미치는 면역계의 작용을 알아보기 위해 C57BL/6 마우스의 털을 제모하고 益氣補血湯을 투여한 후 육모지수와, 모낭의 조직학적 변화를 살펴보았으며, 모낭에 분포하는 모발 성장인자중 TGF-β1, EGF의 발현양상을 측정하고, 탈모 관련 cytokine중 혈중 IFN-γ, IL-4와 IL-10의 발현양을 측정한 결과 다음과 같은 유의한 결과를 얻은 바 이에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 지금까지 본 처방에 대해 실험적 연구가 진행되지 않았고 특히, 본 처방이 모낭에서 분비되는 모발 성장인자에 미치는 영향 및 모낭에 미치는 면역계의 작용을 알아보기 위해 본 실험을 하였다.
제안 방법
- 益氣補血湯의 육모촉진 효과를 관찰하기 위하여 제모된 C57BL/6 마우스에 益氣補血湯을 14일간 경구투여한 다음 육안적 발모상태 및 발모면적, 모발 및 모낭의 조직학적 변화, 모낭에서의 TGF-β1 및 EGF 발현을 면역조직화학염색을 통해 관찰하였다.
- 제모된 C57BL/6 마우스에 식염수를 경구투여한 군을 대조군(Control)으로, 益氣補血湯을 경구투여한 군을 실험군(Sample)으로 나누었다. 각군은 18마리씩으로 하였으며, 식염수와 약물의 경구 투여는 제모한 다음 날부터 매일 오전 10시에 1회씩 2주간 실시하였다.
- 제모된 분홍색 피부상태는 4등급으로 0점, 모낭으로부터 털이 자라기 시작하여 피부가 회색을 띠면 3등급으로 1점, 피부 바깥쪽으로 털이 다시 자라 나온 것을 육안으로 확인할 수 있는 상태는 2등급으로 2점, 털이 완전히 자란 것은 1등급으로 3점을 부여하였다. 다음으로 배부 전체 제모된 면적에 대하여 각각 등급별로 털이 자란 면적비율을 측정하고, 각각의 면적비율에 점수를 곱한 총합을 육모지수로 하였다(Fig. 1). 이에 따른 육모지수는 최소값 0%에서 최대값 300%를 나타내게 된다.
- 육모 상태를 확인하기 위하여 실험개시 1일, 4일, 7일, 10일 및 14일에 생쥐를 2% isoflurane으로 가볍게 흡입마취한 후 배부를 디지털카메라(EOS-10D, Canon, Japan)로 사진 촬영하여 관찰하였다. 동일한 mouse를 구분하기 위해서는 유성필기구를 사용하여 꼬리에 각기 다른 색깔을 표시하여 구분하였다.
- 또한 혈청에서의 IFN-γ, IL-4, IL-10의 변화에 대해서 관찰하여 아래와 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구에서는 육안적 발모상태의 변화, 발모면적, 모낭 및 모발의 조직학적 변화, 모낭에 분포하는 모발 성장인자 중 TGF-β1, EGF와 탈모와 관련된 혈청 cytokine중 IFN-γ, IL-4, IL-10의 발현양을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 실험 14일째에 실험동물을 과용량의 sodium pentobarbital로 희생시킨 다음 배부의 피부조직을 채취하여 일부는 dry ice-isophentane으로 동결시켜 면역조직화학염색용으로 사용하였으며, 일부는 10% neutral formalin 용액으로 고정하고 수세한 다음 탈수과정을 거쳐 파라핀 포매하였다. 파라핀 포매한 피부조직은 8㎛의 두께로 절편하여 털의 상태와 모낭을 관찰하기 위하여 Hematoxyline & Eosin (H&E) 염색을 실시하였다.
- 실험 1일, 7일 및 14일 째에 무작위로 실험 동물 6마리씩을 선택하여 sodium pentobarbital로 가볍게 마취한 다음 심장으로부터 혈액을 채취하고 1,000g으로 15분간 원심분리한 후 혈청을 분리하여 동결 보관 하였다. 혈청에서 IFN-γ, IL-4와 IL-10의 정량은 각각의 전용 colorimetric Sandwich ELISA ki(Quantikine, R&D Systems, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 7g의 분말 건조된 엑기스를 얻었다. 실험동물의 투여량은 체중비례 계산량의 10배인 26.1mg/10g body weight를 1회 투여량으로 하였다. 약물의 투여는 각각의 1회 투여량을 0.
- 1mg/10g body weight를 1회 투여량으로 하였다. 약물의 투여는 각각의 1회 투여량을 0.2ml의 음용수에 녹여 1일 1회, 2주간 경구투여 하였다.
- 육모 상태를 수치화하여 비교검증하기 위해서, 디지털카메라로 촬영된 영상을 컴퓨터에 입력한 다음 NIH의 “Image J” software(ver. 1.36)를 사용하여 육모지수를 측정하였다.
- 육모 상태를 확인하기 위하여 실험개시 1일, 4일, 7일, 10일 및 14일에 생쥐를 2% isoflurane으로 가볍게 흡입마취한 후 배부를 디지털카메라(EOS-10D, Canon, Japan)로 사진 촬영하여 관찰하였다. 동일한 mouse를 구분하기 위해서는 유성필기구를 사용하여 꼬리에 각기 다른 색깔을 표시하여 구분하였다.
- 육모 촉진효과를 관찰하기 위해 6주령의 C57BL/6마우스 배부의 검정색 털을 일차적으로 animal hair clipper로 제거한 다음 니크린 제모약(일동제약, Korea)을 사용하여 나머지 털을 완전히 제거하고 깨끗이 닦아주었다. 제모된 C57BL/6 마우스에 식염수를 경구투여한 군을 대조군(Control)으로, 益氣補血湯을 경구투여한 군을 실험군(Sample)으로 나누었다.
- 2). 육모지수를 통해 각 군 간의 정량적 비교를 실시하였다.
- Primary antibody의 처리는 anti-TGF-β1(sc-146, Santa Cruz, USA)와 anti-EGF(MAB236, R&D Systems, USA)를 PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 12시간 반응시켰다. 이후 조직을 PBS로 씻어내고, abidin-biotin immunoperoxidase(ABC Vectastain Kit, USA)에 따라 각각 한 시간씩 반응시켰다. 다음 NiCl2 H2O(Sigma, USA)를 섞은 diaminobenzidine tetrachloride(Sigma, USA)에서 5-10분간 발색 반응시키고, 조직을 poly-L-lysine 코팅된 슬라이드에 붙인 후 2-3시간 건조시킨 다음 탈수, 봉합하여 조직 표본을 제작하였다.
- 육모 촉진효과를 관찰하기 위해 6주령의 C57BL/6마우스 배부의 검정색 털을 일차적으로 animal hair clipper로 제거한 다음 니크린 제모약(일동제약, Korea)을 사용하여 나머지 털을 완전히 제거하고 깨끗이 닦아주었다. 제모된 C57BL/6 마우스에 식염수를 경구투여한 군을 대조군(Control)으로, 益氣補血湯을 경구투여한 군을 실험군(Sample)으로 나누었다. 각군은 18마리씩으로 하였으며, 식염수와 약물의 경구 투여는 제모한 다음 날부터 매일 오전 10시에 1회씩 2주간 실시하였다.
- 육모지수(Hair Regrowth index, HRG index)는 다음과 같이 계산하였다. 첫째, fig. 1-A에서와 같이 털의 재성장에 의한 배부의 피부색깔 차이에 따라 4등급으로 구분하고 각각 0점부터 3점까지의 점수를 배정하였다. 제모된 분홍색 피부상태는 4등급으로 0점, 모낭으로부터 털이 자라기 시작하여 피부가 회색을 띠면 3등급으로 1점, 피부 바깥쪽으로 털이 다시 자라 나온 것을 육안으로 확인할 수 있는 상태는 2등급으로 2점, 털이 완전히 자란 것은 1등급으로 3점을 부여하였다.
- 파라핀 포매한 피부조직은 8㎛의 두께로 절편하여 털의 상태와 모낭을 관찰하기 위하여 Hematoxyline & Eosin (H&E) 염색을 실시하였다.
- 혈청에서 IFN-γ, IL-4와 IL-10의 정량은 각각의 전용 colorimetric Sandwich ELISA ki(Quantikine, R&D Systems, USA)를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 또한, melanocyte가 모낭에만 한정적으로 존재하고 melanin 합성이 모발 성장주기와 잘 일치되어 피부색으로 모발의 성장주기를 판정할 수 있는 장점을 지녀 모발 생리 연구에 널리 이용되고 있다58,59). 본 연구에서는 androgen의 작용이 배제된 상태에서 육모 효과를 관찰하기 위하여 5주령된 암컷 C57BL/6 마우스를 구입하여 1주일간 순화기간을 거쳐서 6주령 된 마우스를 가지고 실험을 시작하였다.
- 생후 5주된 암컷 C57BL/6 마우스(샘타코, Korea) 36마리를 1주간 동물 사육실 환경에 적응시킨 후에 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도(21～23℃), 습도(40～60%), 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료(삼양사, Korea)를 자유롭게 공급받았으며, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨후 사용하였다.
- 생후 5주된 암컷 C57BL/6 마우스(샘타코, Korea) 36마리를 1주간 동물 사육실 환경에 적응시킨 후에 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도(21～23℃), 습도(40～60%), 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료(삼양사, Korea)를 자유롭게 공급받았으며, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨후 사용하였다.
- 모든 결과는 Mean ± Standard error로 표시하였다. 통계분석에 사용된 실험동물의 수는 각각 실험에 사용된 수에 따라 18마리, 12마리 그리고 6마리가 사용되었다(n=18, 12, 6).
데이터처리
- Statistical significance was verified with Mann-Whitney U test between the control and sample group(*, P<0.05).
- Statistical significance was verified with Mann-Whitney U test between the control and sample group(*, P<0.05; ***, P<0.001).
- Statistical significance was verified with Mann-Whitney U test between the control and sample group.
- 모든 결과는 Mean ± Standard error로 표시하였다.
- 실험자료의 통계분석은 대조군에 대한 실험군의 유의성을 p<0.05 수준에서 Mann-Whitney U test 방법을 사용하여 검정하였다.
성능/효과
- 1. 발모면적비율에서 유의성 있는 증가를 나타내었다.
- 2. 모발의 밀도, 성모의 수 및 성모 비율에서 유의성 있는 증가를 나타내었다.
- 3. 대조군과 益氣補血湯 투여군 모두에서 모낭의 TGF-β1은 관찰되지 않았다.
- 5. 혈청 IFN-γ는 실험 7일째 유의하게 감소되었으며 실험 14일째는 감소되었으나 유의성은 없었다.
- 6. 혈청 IL-4는 실험 7일째는 유의하게 증가되었으며 실험 14일째는 증가되었으나 유의성은 없었다.
- 7. 혈청 IL-10은 감소되었으나 유의성은 없었다.
- 이는 益氣補血湯이 TGF-β1 발현에 영향을 미치지 못하였거나 또는 발현을 억제한 결과로 추측되며, 이는 益氣補血湯이 모낭의 주기를 퇴행기로 전이시키거나 세포를 고사시키는 작용은 없는 것을 의미할 것으로 생각된다. EGF 발현을 관찰한 결과, 대조군은 모발의 굵기가 일정 수준 이상인 성모와 굵기가 가는 새롭게 자라나는 털의 외모근초에서 미약한 양성 반응을 나타내었으며, 내모근초에는 음성반응을 나타내었으나 益氣補血湯 투여군은 전체적으로 굵기가 일정 수준 이상인 성모의 외모근초에서는 EGF에 대하여 미약한 또는 중등도의 양성반응을 나타내었으며, 특히 굵기가 가는 새롭게 자라나는 털의 외모근초에서는 매우 강한 EGF 양성 반응을 나타내어 益氣補血湯이 모근의 EGF 발현에 영향을 미쳐 모발의 성장을 촉진하고 세포분열을 자극하여 육모를 촉진하는 작용이 있음을 추측할 수 있다.
- 益氣補血湯을 경구투여한 실험군은 1일째에 5.8±1.2pg/ml, 7일째에 105.6±25.3pg/ml, 14일째에 48.5±10.3pg/ml으로 대조군에 비하여 7일째에 P<0.05의 유의한 혈청 IFN-γ의 감소를 나타내었다(Table 3).
- 대조군은 제모 이후 4일까지는 배부 전체가 제모된 상태의 분홍색 피부로 관찰되었고, 7일째에 피부가 부분적으로 회색 피부로 변하여 모낭으로부터 새로운 털이 자라나는 것을 관찰할 수 있었으나 매우 제한된 국소적인 변화였으며, 10일째에는 일부분에서 피부 바깥쪽으로까지 털이 자라난 것을 관찰할 수 있었고, 14일째는 부분적이기는 하지만 검정색 털이 완전히 자라났다. 이에 비하여 益氣補血湯을 경구투여한 실험군은 7일째까지는 변화가 대조군과 비슷하였으나 7일째에 회색으로 변한 피부 부위가더 넓었으며, 10일째에도 피부 바깥쪽까지 털이 자라난 부위 면적이 더 넓었고, 14일째에는 배부 전체적으로 털이 완전히 다시 자라났다(Fig.
- 모낭 및 모발의 조직학적 변화를 살펴보면 대조군은 부분적으로 모낭의 발달이 미약하거나 털이 자라더라도 털의 형태가 둥글지 않고 반달형으로 변형되어 있거나, 내모근초의 발달이 충분하지 못한 것이 부분적으로 관찰되었다. 이에 비해 益氣補血湯을 투여한 군은 전체적으로 모낭이 잘 발달되어 있으며, 내모근초도 잘 발달되어 털이 둥근 형태로 자라난 것을 관찰할 수 있어 육안적 관찰 뿐만 아니라 조직학적으로도 대조군에 비해 양호한 육모상태를 나타내어 육모의 양적, 질적 우위를 확인할 수 있었다.
- 발모면적을 측정한 결과, 대조군은 1일부터 7일까지 보다는 7일부터 14일까지에서 뚜렷한 발모상태를 보였으나 益氣補血湯 투여군은 대조군에 비하여 7일째에는 P<0.001, 10일째와 14일째에는 P<0.05의 유의성 있는 육모지수의 증가를 나타내었다.
- 본 연구에 사용된 C57BL/6 mouse는 생후부터 모든 모낭이 모발 성장주기의 성장기로 들어가 털이 자라기 시작하였다가 생후 약 3주경 휴지기로 전이된 다음 바로 2차 성장기로 접어들어 6주경 모든 모낭이 휴지기로 전이되어 약 4주 이상 지속되므로 실험동물의 효과를 평가하기 위한 시간적 여유가 있다는 장점을 지녔다. 또한, melanocyte가 모낭에만 한정적으로 존재하고 melanin 합성이 모발 성장주기와 잘 일치되어 피부색으로 모발의 성장주기를 판정할 수 있는 장점을 지녀 모발 생리 연구에 널리 이용되고 있다58,59).
- 육모상태를 털이 자란 피부상태와 면적에 근거하여 육모지수로 측정한 결과, 대조군은 1일째에 0%, 4일째에 4.8±0.6%, 7일째에 27.6±4.9%, 10일째에 130.8±11.1%, 14일째에 208.9±15.2%를 나타내어 1일부터 7일까지 보다는 7일부터 14일까지에서 큰 변화를 나타내었다.
- 이러한 결과를 종합해 검토한 결과 益氣補血湯은 대조군에 비하여 우수한 육모촉진 효과가 있으며 그 기전은 모낭에서 EGF의 발현을 증가시키며 혈청 IFN-γ의 감소 및 혈청 IL-4의 증가를 통한 작용에 의한 것으로 추측된다.
- 6-1). 이에 비하여 益氣補血湯을 경구투여한 실험군은 전체적으로 굵기가 일정 수준 이상인 성모의 외모근초에서는 EGF에 대하여 미약한(+) 또는 중등도(++)의 양성반응을 나타내었으며, 특히 굵기가 가는 새롭게 자라나는 털의 외모근초에서는 매우 강한(+++) EGF 양성반응을 나타내었다(Fig. 6-2).
- 4-2). 이에 비하여 益氣補血湯을 경구투여한 실험군은 전체적으로 모낭이 잘 발달되어 있으며(Fig. 4-3), 내모근초도 잘 발달되어 털이 둥근 형태로 자라난 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4-4).
- 모낭 및 모발의 조직학적 변화를 살펴보면 대조군은 부분적으로 모낭의 발달이 미약하거나 털이 자라더라도 털의 형태가 둥글지 않고 반달형으로 변형되어 있거나, 내모근초의 발달이 충분하지 못한 것이 부분적으로 관찰되었다. 이에 비해 益氣補血湯을 투여한 군은 전체적으로 모낭이 잘 발달되어 있으며, 내모근초도 잘 발달되어 털이 둥근 형태로 자라난 것을 관찰할 수 있어 육안적 관찰 뿐만 아니라 조직학적으로도 대조군에 비해 양호한 육모상태를 나타내어 육모의 양적, 질적 우위를 확인할 수 있었다.
- 제모 이후 14일째에, 각각 실험동물의 피부조직을 EGF에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 관찰한 결과, 생리식염수를 경구투여한 대조군은 모발의 굵기가 일정 수준 이상인 성모와 굵기가 가는 솜털의 모근 외모근초에서 미약한(± 또는 +) 양성반응을 나타내었으며, 내모근초에서는 음성반응(-)을 나타내었다(Fig. 6-1).
- 특히 본 연구에서 혈청 IFN-γ과 혈청 IL-4의 변화를 살펴보면, 실험 7일째까지 혈청 IFN-γ가 증가하다가 실험 14일째는 실험 7일째에 비해 감소되었고, 혈청 IL-4는 실험 7일째까지 혈청 IL-4이 감소하다가 실험 14일째는 실험 7일째에 비해 증가되었다.
- 혈청 cytokine중 IFN-γ의 변화를 관찰한 결과, 대조군은 7일째에 현저하게 증가하였다가 14일째에는 감소하였고, 益氣補血湯 투여군은 대조군에 비하여 7일째에 P<0.05의 유의한 혈청 IFN-γ의 감소를 나타내다가 14일째에는 감소하였으나 유의한 차이를 보이지는 않았다.
후속연구
- 그러나 본 실험은 병리적 탈모현상을 가진 실험 동물을 이용한 실험이 아니라 제모를 실시한 이후에 수행되어진 실험이라는 점에서 한계를 가지고 있다. 특히 본 연구에서 혈청 IFN-γ과 혈청 IL-4의 변화를 살펴보면, 실험 7일째까지 혈청 IFN-γ가 증가하다가 실험 14일째는 실험 7일째에 비해 감소되었고, 혈청 IL-4는 실험 7일째까지 혈청 IL-4이 감소하다가 실험 14일째는 실험 7일째에 비해 증가되었다.
- 이러한 경향성은 대조군과 실험군에서 동일하게 나타나며, 실험 14일째는 대조군과의 비교에서 실험군의 유의성 있는 효과를 관찰할 수 없다. 이러한 변화의 경향성은 실험 동물의 제모로 유발되는 모낭의 cytokine의 변화에 대한 연구를 통해 보완될 수 있으리라 생각되어 진다.
- 이상의 연구와 문헌에 따르면 益氣補血湯은 補氣, 補血효과가 있으며19-25), 면역력 개선의 효과가 있을 것으로 사료되며 이러한 효과는 모발탈락의 원인으로 알려진 모낭의 면역특권 소실을 개선하여 육모를 촉진하는 효과가 있으리라 추정된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.