솔잎은 항산화력이 우수한 것으로 알려져 있으며, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cell은 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어왔다. 따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 적송잎 용매별 추출물이 세포 증식에 미치는 영향과 ALP 활성 및 조골세포의 골 형성을 위한 필수 인자인 콜라겐 합성의 영향에 대해 검토하였다. 적송잎 추출물의 농도(1, 10 50, $100\;{\mu}g/ml$)에 따른 조골세포 성장에 미치는 영향을 MTT assay로 분석한 결과, proanthocyanidin의 경우 $50\;{\mu}g/ml$ 이상 첨가한 군에서 대조군보다 급격한 증식률을 나타내었다. 에탄올 추출물을 첨가하였을 때 유의적인 증식률이 나타나지 않은 반면, 적송잎 헥산 추출물 처리군에 있어서는 $10\;{\mu}g/ml$ 농도 이상에서 유의적으로 세포증식이 촉진되었다. 적송잎 추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 적송잎 추출물이 조골세포의 ALP의 활성을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성이 제시 되었다. 또한 적송잎의 열수 및 에탄올 추출물보다 헥산 추출물에서 조골세포의 ALP 활성이 증가하여 적송잎의 ALP 활성에 영향을 주는 성분은 수용성 성분보다 지용성 성분인 것으로 추측되었다. 적송잎 추출물이 조골세포의 콜라겐 합성에 미치는 실험결과에서 헥산 추출물뿐만 아니라 열수 추출물에서도 높은 콜라겐 합성능력을 나타내었다. 따라서 단일성분에 의한 것보다 복합적 성분들의 상승작용에 의해 조골세포의 콜라겐 합성이 촉진된 것으로 추측할 수 있다. 적송잎 추출물이 조골세포의 증식, ALP 활성 및 콜라겐 합성을 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것이 확인되었으며, 그에 대한 구체적인 기작 연구를 위하여 향후 분자생물학적인 차원에서의 in vitro 및 in vivo 실험을 통한 구체적인 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
솔잎은 항산화력이 우수한 것으로 알려져 있으며, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cell은 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어왔다. 따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 적송잎 용매별 추출물이 세포 증식에 미치는 영향과 ALP 활성 및 조골세포의 골 형성을 위한 필수 인자인 콜라겐 합성의 영향에 대해 검토하였다. 적송잎 추출물의 농도(1, 10 50, $100\;{\mu}g/ml$)에 따른 조골세포 성장에 미치는 영향을 MTT assay로 분석한 결과, proanthocyanidin의 경우 $50\;{\mu}g/ml$ 이상 첨가한 군에서 대조군보다 급격한 증식률을 나타내었다. 에탄올 추출물을 첨가하였을 때 유의적인 증식률이 나타나지 않은 반면, 적송잎 헥산 추출물 처리군에 있어서는 $10\;{\mu}g/ml$ 농도 이상에서 유의적으로 세포증식이 촉진되었다. 적송잎 추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 적송잎 추출물이 조골세포의 ALP의 활성을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성이 제시 되었다. 또한 적송잎의 열수 및 에탄올 추출물보다 헥산 추출물에서 조골세포의 ALP 활성이 증가하여 적송잎의 ALP 활성에 영향을 주는 성분은 수용성 성분보다 지용성 성분인 것으로 추측되었다. 적송잎 추출물이 조골세포의 콜라겐 합성에 미치는 실험결과에서 헥산 추출물뿐만 아니라 열수 추출물에서도 높은 콜라겐 합성능력을 나타내었다. 따라서 단일성분에 의한 것보다 복합적 성분들의 상승작용에 의해 조골세포의 콜라겐 합성이 촉진된 것으로 추측할 수 있다. 적송잎 추출물이 조골세포의 증식, ALP 활성 및 콜라겐 합성을 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것이 확인되었으며, 그에 대한 구체적인 기작 연구를 위하여 향후 분자생물학적인 차원에서의 in vitro 및 in vivo 실험을 통한 구체적인 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
Osteoporosis is a disease involving a decrease in bone mineral density and an increased risk of fractures. The MC3T3-E1 pre-osteoblastic cell line is a well-accepted model of osteogenesis in vitro. Pine needles have long been used as a traditional health-promoting medicinal food in Korea. In this st...
Osteoporosis is a disease involving a decrease in bone mineral density and an increased risk of fractures. The MC3T3-E1 pre-osteoblastic cell line is a well-accepted model of osteogenesis in vitro. Pine needles have long been used as a traditional health-promoting medicinal food in Korea. In this study, MTT assay, the alkaline phosphatase (ALP) activity and collagen synthesis of osteoblast cells were investigated to determine the effects of pine needle extracts on cell proliferation and differentiation. Pine needle extracts were prepared using hexane, ethanol and water. The effects of the pine needle extracts were examined by comparing the results with those of commercial agents, such as proanthocyanidin. The MC3T3-E1 cells exposed to proanthocyanidin showed increased proliferation in a concentration-dependent manner. The cells exposed to the hexane extract showed a similar increase in proliferation to that observed with proanthocyanidin. The hexane extract showed the highest ALP activity. Moreover, a supplement of pine needle extracts induced collagen synthesis in MC3T3-E1 cells. The pine needle extract produced the highest level of collagen synthesis at concentrations of $10{\sim}50\;{\mu}g/ml$. These results indicate that pine needle extracts have an anabolic effect on bone by promoting osteoblastic differentiation, and may be used in the treatment of common metabolic bone diseases.
Osteoporosis is a disease involving a decrease in bone mineral density and an increased risk of fractures. The MC3T3-E1 pre-osteoblastic cell line is a well-accepted model of osteogenesis in vitro. Pine needles have long been used as a traditional health-promoting medicinal food in Korea. In this study, MTT assay, the alkaline phosphatase (ALP) activity and collagen synthesis of osteoblast cells were investigated to determine the effects of pine needle extracts on cell proliferation and differentiation. Pine needle extracts were prepared using hexane, ethanol and water. The effects of the pine needle extracts were examined by comparing the results with those of commercial agents, such as proanthocyanidin. The MC3T3-E1 cells exposed to proanthocyanidin showed increased proliferation in a concentration-dependent manner. The cells exposed to the hexane extract showed a similar increase in proliferation to that observed with proanthocyanidin. The hexane extract showed the highest ALP activity. Moreover, a supplement of pine needle extracts induced collagen synthesis in MC3T3-E1 cells. The pine needle extract produced the highest level of collagen synthesis at concentrations of $10{\sim}50\;{\mu}g/ml$. These results indicate that pine needle extracts have an anabolic effect on bone by promoting osteoblastic differentiation, and may be used in the treatment of common metabolic bone diseases.
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문제 정의
본 연구에 사용한 mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cell 은 in vivo 골 형성 과정에서 나타나는 세포의 증식, 분화, 석회화 등 골아세포와 유사한 대사적 특징을 가지고 있으므로, 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어 왔다[13,16]. 따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 적송잎 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향, 조골세포의 활성과 분화 인자인 ALP 활성 및 조골세포의 골 형성을 위한 필수인자인 콜라겐 합성에 미치는 영향을 검토하였다.
염기성 인산분해 효소(Alkaline phosphatase; ALP)는 거의 모든 조직에 존재하며 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다[14]. 따라서 조골세포 활성을 나타내는 biomarker [11]로서 MC3T3-E1 조골세포에서의 ALP 활성을 측정하여 적송잎 추출물이 조골세포의 골 성장 활성에 미치는 영향을 검토하였다.
제안 방법
동결 건조하여 얻은 적송잎 추출물 분말 각각 1, 10, 50, 100 μg/ml를 에탄올로 용해한 후, 0.2 μl membrane filter로 여과한 후 사용하였다.
배양 후 배지를 제거하고 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 100 μl씩 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시킨 뒤 ELASA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 적송잎의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
배양한 MC3T3-E1세포를 0.4% trypan blue 염색법을 이용하여 세포수를 1×105 cell/ml로 조정하여 96 well plate에 platting 한 후, 농도별로 준비된 적송잎 추출물을 20 μl씩 첨가하여 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
분화유도를 위해 5mM β-glycerol phosphate (Sigma Chem. Co., St. Louis. Mo., USA)와 50 mg/ml의 vitamin C (Sigma)를 첨가하여 분화유도 배지로 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.
1 N NaOH로 반응을 정지하고 200 μl 를 취해 405 nm에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 산출하였다. 세포수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 총 단백질 양을 측정하여 나누어 줌으로써 단위 세포수에 대한 ALP 활성도를 계산하였다.
열수 추출은 700 g에 물 4,500 ml을 첨가하여 121℃에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결 건조하여 제조하였다. 에탄올 및 헥산 추출은 분말 200 g에 각각 95% 에탄올 및 헥산 1,500 ml을 첨가하여 상온에서 24시간 침지하여 추출한 후 여과한 액을 동결 건조하여 제조하였다. 동결 건조하여 얻은 적송잎 추출물 분말 각각 1, 10, 50, 100 μg/ml를 에탄올로 용해한 후, 0.
본 실험에 사용한 적송잎은 2008년 지리산에서 채취하여 60℃에서 열풍 건조한 후 믹서로 분말화시켜 열수 추출, 에탄올 추출과 헥산 추출을 행하였다. 열수 추출은 700 g에 물 4,500 ml을 첨가하여 121℃에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결 건조하여 제조하였다. 에탄올 및 헥산 추출은 분말 200 g에 각각 95% 에탄올 및 헥산 1,500 ml을 첨가하여 상온에서 24시간 침지하여 추출한 후 여과한 액을 동결 건조하여 제조하였다.
05 M Tris-HCl buffer로 한번 더 현탁시킨 후 ultrasonicator로 sonication 시켰다. 이후 5% TCA를 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤 침전물에 5% TCA를 첨가한 후 이 과정을 2회 반복하였다. 상등액 제거 후 침전물에 6N HCl을 가하여 20 시간 동안 110℃에서 가수분해하고, 가수분해물을 여과 농축하여 pH를 중성으로 조절한 후 실험에 사용하였다.
대상 데이터
경희대학교 의과대학 내분비 연구실에서 분양 받은 mouse calvaria osteoblast cell 인 MC3T3-E1 세포는 α-MEM 배지 (Gibco BRL, Grand islane, N. Y., USA)에 10% FBS (Gibco)와 1% antibiotics (Gibco)를 첨가하면서 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 2~3일 마다 배지를 교환하면서 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용한 적송잎은 2008년 지리산에서 채취하여 60℃에서 열풍 건조한 후 믹서로 분말화시켜 열수 추출, 에탄올 추출과 헥산 추출을 행하였다. 열수 추출은 700 g에 물 4,500 ml을 첨가하여 121℃에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결 건조하여 제조하였다.
데이터처리
사후 검증은 Tukey를 적용하였고 p<0.05수준에서 유의수준을 검증하였다.
연구결과 얻어진 자료를 SPSS 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 사후 검증은 Tukey를 적용하였고 p<0.
이론/모형
상등액 제거 후 침전물에 6N HCl을 가하여 20 시간 동안 110℃에서 가수분해하고, 가수분해물을 여과 농축하여 pH를 중성으로 조절한 후 실험에 사용하였다. 시료 용액중의 hydroxyproline의 측정은 woessner [36]법을 이용하였고, 얻어진 hydroxyproline량으로부터 콜라겐량을 환산하였다. 콜라겐 중에 hydroxyproline이 약 10% 포함되어 있으므로, hydroxyproline (mg/100 ml)x100/11=콜라겐으로 산출하였다.
시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 세포 증식은 Green 등의 방법에 따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, sigma) 시약의 환원 정도를 측정하는 MTT assay 방법을 사용하여 측정하였다. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석은 탈수소 효소작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색의 formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로 이 검사법은 세포의 증식과 성장을 알아보는 대표적인 실험방법 중 하나로 살아있는 세포수에 비례해서 흡광도를 나타낸다.
성능/효과
대두 에탄올 추출물을 실험한 최[6]의 결과에서는 50~100μg/ml 의 농도로 조골 세포주에 처리한 결과 대조군에 비해 최고 117%의 증식률을 나타내었으나, 본 실험결과 적송잎의 100 μg/ml 헥산 및 50 μg/ml 열수 추출물 첨가 시 120% 이상의 증식유도 효과가 나타나 더 높은 조골세포 증식유도 결과임을 확인 할 수 있었다.
주로 세포막에 결합되어 존재하는 염기성 인산 분해효소는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타내는 효소로써 골세포 분화의 표지인자로 알려져 있다[34]. 따라서 이상의 결과는 적송잎 추출물이 조골세포의 ALP 의 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시하고 있다. 또한 적송잎의 열수 및 에탄올 추출물보다 헥산 추출물에서 조골세포의 ALP 활성이 증가하여 적송잎의 ALP 활성에 영향을 주는 성분은 수용성 성분보다 지용성 성분인 것으로 추측되었다.
5 mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 따라서, 이상의 실험결과에서 헥산 추출물뿐만 아니라 열수 추출물에서 높은 콜라겐 합성 능력을 나타낸 것으로 미루어 볼 때, 상이한 화학적 특성을 지닌 proanthocyanidin과 같은 단일성분 또는 복합적 성분들의 상승 작용에 의해 조골세포의 콜라겐 합성을 촉진시킨 것으로 추측할 수 있다. 적송잎 추출물이 콜라겐 합성을 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것이 확인되었으며, 그에 대한 구체적인 기작 연구를 위하여 in vivo 및 in vivo 실험을 통한 구체적인 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
따라서 이상의 결과는 적송잎 추출물이 조골세포의 ALP 의 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시하고 있다. 또한 적송잎의 열수 및 에탄올 추출물보다 헥산 추출물에서 조골세포의 ALP 활성이 증가하여 적송잎의 ALP 활성에 영향을 주는 성분은 수용성 성분보다 지용성 성분인 것으로 추측되었다.
이에 반해 에탄올 추출물을 첨가하였을 때 첨가 농도 증가에 의한 증식 증가는 나타났으나 유의적인 차이가 보이지 않은 반면, 열수 추출물의 경우 50 μg/ml 첨가하였을 때, 120% 이상의 증식률을 나타내 유의적인 증식향상이 유도되었다.
적송잎에 함유되어 있으면서 항산화능을 가진 것으로 알려져 있는 proanthocyanidin 의 조골세포 성장에 미치는 영향을 검토한 결과, 농도 10 μg/ml 까지는 증식률에 별다른 변화가 나타나지 않았으나 50 μg/ml 이상 첨가한 군에서 대조군보다 급격한 증식률을 나타내었다(p<0.001).
조골세포의 ALP 활성은 proanthocyanidin 을 첨가한 경우 1 μg/ml 이상의 농도에서 증가하였고 100μg/ml 농도에서는 대조군과 비교하여 유의성 있는 결과를 나타내었으나, 오히려 50 μg/ml 농도보다 감소하는 경향이 나타났다.
특히 열수 추출물을 50 μg/ml 첨가하였을 때 대조군에 비해 약 10배에 해당하는 콜라겐 합성 결과가 나타났다.
한편, 에탄올 추출물의 경우 10 μg/ml 농도에서 그 활성이 증가하였으나, 그 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었고, 열수 추출물에 있어서도 비슷한 결과를 나타내었다.
후속연구
따라서, 이상의 실험결과에서 헥산 추출물뿐만 아니라 열수 추출물에서 높은 콜라겐 합성 능력을 나타낸 것으로 미루어 볼 때, 상이한 화학적 특성을 지닌 proanthocyanidin과 같은 단일성분 또는 복합적 성분들의 상승 작용에 의해 조골세포의 콜라겐 합성을 촉진시킨 것으로 추측할 수 있다. 적송잎 추출물이 콜라겐 합성을 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것이 확인되었으며, 그에 대한 구체적인 기작 연구를 위하여 in vivo 및 in vivo 실험을 통한 구체적인 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대표적인 골 대사 질환 중 고령화 사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증이란?
그러나 일반적으로 폐경 후 에스트로겐이 감소하면서 파골세포에 의한 골 흡수가 폐경 전에 비해 많아져 빠른 뼈 손실이 일어나고 폐경 이후 10년 사이에 약 20%의 골 무기질이 감소하는 등[33] 골대사 질환을 가진다. 대표적인 골 대사 질환 중 고령화 사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 뼈 밀도가 낮아지고 뼈의 조직의 구조가 악화된 것으로 골절을 유발할 수 있는 질병으로 골 형성과 골 흡수의 불균형으로부터 야기되는 퇴행적인 골 대사 질환이다. 골다공증의 치료는 여성 호르몬 대체 요법, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), 비스포스포네이트, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌 투여 등으로 알려져 있다[12].
뼈는 어떤 기관인가?
뼈는 파골 세포에 의한 골 흡수와 그에 따른 조골세포에 의한 새로운 골 기질 형성, 그리고 무기질화 과정이 끊임없이 반복적으로 일어나는 활발한 대사기관이다. 그러나 일반적으로 폐경 후 에스트로겐이 감소하면서 파골세포에 의한 골 흡수가 폐경 전에 비해 많아져 빠른 뼈 손실이 일어나고 폐경 이후 10년 사이에 약 20%의 골 무기질이 감소하는 등[33] 골대사 질환을 가진다.
MC3T3-E1 세포를 이용하여 적송잎 용매별 추출물이 세포 증식에 미치는 영향과 ALP 활성 및 조골세포의 골 형성을 위한 필수 인자인 콜라겐 합성의 영향에 대한 실험의 결과는?
따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 적송잎 용매별 추출물이 세포 증식에 미치는 영향과 ALP 활성 및 조골세포의 골 형성을 위한 필수 인자인 콜라겐 합성의 영향에 대해 검토하였다. 적송잎 추출물의 농도(1, 10 50, $100\;{\mu}g/ml$)에 따른 조골세포 성장에 미치는 영향을 MTT assay로 분석한 결과, proanthocyanidin의 경우 $50\;{\mu}g/ml$ 이상 첨가한 군에서 대조군보다 급격한 증식률을 나타내었다. 에탄올 추출물을 첨가하였을 때 유의적인 증식률이 나타나지 않은 반면, 적송잎 헥산 추출물 처리군에 있어서는 $10\;{\mu}g/ml$ 농도 이상에서 유의적으로 세포증식이 촉진되었다. 적송잎 추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 적송잎 추출물이 조골세포의 ALP의 활성을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성이 제시 되었다. 또한 적송잎의 열수 및 에탄올 추출물보다 헥산 추출물에서 조골세포의 ALP 활성이 증가하여 적송잎의 ALP 활성에 영향을 주는 성분은 수용성 성분보다 지용성 성분인 것으로 추측되었다. 적송잎 추출물이 조골세포의 콜라겐 합성에 미치는 실험결과에서 헥산 추출물뿐만 아니라 열수 추출물에서도 높은 콜라겐 합성능력을 나타내었다. 따라서 단일성분에 의한 것보다 복합적 성분들의 상승작용에 의해 조골세포의 콜라겐 합성이 촉진된 것으로 추측할 수 있다.
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