[논문]42번째 alanine 잔기의 proline 치환에 의한 보리 <tex>$\\alpha$</tex>-amylase isozyme 2의 대장균 내 발현 증가 및 기질특이성 변화

최승호; 장명운; 이홍균; 김태집

42번째 alanine 잔기의 proline 치환에 의한 보리 $\\alpha$-amylase isozyme 2의 대장균 내 발현 증가 및 기질특이성 변화
Enhanced Expression and Substrate Specificity Changes of Barley $\\alpha$-Amylase Isozyme 2 in E. coli by Substitution of the $42^{nd}$ Alanine Residue with Proline 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.42 no.2 = no.210, 2010년, pp.198 - 203

최승호 (충북대학교 식품공학과) , 장명운 (충북대학교 식품공학과) , 이홍균 (충북대학교 식품공학과) , () , 김태집 (충북대학교 식품공학과)

초록
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보리 맥아에는 2종의 $\alpha$-amylase isozyme(AMY1, AMY2)이 존재하며, 이들 효소는 80% 이상의 높은 아미노산 서열 상동성을 보이지만, calcium 의존성 등 효소의 작용특성은 서로 매우 다르다. 따라서 본 연구에서는 AMY2의 활성부위 중 2번째 $\beta\rightarrow\alpha$ loop에 존재하는 42번째 alanine 잔기를 saturation mutagenesis를 이용하여 다양한 아미노산으로 치환하고, 전분 분해활성이 증가한 돌연변이를 선발하였다. 결과적으로 alanine이 proline으로 치환된 AMY2-A42P의 경우에서만 발현도가 2배 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 정제 과정에서의 회수율 또한 4배 증가하므로 향후 효소의 생산 및 활용에 유리할 것으로 판단하였다. 이 돌연변이 효소의 calcium 의존성 및 pH 안정성 등은 AMY2와 유사한 것으로 나타났으나, 각종 전분에 대한 기질특이성은 AMY1과 AMY2의 중간적인 특성으로 변화되었다. 결국 42번째 아미노산 잔기의 proline 치환에 의해 상대적으로 발현율이 높고 기질특이성이 변화된 AMY2 유사효소의 생산이 가능하였으며, 향후 이를 이용하여 분자진화기술 등 최신 효소공학적 방법론을 적용한 다양한 연구가 가능할 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Although barley $\alpha$-amylase isozyme 1 (AMY1) and 2 (AMY2) share up to 80% of amino acid sequence identity, their enzymatic properties differ remarkably. In this study, the 42nd alanine residue of AMY2 was replaced with another random amino acid via saturation mutagenesis. Eight out of 370 recombinant E. coli cells showing enhanced starch-hydrolyzing activity were characterized as possessing the same proline residue instead of alanine. Even though the specific activity of AMY2-A42P is reduced to 81% of wild-type, its expression level and purification yield were enhanced by approximately 2 and 4 times that of AMY2, respectively. Characterization of its enzymatic properties confirmed that AMY2-A42P is similar to that of wild-type. However, its specificity to starch substrates is likely to be intermediate between AMY1 and AMY2.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

최근에 Fukuda 등(19)은 AMY2의 2번째 β→α loop 구조에 위치하는 42번째 alanine 잔기를 AMY1에서와 같이 proline(AMY1의 경우 43번째 잔기에 해당)으로 치환하여, Pichia pastoris에서 AMY2의 세포 외 배출량을 약 20배 증가시켰다. 따라서 본 연구에서는 AMY1에 비해 발현도가 매우 낮은 AMY2의 대장균 내 발현량을 높이기 위하여, 42번째 alanine 잔기를 다양한 아미노산 잔기로 치환한 후, 기존의 AMY2에 비해 높은 전분 분해활성을 나타내는 돌연변이를 선발하였다. 또한 이들 돌연변이 효소의 특성을 규명하고, 기존의 AMY1 및 AMY2 효소와 비교하여 보리 α-amylase isozyme의 42번째 아미노산 잔기가 효소특성 및 대장균에서의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
또한 이들 돌연변이 효소의 특성을 규명하고, 기존의 AMY1 및 AMY2 효소와 비교하여 보리 α-amylase isozyme의 42번째 아미노산 잔기가 효소특성 및 대장균에서의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

가설 설정

2)Productivity corresponds to the expression level of each AMY shown as the amount of enzyme per 1 mL of E. coli culture broth (CB).

제안 방법

coli BL21(DE3) 균주를 대조군으로 하여, 앞에서 얻어진 370개 대장균의 전분 분해활성을 비교하였다. 1%의 soluble starch와 0.1 mM의 IPTG를 함유한 고체배지에서 대장균을 배양한 후, iodine에 의해 형성되는 투명한 환의 크기와 강도를 대조군과 비교하여 활성이 증가한 8개의 clone을 선발하였다. 선발된 clone들이 형성한 환의 크기는 정확히 일치하지 않았으나, 모두 AMY1 보다는 작고 AMY2에 비해서는 커진 것을 확인하였다.
다시 원심분리하여 상층액만을 취한 후, 1 mL 용량의 HisTrap™FF(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) column이 연결된 AKTA Prime(Amersham Biosciences)을 이용해 정제하였다. Elution buffer(20 mM NaH₂PO₄, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole, pH 7.4)를 1 mL/min의 유속으로 흘리며, 단계적으로 농도를 높여 각각의 분획을 얻은 후, 효소활성을 보이는 분획을 선별하였다. 얻어진 효소액을 농축하고, 투석하여 이후의 실험에 사용하였다.
Insoluble blue starch, corn starch, potato starch, soluble starch I(Showa), soluble starch II(Sigma-Aldrich) 등의 다양한 전분 기질에 대한 효소 별 specific activity를 측정하여 상호 비교하였다(Table 2). AMY2-A42P의 경우, 대부분의 전분 기질에 대하여 AMY2 대비 9-46% 감소한 활성을 보였으나, AMY1과 비교하면 38-78% 정도 가수분해활성이 높은 것으로 나타났다.
Insoluble blue starch를 기질로 하여 calcium chloride의 농도(0.1-50 mM)에 따른 효소활성 변화를 측정하였다. 선행연구 결과에 의하면 AMY1은 약 5 mM 또는 그 이하의 calcium 농도 하에서 최대 활성을 보이고, AMY2의 경우는 20 mM에서 가장 높은 활성을 나타내는 것으로 알려졌다(16).
각각 pETAMY1 및 pETAMY2 플라스미드가 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 균주를 대조군으로 하여, 앞에서 얻어진 370개 대장균의 전분 분해활성을 비교하였다. 1%의 soluble starch와 0.
기존의 AMY2 보다 전분 분해활성이 높은 돌연변이를 선별하기 위하여 PCR 증폭된 유전자를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환한 후, 얻어진 colony를 1% soluble starch, 0.1 mM IPTG, ampicillin(100 µg/mL)이 포함된 LB 고체배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar)에 tooth-picking하였다.
다시 원심분리하여 상층액만을 취한 후, 1 mL 용량의 HisTrap™FF(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) column이 연결된 AKTA Prime(Amersham Biosciences)을 이용해 정제하였다.
단백질 정량분석은 BCA™ Protein assay kit(Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하였다.
따라서 본 연구에서는 이러한 결과를 대장균 발현시스템에 적용하고자 Fig. 1에서와 같이 pETAMY2 플라스미드 주형과 degenerate mutagenic primer(α2A42X-N과 α2A42X-C)를 이용하여 AMY2 유전자의 Ala-42 위치에 해당하는 GCG codon을 NNN으로 치환하였다.
미리 준비한 1% 기질용액 50 µL에 적절히 희석한 효소액 50 µL를 섞고 최적온도(37℃)에서 10분간 반응한 후, 300 mL의 DNS용액을 가하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 100℃에서 5분간 가열하고 다시 냉각시킨 후, 550 nm에서 PowerWave spectrophotometer(Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, USA) 를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이때 1 unit은 주어진 반응조건에서 1분 동안 흡광도 값을 1 만큼 증가시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
보다 정확한 발현도 측정 및 효소특성 규명을 위하여 재조합 대장균 1 L를 배양한 후, Ni-NTA column chromatography를 이용하여 AMY2-A42P 효소를 정제하였다. 기존 AMY2의 경우 그 발현량이 매우 낮아 정제 후 회수율이 5% 미만이었으나, A42P mutant의 경우는 돌연변이의 도입으로 대장균 배양액 당 발현량이 2배 증가하였으며, 그로 인해 효소정제 과정에서의 회수율은 4배 정도 향상되었다(Table 1).
보리 AMY2 유전자를 포함하는 pETAMY2 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하였으며, 돌연변이 도입을 위한 mutagenic primer로 α2A42X-N(5'-CTGGCTCCCTCCGNNNTCGCAGTCCGTCG-3')과 α2A42X-C(5'-CGACGGACTGCGANNNCGGAGGGAGCCAG-3')를 첨가한 후 PCR을 통해 증폭하였다.
산성조건에서 AMY1이 AMY2에 비해 안정한 것으로 보고되었으므로, IBS를 기질로 하여 pH 3.5에서 AMY2-A42P의 안정성을 측정하고 AMY1, 2와 비교하였다(Fig. 6). 비록 약간의 차이는 있으나, 전체적으로 AMY2와 유사한 수준의 pH 안정성을 나타내었다.
6%(w/v) agar 용액을 천천히 부어 굳힌 다음, 37℃에서 12시간 동안 추가로 배양하였다. 여기에 iodine 용액을 처리하여 발색시킨 후, AMY2에 비해 상대적으로 환의 크기가 증가한 재조합 대장균을 선발하고, DNA sequencing(SolGent Co., Daejeon, Korea)을 통해 돌연변이 여부를 확인하였다.
1 mM이 되도록 첨가하여 발현을 유도(induction)하였다. 이후 배양온도를 15℃로 낮추어 배양하면서 1시간 간격으로 효소활성을 측정하여 최적 배양시간을 결정하였다. 배양이 완료된 대장균 세포는 원심분리하여 회수하고, lysis buffer(20 mM NaH₂PO₄, 0.
재조합 대장균을 LB 액체배지에 접종하고 37℃에서 배양하면서 600 nm에서 흡광도 값이 0.4-0.6에 도달하면, IPTG를 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하여 발현을 유도(induction)하였다. 이후 배양온도를 15℃로 낮추어 배양하면서 1시간 간격으로 효소활성을 측정하여 최적 배양시간을 결정하였다.
효소반응에 의한 가수분해산물의 분석은 thin layer chromatography(TLC)를 이용하였다. Silica gel K5F TLC plate(Whatman, Kent, UK)에 1 µL의 효소반응액을 spotting하고, isopropyl alcohol, ethyl acetate, 물을 각각 3:1:1의 부피비로 혼합한 전개용매를 이용하여 시료를 분리하였다.
효소활성과 함께 전분 및 올리고당 등의 기질에 대한 가수분해 특성을 규명하고자 TLC 분석을 실시하였다(Fig. 4). AMY2-A42P는 soluble starch와 올리고당을 분해하여 주로 maltose를 생성하였으며, 소량의 glucose와 maltotriose를 생성하였다.

대상 데이터

Louis, MO, USA)와 Duchefa Biochemie Co.(Haarlem, Netherlands)로부터 구입하여 사용하였다. 유전자 조작을 위한 제한효소는 Takara Biomedical Inc.
(Tokyo, Japan)와 Showa Chemical Co.(Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 단백질 정량분석은 BCA™ Protein assay kit(Pierce Biotechnology Inc.
1)Insoluble blue starch (Amersham Biosciences), corn starch and potato starch (Junsei Chemical), soluble starch I (Showa Chemical), and soluble starch II (Sigma-Aldrich) were used.
1에서와 같이 pETAMY2 플라스미드 주형과 degenerate mutagenic primer(α2A42X-N과 α2A42X-C)를 이용하여 AMY2 유전자의 Ala-42 위치에 해당하는 GCG codon을 NNN으로 치환하였다. 이러한 saturation mutagenesis에 의해 20종의 서로 다른 아미노산 잔기가 임의로 치환된 유전자를 얻었으며, 이를 대장균에 형질전환하여 총 370개의 재조합체를 얻었다.
효소는 proof-reading 활성을 가지는 Pyrobest™ DNA polymerase(Takara)를 사용하였으며, PCR 기기는 C-1000™ Thermal cycler(Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA)를 사용하였다.

이론/모형

AMY2의 42번째 alanine 잔기를 다른 종류의 아미노산으로 치환하기 위하여 saturation mutagenesis 방법(20)을 이용하였다. 보리 AMY2 유전자를 포함하는 pETAMY2 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하였으며, 돌연변이 도입을 위한 mutagenic primer로 α2A42X-N(5'-CTGGCTCCCTCCGNNNTCGCAGTCCGTCG-3')과 α2A42X-C(5'-CGACGGACTGCGANNNCGGAGGGAGCCAG-3')를 첨가한 후 PCR을 통해 증폭하였다.
Amylase의 효소활성은 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)를 이용한 환원당 정량법(21)으로 측정하였다. 미리 준비한 1% 기질용액 50 µL에 적절히 희석한 효소액 50 µL를 섞고 최적온도(37℃)에서 10분간 반응한 후, 300 mL의 DNS용액을 가하여 반응을 종료시켰다.
IBS에 대한 효소활성은 Matsui 등(9)의 방법에 따라 측정하였다. 최적 반응용액(20 mM sodium acetate, 5 mM calcium chloride, pH 5.
Relative activity of AMYs was compared on insoluble blue starch with increase of CaCl₂ concentration. The calcium ion concentration at X-axis is demonstrated by using the logarithmic scale. ▲, AMY1; ●, AMY2; ○, AMY2-A42P.

성능/효과

2)Specific activity on each starch substrate, except IBS, was determined by DNS reducing sugar assay. One unit is defined as the amount of enzyme that gives an increase in A₅₅₀ of 1 for 1 min.
정제된 AMY2 및 AMY2-A42P 효소의 soluble starch I 분해활성과 단백질 농도를 측정하여 AMY1과 비교한 결과, Table 1에서 보는 바와 같이 AMY2-A42P의 specific activity는 AMY2에 비해 약 20% 낮았으나, 효소단백질의 생산성 및 정제과정에서의 회수율 증가로 인해 재조합 효소의 이용도가 향상된 것을 알 수 있었다. 가장 발현도가 높은 AMY1와 비교하면, AMY2의 specific activity는 1.7배 높지만, 효소생산성(productivity)은 약 10%에 불과하였다. 반면에 AMY2-A42P의 specific activity는 AMY1에 비해 약 1.
기존 AMY2의 경우 그 발현량이 매우 낮아 정제 후 회수율이 5% 미만이었으나, A42P mutant의 경우는 돌연변이의 도입으로 대장균 배양액 당 발현량이 2배 증가하였으며, 그로 인해 효소정제 과정에서의 회수율은 4배 정도 향상되었다(Table 1). 결과적으로 약 45 kDa의 AMY2-A42P 효소가 성공적으로 발현되고 정제됨을 확인하였다(Fig. 3). 정제된 AMY2 및 AMY2-A42P 효소의 soluble starch I 분해활성과 단백질 농도를 측정하여 AMY1과 비교한 결과, Table 1에서 보는 바와 같이 AMY2-A42P의 specific activity는 AMY2에 비해 약 20% 낮았으나, 효소단백질의 생산성 및 정제과정에서의 회수율 증가로 인해 재조합 효소의 이용도가 향상된 것을 알 수 있었다.
Insoluble blue starch 기질은 전분에 청색의 발색단을 인위적으로 결합시킨 인공기질로서 이미 Yuk 등(16)의 연구에서도 일반 전분기질과 비교할 때, 분해활성에 있어 다소의 차이를 보였다. 결론적으로 AMY2의 42번째 alanine 잔기를 AMY1과 같이 proline으로 치환할 경우, 그 영향으로 인해 AMY2의 기질특이성이 AMY1과 유사한 방향으로 변화됨을 알 수 있으며, 그 차이가 크지 않은 이유는 치환되지 않은 다른 아미노산 잔기들의 영향에 의한 것으로 판단하였다.
결론적으로 지금까지의 보리 α-amylase 연구는 효모를 이용한 발현 연구가 주를 이루었고, 대장균에서의 발현은 제한적이었으며, 발현 수준도 높지 않았다.
따라서 AMY2-A42P 효소는 전반적으로 AMY1과 AMY2의 중간적 기질 특이성을 가지는 것으로 판단하였다. 그러나 IBS 분해활성의 경우, AMY1이 오히려 AMY2에 비해 높은 활성을 가지는 것으로 알려졌으나, AMY2-A42P 효소의 경우 AMY1, AMY2에 비해 각각 31%와 94% 향상된 가수분해 활성을 나타냈다. Insoluble blue starch 기질은 전분에 청색의 발색단을 인위적으로 결합시킨 인공기질로서 이미 Yuk 등(16)의 연구에서도 일반 전분기질과 비교할 때, 분해활성에 있어 다소의 차이를 보였다.
2). 그러나, AMY2-A42P의 경우 대장균 배양액 기준으로 20.9 unit/mL 수준까지 효소활성이 증가하여 12.7 unit/mL인 AMY2 wild-type에 비해 약 1.65배 향상되었으며, 이는 clone 선별과정의 iodine에 의한 환 크기 비교 결과와 유사하였다.
보다 정확한 발현도 측정 및 효소특성 규명을 위하여 재조합 대장균 1 L를 배양한 후, Ni-NTA column chromatography를 이용하여 AMY2-A42P 효소를 정제하였다. 기존 AMY2의 경우 그 발현량이 매우 낮아 정제 후 회수율이 5% 미만이었으나, A42P mutant의 경우는 돌연변이의 도입으로 대장균 배양액 당 발현량이 2배 증가하였으며, 그로 인해 효소정제 과정에서의 회수율은 4배 정도 향상되었다(Table 1). 결과적으로 약 45 kDa의 AMY2-A42P 효소가 성공적으로 발현되고 정제됨을 확인하였다(Fig.
AMY2-A42P는 soluble starch와 올리고당을 분해하여 주로 maltose를 생성하였으며, 소량의 glucose와 maltotriose를 생성하였다. 다만 maltose는 거의 분해하지 못하며, maltotriose에 대한 가수분해활성 또한 매우 낮으므로 중합도가 높은 올리고당에 높은 활성을 보이는 전형적인 endo 형태의 가수분해 특성을 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 효모에서 발현된 AMY1 및 AMY2의 가수분해 특성(16)과 일치하였다.
AMY2-A42P의 경우, 대부분의 전분 기질에 대하여 AMY2 대비 9-46% 감소한 활성을 보였으나, AMY1과 비교하면 38-78% 정도 가수분해활성이 높은 것으로 나타났다. 따라서 AMY2-A42P 효소는 전반적으로 AMY1과 AMY2의 중간적 기질 특이성을 가지는 것으로 판단하였다. 그러나 IBS 분해활성의 경우, AMY1이 오히려 AMY2에 비해 높은 활성을 가지는 것으로 알려졌으나, AMY2-A42P 효소의 경우 AMY1, AMY2에 비해 각각 31%와 94% 향상된 가수분해 활성을 나타냈다.
7배 높지만, 효소생산성(productivity)은 약 10%에 불과하였다. 반면에 AMY2-A42P의 specific activity는 AMY1에 비해 약 1.4배 높았고, 단백질 발현량은 AMY2에 비해 2배 향상되었다.
선행연구 결과에 의하면 AMY1은 약 5 mM 또는 그 이하의 calcium 농도 하에서 최대 활성을 보이고, AMY2의 경우는 20 mM에서 가장 높은 활성을 나타내는 것으로 알려졌다(16). 본 연구에서 AMY2-A42P의 경우, 20 mM의 calcium 농도에서 가장 높은 활성을 보였으며, AMY2와 매우 유사한 calcium 의존도를 나타냈다(Fig. 5).
1 mM의 IPTG를 함유한 고체배지에서 대장균을 배양한 후, iodine에 의해 형성되는 투명한 환의 크기와 강도를 대조군과 비교하여 활성이 증가한 8개의 clone을 선발하였다. 선발된 clone들이 형성한 환의 크기는 정확히 일치하지 않았으나, 모두 AMY1 보다는 작고 AMY2에 비해서는 커진 것을 확인하였다. 활성이 향상된 8종의 clone으로부터 플라스미드를 분리하여 염기서열을 확인한 결과, 돌연변이 부위의 염기서열이 CCG(2개), CCC(3개), CCT(2개), CCA(1개)로 각각 치환된 것을 알 수 있었다.
활성이 향상된 8종의 clone으로부터 플라스미드를 분리하여 염기서열을 확인한 결과, 돌연변이 부위의 염기서열이 CCG(2개), CCC(3개), CCT(2개), CCA(1개)로 각각 치환된 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 돌연변이에 의해 목적 codon이 proline 잔기로 치환된 경우에만 전분 분해활성이 증가함을 의미하며, 동일한 위치에 다른 아미노산이 치환된 mutant들의 경우에는 오히려 효소의 발현이나 활성이 크게 감소함을 유전자 분석을 통해 확인하였다. 이론적으로 총 370개의 clone 중에서 64종의 서로 다른 codon으로 치환될 빈도수는 codon 당 약 6회에 해당하며, 본 연구에서 선발된 8종의 A42P mutant들이 서로 다른 염기서열의 codon을 가지는 것으로 볼 때, saturation mutagenesis에 의해 돌연변이가 특정 codon에 편중되지 않고 적절히 도입된 것으로 판단하였다.
이러한 결과는 돌연변이에 의해 목적 codon이 proline 잔기로 치환된 경우에만 전분 분해활성이 증가함을 의미하며, 동일한 위치에 다른 아미노산이 치환된 mutant들의 경우에는 오히려 효소의 발현이나 활성이 크게 감소함을 유전자 분석을 통해 확인하였다. 이론적으로 총 370개의 clone 중에서 64종의 서로 다른 codon으로 치환될 빈도수는 codon 당 약 6회에 해당하며, 본 연구에서 선발된 8종의 A42P mutant들이 서로 다른 염기서열의 codon을 가지는 것으로 볼 때, saturation mutagenesis에 의해 돌연변이가 특정 codon에 편중되지 않고 적절히 도입된 것으로 판단하였다.
재조합 플라스미드인 pETAMY2와 pETAMY2-A42P에 포함된 AMY2와 AMY2-A42P 유전자(42번째 proline의 codon이 CCG로 치환)는 각각 발현벡터인 pET-21a(Novagen, Darmstadt, Germany)의 T7 RNA polymerase promoter에 의해 발현이 조절되며, 효율적인 효소정제를 위하여 C-말단에 6개의 histidine 잔기가 결합된 형태로 발현되어 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) column chromatography에 의해 쉽게 정제 가능하다. 이미 재료 및 방법에 서술한 바와 같이 0.1 mM의 IPTG로 induction한 후, 15℃에서 배양하여 효소를 생산하였으며, 배양 후 13-14시간이 경과할 때 최대의 효소생산량을 나타냈고, 이후 활성이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2). 그러나, AMY2-A42P의 경우 대장균 배양액 기준으로 20.
비록 약간의 차이는 있으나, 전체적으로 AMY2와 유사한 수준의 pH 안정성을 나타내었다. 이상의 결과를 토대로, 42번째 alanine의 proline으로의 치환은 AMY2의 특성을 크게 변화시키지 않았으며, 효소의 발현도를 증가시키는 효과를 보이는 것으로 결론지었다.
3). 정제된 AMY2 및 AMY2-A42P 효소의 soluble starch I 분해활성과 단백질 농도를 측정하여 AMY1과 비교한 결과, Table 1에서 보는 바와 같이 AMY2-A42P의 specific activity는 AMY2에 비해 약 20% 낮았으나, 효소단백질의 생산성 및 정제과정에서의 회수율 증가로 인해 재조합 효소의 이용도가 향상된 것을 알 수 있었다. 가장 발현도가 높은 AMY1와 비교하면, AMY2의 specific activity는 1.
선발된 clone들이 형성한 환의 크기는 정확히 일치하지 않았으나, 모두 AMY1 보다는 작고 AMY2에 비해서는 커진 것을 확인하였다. 활성이 향상된 8종의 clone으로부터 플라스미드를 분리하여 염기서열을 확인한 결과, 돌연변이 부위의 염기서열이 CCG(2개), CCC(3개), CCT(2개), CCA(1개)로 각각 치환된 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 돌연변이에 의해 목적 codon이 proline 잔기로 치환된 경우에만 전분 분해활성이 증가함을 의미하며, 동일한 위치에 다른 아미노산이 치환된 mutant들의 경우에는 오히려 효소의 발현이나 활성이 크게 감소함을 유전자 분석을 통해 확인하였다.

후속연구

기존 연구는 효모인 Pichia 균주에서 signal peptide 서열에 의해 세포 외로 분비되는 AMY2 효소의 양이 증가하는 것을 확인하였으나, 세포 내에서의 발현도 증가에 대한 직접적인 결과를 제시하지 않았고, 또한 효모의 발현기작이 대장균과 전혀 다르므로 동일한 해석을 적용하기에는 어려움이 있었다. 그러나 본 연구를 통해서 효모에서의 생산성 증가 효과가 대장균에서도 유사하게 적용될 수 있음을 확인하였고, 특히 다양한 아미노산 잔기 중에서 proline의 치환에 의해서만 가시적인 발현 증가효과가 나타남을 명확하게 규명함으로써 향후 보리 α-amylase의 구조와 발현의 상관관계 연구를 통한 보다 효율적인 효소생산 시스템을 개발하는데 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
특히 아미노산 서열 및 3차 구조의 높은 유사성과 달리 매우 상이한 효소적 특성을 나타내는 이들 AMY1과 AMY2 효소는 전형적인 α-amylase의 구조와 기능의 상관관계를 규명할 수 있는 모델시스템으로 그 활용가치가 높을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	α-Amylase란 무엇인가?	1.1)는 전분, 글리코겐 등 고분자 탄수화물 중합체 내부의 α-(1,4) 결합을 endo 형태로 가수분해하여 glucose, maltose를 포함하는 올리고당을 생성하는 효소이다(1,2). 이들 효소는 동물, 식물, 미생물 등 자연계에 폭 넓게 분포하며, 산업적으로 전분을 이용한 효소적 액화공정 등에 널리 이용된다(3).
	α-Amylase는 어느 곳에 분포하고 어디에 이용되는가?	1)는 전분, 글리코겐 등 고분자 탄수화물 중합체 내부의 α-(1,4) 결합을 endo 형태로 가수분해하여 glucose, maltose를 포함하는 올리고당을 생성하는 효소이다(1,2). 이들 효소는 동물, 식물, 미생물 등 자연계에 폭 넓게 분포하며, 산업적으로 전분을 이용한 효소적 액화공정 등에 널리 이용된다(3). 특히 식물체에서 발아과정 중 이들 효소의 발현 정도에 따라 다양한 생리적 변화가 유발되는 것으로 알려졌다(4).
	보리에서 발견된 서로 다른 α-amylase isozyme은 각각 무엇인가?	쌀과 함께 대표적인 곡물의 하나인 보리에서 두 종류의 서로 다른 α-amylase isozyme AMY1과 AMY2가 발견되었으며(5,6), 이들 효소의 특성에 대한 다양한 비교 연구가 이루어졌다. 각각 414개와 403개의 아미노산 잔기로 구성된 AMY1과 AMY2 효소는 약 80%의 높은 아미노산 서열 상동성을 가짐에도 불구하고, 등전점(pI), 효소활성, pH 안정성 등의 물리화학적 특성은 서로 크게 달라 많은 연구자들의 관심이 집중되었다.

참고문헌 (23)

Davies G, Henrissat B. Structure and mechanism of glycosyl hydrolases. Structure 3: 853-859 (1995)

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Matsuura Y, Kusuniki M, Harada W, Kakudo M. Structure and possible catalytic residues of Taka-amylase A. J. Biochem. 95: 697-702 (1984)
Yamamoto T. Enzyme Chemistry and Molecular Biology of Amylase and Related Enzymes. Amylase Research Society of Japan. CRC Press Inc., Boca Raton, FL, USA. pp. 1-224 (1995)
Jones RL, Jacobsen JV. Regulation of synthesis and transport of secreted proteins in cereal aleuron. Int. Rev. Cytol. 126: 49-88 (1991)
Rogers JC, Milliman C. Isolation and sequence analysis of a barley $\alpha$ -amylase cDNA clone. J. Biol. Chem. 258: 8169-8174 (1983)
Knox CAP, Sonthayanon B, Chandra GR, Muthukrishnan S. Structure and organization of two divergent $\alpha$ -amylase genes from barley. Plant Mol. Biol. 9: 3-17 (1987)

상세보기
Bush DS, Sticher L, Van Huystee R, Wagner D, Jones RL. The calcium requirement for stability and enzymatic activity of two isoforms of barley aleuron $\alpha$ -amylase. J. Biol. Chem. 264: 19392-19398 (1989)
Rodenburg KW, Juge N, Guo XJ, Søgaard M, Chaix JC, Svensson B. Domain B protruding at the third $\beta$ strand of the $\alpha$ / $\beta$ barrel in barley $\alpha$ -amylase confers distinct isozyme-specific properties. Eur. J. Biochem. 221: 277-284 (1994)

상세보기
Matsui I, Svensson B. Improved activity and modulated action pattern obtained by random mutagenesis at the fourth $\beta$ - $\alpha$ loop involved in substrate binding to the catalytic $(\beta/\alpha)_{8}$ -barrel domain of barley $\alpha$ -amylase 1. J. Biol. Chem. 272: 22456-22463 (1997)

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Mori H, Bak-Jensen KS, Svensson B. Barley $\alpha$ -amylase Met53 situated at the high-affinity subsite -2 belongs to a substrate binding motif in the ${\beta}{\rightarrow}{\alpha}$ loop 2 of the catalytic $({\beta}/{\alpha})_{8}$ -barrel and is critical for activity and substrate specificity. Eur. J. Biochem. 269: 5377-5390 (2002)

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Bak-Jensen KS, Andre G, Gottschalk TE, Paes G, Tran V, Svensson B. Tyrosine 105 and threonine 212 at outermost substrate binding subsites -6 and +4 control substrate specificity, oligosaccharide cleavage patterns, and multiple binding modes of barley $\alpha$ -amylase 1. J. Biol. Chem. 279: 10093-10102 (2004)

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Juge N, Svensson B, Williamson G. Secretion, purification, and characterisation of barley $\alpha$ -amylase produced by heterologous gene expression in Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biotech. 49: 385-392 (1998)

상세보기
Sogaard M, Svensson B. Expression of cDNAs encoding barley $\alpha$ -amylase 1 and 2 in yeast and characterization of the secreted proteins. Gene 94: 173-179 (1990)

상세보기
Wong DWS, Batt SB, Robertson GH. Characterization of active barley $\alpha$ -amylase 1 expressed and secreted by Saccharomyces cerevisiae. J. Protein Chem. 20: 619-623 (2001)

상세보기
Juge N, Andersen JS, Tull D, Roepstorff P, Svensson B. Overexpression, purification, and characterization of recombinant barley $\alpha$ -amylases 1 and 2 secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Exprs. Purif. 8: 204-214 (1996)

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Yuk JB, Choi SH, Lee TH, Jang MU, Park JM, Yi AR, Svensson B, Kim TJ. Effect of calcium ion concentration on starch hydrolysis of barley $\alpha$ -amylase isozymes. J. Microbiol. Biotechnol. 18: 730-734 (2008)

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Tibbot BK, Wong DWS, Robertson GH. A functional raw starchbinding domain of barley $\alpha$ -amylase expressed in Escherichia coli. J. Protein Chem. 19: 663-669 (2000)

상세보기
Lee CC, Wong DWS, Robertson GH. An E. coli expression system for the extracellular secretion of barley $\alpha$ -amylase. J. Protein Chem. 20: 233-237 (2001)

상세보기
Fukuda K, Jensen MH, Haser R, Aghajari N, Svensson B. Biased mutagenesis in the N-terminal region by degenerate oligonucleotide gene shuffling enhances secretory expression of barley $\alpha$ -amylase 2 in yeast. Protein Eng. Des. Sel. 18: 515-526 (2005)

상세보기
Chiang LW, Kovari I, Howe MM. Mutagenic oligonucleotidedirected PCR amplification (Mod-PCR): An efficient method for generating random base substitution mutations in a DNA sequence element. PCR Meth. Appl. 2: 210-217 (1993)

상세보기
Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428 (1959)

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Robert X, Haser R, Gottschalk TE, Ratajczak F, Driguez H, Svensson B, Aghajari N. The structure of barley $\alpha$ -amylase isozyme 1 reveals a novel role of domain C in substrate recognition and binding: A pair of sugar tongs. Structure 11: 973-984 (2003)

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Vallee F, Kadziola A, Bourne Y, Juy M, Rodenburg KW, Haser R, Svensson B. Barley $\alpha$ -amylase bound to its endogenous protein inhibitor BASI: Crystal structure of the complex at 1.9 $\AA$ resolution. Structure 6: 649-659 (1998)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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