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문제 정의
- 본 연구는 마황, 상륙 및 저령 3종 생약을 대상으로 HPLC-UV를 이용하여 지표성분의 분석법을 확립하였으며, 확립된 분석법을 이용해 생약의 표준화된 추출물을 확보하고 실온과 냉장의 보관조건에서 지표성분의 변화를 확인함으로써 독성시험에 사용하는 생약 추출물의 안정성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 3종의 생약의 열수 추출물을 동결 건조한 분말의 안정성 실험을 위해 시료를 실온과 냉장에 6개월 보관하면서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월에 각각의 시료를 설정된 HPLC 조건에서 분석하였다. 각각의 시료는 일정 양씩 3개의 EP-tube에 취하고 60분간 sonication 후 membrane filter로 여과한 후 HPLC로 분석하였다.
- CH2Cl2 분획물을 silica gel column chromatography와 CH2Cl2-MeOH(30 : 1 → 0 : 1)의 용매를 사용하여 11개의 분획으로 나누었고, 8번 분획을 silica gel column chromatography와 CH2Cl2-MeOH (10 : 1 → 5 : 1) 용매를 사용하여 pseudoephedrine (64.0 mg) 및 ephedrine (84.3 mg)을 분리하였다.
- 3종의 생약의 열수 추출물을 동결 건조한 분말의 안정성 실험을 위해 시료를 실온과 냉장에 6개월 보관하면서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월에 각각의 시료를 설정된 HPLC 조건에서 분석하였다. 각각의 시료는 일정 양씩 3개의 EP-tube에 취하고 60분간 sonication 후 membrane filter로 여과한 후 HPLC로 분석하였다.
- 문헌 등의 자료 및 HPLC 분석 자료를 토대로 지표물질을 선정하였고, Table I과 같은 조건으로 분석하였다. 각각의 지표성분은 검량선을 작성하여 생약 추출물의 함량을 평가하였다.
- 29 ppm에서 broad singlet signal들이 관찰되었다. 또한 13C-NMR spectrum은 193.3 ppm에서 aldehyde carbon, 153.8, 146.8, 131.2, 119.6, 116.4, 114.9 ppm에서 aromatic ring carbon이 관찰되어 3,4-dihydroxybenzaldehyde로 구조 동정하고 저령의 HPLC 분석의 표준물질로 사용하였다.18)
- 마황, 상륙 및 저령의 생약추출물에 대한 안정성 자료를 얻고자, 각각의 추출물을 실온과 냉장에 보관하고 6개월간 일정 기간 간격 (1, 2, 3, 4, 5, 6개월)으로 육안 관찰하고 유효성분 함량평가를 수행하였다. 육안 관찰에서는 실온과 냉장 장기보관시험 조건에서 색 등의 변화가 관찰되지 않았고, 6개월 장기보관에 따른 고체 상태로 굳어지는 현상도 없었다.
- OH를 가해 pH 9로 액성을 알칼리로 하였다. 물 층을 CH2Cl2로 용매 분획하였고 CH2Cl2 분획물을 silica gel column chromatography를 반복실시하여 2종의 화합물을 분리하였다. 2종의 화합물은 1H-NMR과 13C-NMR spectroscopic data와 mp 등으로 pseudoephedrine과 ephedrine임을 확인할 수 있었고 이들의 NMR data는 문헌에 보고된 data와 일치하였다.
- 저령의 주요성분으로 알려진 ergosterol계 화합물은 HPLC-UV, HPLC-ELSD 분석으로 분석에 어려움이 있어, 저령의 물 추출물의 HPLC 분석을 위해 추출물 중 UV 흡수가 있는 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물의 구조분석은 1H-NMR spectrum의 9.
- 각각의 성분은 HPLC-UV 및 ELSD detector와 RP C-18 column으로 분석이 가능하였다. 추출생약재의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 실온과 냉장고에 보관하였고, 실험기간은 각각 6개월간 HPLC로 분석하여 각각의 peak의 pattern과 함량으로 3종 생약의 안정성을 확인하였다. 이러한 생약 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 유통과정의 효율적 품질관리 개선에도 활용이 가능하다고 기대된다.
대상 데이터
- HPLC system은 Gilson사의 306 pump, 811C dynamic mixer, UV/VIS-156 detector, 231 XL sample injector 및 GILSON UniPoint data를 사용하였으며 column은 Agilent Technologies사의 Agilent Eclipse XD8-C18 (5 µm, 4.6 × 150 mm)를 사용하였다.
- HPLC 용매는 Burdick & Jackson사의 MeOH 및 acetonitrile을 사용하였고, H2O는 Milli-Q로 처리한 물을 사용하였다.
- ephedrine과 pseudoephedrine은 마황(Ephedrae Herba)에서 3,4-dihydroxybenzaldehyde는 저령(Polyporus)에서 분리하여 사용하였고, phytolaccoside B, phytolaccoside E 및 phytolaccoside I는 상륙 (Phytolaccae Radix)에서 분리한 화합물을 서울대학교 강삼식 교수님에게 제공받아 사용하였다. HPLC system은 Gilson사의 306 pump, 811C dynamic mixer, UV/VIS-156 detector, 231 XL sample injector 및 GILSON UniPoint data를 사용하였으며 column은 Agilent Technologies사의 Agilent Eclipse XD8-C18 (5 µm, 4.
- 생약 추출물 100 mg에 70% MeOH 10 mL를 가하여 HPLC분석용 시료로 사용하였다. pseudoephedrine, ephedrine, phytolaccoside B, phytolaccoside E, phytolaccoside I 및 3,4-dihydroxybenzaldehyde 각각 70% MeOH로 1 mg/mL 농도로 녹여 표준액으로 사용하였다. 분석용 표준액과 검액은 membrane filter로 여과한 후 사용하였다.
- 문헌 등의 자료 및 HPLC 분석 자료를 토대로 지표물질을 선정하였고, Table I과 같은 조건으로 분석하였다. 각각의 지표성분은 검량선을 작성하여 생약 추출물의 함량을 평가하였다.
- 본 연구에 사용한 3종의 생약, 마황, 상륙 및 저령은 유통되는 생약을 기원별, 산지별로 구입하여 기원, 성상, 색상, 냄새 등을 기준으로 생약감별 자문위원회 (한국 생명공학연구원, 이형규 박사; 충남대학교, 김영호 교수; 한국화학연구원, 유시용 박사; 충남대학교, 배기환 교수; 대구 가톨릭대학교, 민병선 교수)의 감별을 거쳐 선별하였고 선정된 시료는 대구가톨릭대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다 (마황, CUD-3172-1; 상륙, CUD-1289-1; 저령, CUD-3173-1). 마황 (Ephedrae Herba), 상륙 (Phytolaccae Radix) 및 저령 (Polyporus) 모두 중국산을 사용하였다.
- 저령 (Polyporus) 1 kg을 H2O로 4시간 동안 3회 반복하여 열탕 추출하고 여과한 후 동결 건조하여 40 g의 물 추출물을 얻었다. 물 추출물을 물에 녹여 HPLC (C18 column; 150 × 4.
- 생약재의 독성실험을 위한 추출물은 식약청고시 2003-17, 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였다. 추출물의 함량분석을 위해 마황의 지표성분은 pseudoephedrine 및 ephedrine으로, 상륙의 지표성분은 phytolaccoside B, phytolaccoside E 및 phytolaccoside I로 저령은 3,4-dihydroxybenzaldehyde을 지표물질로 선정하였다. 각각의 성분은 HPLC-UV 및 ELSD detector와 RP C-18 column으로 분석이 가능하였다.
이론/모형
- 마황 (Ephedrae Herba), 상륙 (Phytolaccae Radix) 및 저령 (Polyporus) 모두 중국산을 사용하였다. 각 생약은 식품의약품안전청 고시 2003-17, 안전성 유효성심사규정에 준한 표준탕제 제조법에 따라 열수추출하고 이를 농축한 후 동결 건조하여 사용하였다.15)
- 생약재의 독성실험을 위한 추출물은 식약청고시 2003-17, 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였다. 추출물의 함량분석을 위해 마황의 지표성분은 pseudoephedrine 및 ephedrine으로, 상륙의 지표성분은 phytolaccoside B, phytolaccoside E 및 phytolaccoside I로 저령은 3,4-dihydroxybenzaldehyde을 지표물질로 선정하였다.
성능/효과
- 1) 본 연구에서는 3종의 생약에 대표적인 생리활성을 보이며 주성분인 마황 (Ephedrae Herba)에서는 ephedrien과 pseudoephedrine을 지표성분으로, 상륙 (Phytolaccaea Radix)은 phytolaccoside B, phytolaccoside E 및 phytolaccoside I을 지표성분으로 각각 설정하였다 (Fig. 1). 그리고 저령의 주요성분은 ergosterol계 화합물로 알려져 있으나14) 이들 sterol 화합물은 HPLC로 분석에 어려움이 있어 저령에서 3,4-dihydroxybenzaldehyde을 분리하여 표준품으로 사용하였다.
- 물 층을 CH2Cl2로 용매 분획하였고 CH2Cl2 분획물을 silica gel column chromatography를 반복실시하여 2종의 화합물을 분리하였다. 2종의 화합물은 1H-NMR과 13C-NMR spectroscopic data와 mp 등으로 pseudoephedrine과 ephedrine임을 확인할 수 있었고 이들의 NMR data는 문헌에 보고된 data와 일치하였다.16-17)
- 저령 (polyporus)의 추출물 HPLC 분석 결과 3,4-dihydroxybenzaldehyde가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 저령의 주요성분으로 알려진 ergosterol계통의 화합물은 chromophore가 없어 HPLC에서 확인되지 않았다. 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 3,4-dihydroxybenzaldehyde의 함량에 약간 변화가 있으나 HPLC chromatography상 불순물로 검출되는 피크가 없어 저령의 열수 추출물은 안정성이 확인할 수 있었다.
- 상륙 (Phytolaccae Radix)의 추출물 HPLC 분석 결과 phytolaccoside B, phytolaccoside E 및 phytolaccoside I가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 3가지 성분 중 phytolaccodie I가 주요성분으로 확인 되었으며 phytolaccodie B의 함유량이 제일 적은 것으로 확인되었다. 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 chromatogram과 차이가 없으며 성분 함량도 일정하여 상륙의 열수 추출물은 안정성이 확인되었다. 저령 (polyporus)의 추출물 HPLC 분석 결과 3,4-dihydroxybenzaldehyde가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 저령의 주요성분으로 알려진 ergosterol계통의 화합물은 chromophore가 없어 HPLC에서 확인되지 않았다.
- 19) 그러나 마황의 분석에서 주로 pseudoephedrine 및 ephedrine이 검출되었고 다른 성분은 상기의 HPLC 분석조건에서 농도가 높게 검출되지 않아 2가지 성분이 마황의 주요 alkaloid 임을 확인하였다. 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 함량에는 차이가 없어 마황의 열수 추출물은 안정함을 확인할 수 있었다. 상륙 (Phytolaccae Radix)의 추출물 HPLC 분석 결과 phytolaccoside B, phytolaccoside E 및 phytolaccoside I가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 3가지 성분 중 phytolaccodie I가 주요성분으로 확인 되었으며 phytolaccodie B의 함유량이 제일 적은 것으로 확인되었다.
- 그러나 마황의 ephedrine과 pseudoephedrine의 resolution은 2이상으로 완전히 분리되지 않았으나 함량계산에는 어려움이 없었다. 상기의 분석 조건으로 각 지표성분의 검량선을 작성한 결과 r2이 0.995 이상으로 높은 직선성이 확인되었다 (Table II).
- 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 함량에는 차이가 없어 마황의 열수 추출물은 안정함을 확인할 수 있었다. 상륙 (Phytolaccae Radix)의 추출물 HPLC 분석 결과 phytolaccoside B, phytolaccoside E 및 phytolaccoside I가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 3가지 성분 중 phytolaccodie I가 주요성분으로 확인 되었으며 phytolaccodie B의 함유량이 제일 적은 것으로 확인되었다. 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 chromatogram과 차이가 없으며 성분 함량도 일정하여 상륙의 열수 추출물은 안정성이 확인되었다.
- 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 chromatogram과 차이가 없으며 성분 함량도 일정하여 상륙의 열수 추출물은 안정성이 확인되었다. 저령 (polyporus)의 추출물 HPLC 분석 결과 3,4-dihydroxybenzaldehyde가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 저령의 주요성분으로 알려진 ergosterol계통의 화합물은 chromophore가 없어 HPLC에서 확인되지 않았다. 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 3,4-dihydroxybenzaldehyde의 함량에 약간 변화가 있으나 HPLC chromatography상 불순물로 검출되는 피크가 없어 저령의 열수 추출물은 안정성이 확인할 수 있었다.
- 지표성분의 함량은 Fig. 2와 Table III과 같으며 마황(Ephedrae Herba)의 열수 추출물 HPLC 분석 결과 pseudoephedrine 및 ephedrine이 분석조건에서 검출되었고, 2가지 성분 중 ephedrine이 주성분으로 확인 되었다. 대한약전에서 마황의 ephedrine의 함량은 0.
후속연구
- 추출생약재의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 실온과 냉장고에 보관하였고, 실험기간은 각각 6개월간 HPLC로 분석하여 각각의 peak의 pattern과 함량으로 3종 생약의 안정성을 확인하였다. 이러한 생약 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 유통과정의 효율적 품질관리 개선에도 활용이 가능하다고 기대된다.
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