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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 한약재로 사용되는 마황에 대한 안전성을 평가하기 위하여, 식품의약품안전청고시 제2005-60호 의약품등의 독성시험기준에 준하여'), 흰쥐에 경구로 단회 투여하여 급성독성을 평가하였다.
가설 설정
- a) Values are expressed as dead number/total number of animals.
제안 방법
- 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별카드 표시법으로 실시하였다. 본 시험물질은 한약재로서 식품의약품안전청의 ”의약품 등의 독성시험기주, 에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Line'"과 Principles and Methods of Toxicology4 * * * * * * 11) 을 참조하여 예비실혐 결과와 시험물질의 용해도 등을 코려하여 고용량군(5,000 ㎎/㎏), 저용량군(2, 500 ㎎/㎏)으로 대조군을 포함하여 모두 3개 군으로 정하였다.
- 우선, 순화 기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 구분시켜 두었다. 그리고 평균체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별카드 표시법으로 실시하였다.
- 등을 측정하였다. 나머지 혈액은 생화학적 측정을위하여 EDTA free tube 에 담아 tabletop centrifuge vs-5000n(Vision scientific/ Korea) 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 aspartate aminotransferase(AST)/ alanine aminotransferase(ALT), total cholesterol 수치를 즉정하였다.
- 한다. 본 연구에서는 단회 투여 독성시험이 기본 사항이외에 추가적으로 체중, 사료섭취량, 혈액학적검사 및 혈액생화학적 검사 항목, 병 리조직학적 검사로서 동물의 장기무게를 측정하여 연구의 근거를 명확하게 제시하였다. 본 연구에 의한 마황의 안전성, 유효성 검사는 차후 이루어질 한약재 및 한방 처방전반에 대한 안전성 및 유효성 검사의 필수 연구 항목의 시험방법으로서 의의가 있으리라 기대된다.
- 사료는 실험동물용 고형사료(Samyang, Korea)를 자유롭게 먹도록 하였으며, 물은 멸균 수도물을 자유롭게 섭취시켰다. 시험자들은 모두 고압증기멸균(121 ℃, 20 min)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다
- 대조군(vehicle control)의 동물에는 증류수만을 투여하였다. 시험물질은 투여 전날 하룻밤을 절식시킨 후 경구투여용 존데(zonde)를 장착한 주사기를 이용하여 조제시험물질을 강제 경구투여 하였다. 시험물질의 투여 경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였다.
- 시험물질을 투여한 후 매 시간마다 6시간 동안, 투여 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩 일정 시간에 투여 동물의 일반상태, 중독증상 및 사망유무를 대조군과 비교 관찰하였다.
- 본 연구에 의한 마황의 안전성, 유효성 검사는 차후 이루어질 한약재 및 한방 처방전반에 대한 안전성 및 유효성 검사의 필수 연구 항목의 시험방법으로서 의의가 있으리라 기대된다. 시험물질인 마황에 대한 경구 급성 독성을 시험하기 위하여 Sprague-Dawley계 흰쥐에 단회 경구 투여한 후 14일간 관찰하였다.
- 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여 당일을 0일로 하여투여 후 매일 2주일간 체중을 측정하였다.
- 시험자들은 모두 고압증기멸균(121 ℃, 20 min)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다
- 실험실 환경에서 1주간 적응시킨 실험동물을 대조군과 마황투여군으로 나누었으며, 각 군은 암, 수 각각 10마리로 하였다. 동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다.
- 동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다. 우선, 순화 기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 구분시켜 두었다. 그리고 평균체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다.
- 시험물질의 투여 경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였다. 투여 당일 오전에 개체별로 단회 투여하였으며 투여량은 투여 당일 측정된 체중을 기준으로 투여액량(10 mL/kg)을 계산하였다.
- 투여 직전에 증류수를 용매로 하여 시험물질을 2, 500, 5, 000 mg/10 mL/kg으로 조제하였다. 대조군(vehicle control)의 동물에는 증류수만을 투여하였다.
- 투여 후 14일째 모든 생존 동물을 ether로 흡입 마취하여 개복 및 복대동맥 절단법으로 방혈 치사시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안적으로 해부소견을 관찰하였다.
- 혈액은 희생 시에 heart puncture방법으로 5 mL을 채취하였고/ 1 mLe ethylene-diamine tetraacetic acid(EDTA) 처리된 blood collection tube(BD vacutainer, USA)에 균등질이 되도록잘 흔들어 4℃ 에 보관해 48시간이내에 complete blood count(CBC) 등을 측정하였다. 나머지 혈액은 생화학적 측정을위하여 EDTA free tube 에 담아 tabletop centrifuge vs-5000n(Vision scientific/ Korea) 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 aspartate aminotransferase(AST)/ alanine aminotransferase(ALT), total cholesterol 수치를 즉정하였다.
대상 데이터
- 사육하였다. 1주일간의 순화사육 기간 동안에 증상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였다.
- 본 연구의 시험물질인 마황(Ephedrae Herba)은 (주)옴니허브 (Seoul, Korea)를 통하여 구입하였다. 麻黃 300 g을 round flask에 넣고 증류수 6, 000 mL를 가한 다음 냉각기를 부착하여 2시간동안가열한 다음 여과지로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan)를 사용하여 감압농축한 후/ 농축액을 동결 건조하여 시험에 사용하였으며? 수율은 15.
- 시험구 역은 경희대학교 한의과대학의 청정 동물실험실에서 실시하였으며, 본 연구에 사용된 동물은 SPF(특정병원체 부재) Sprague-Dawley계의 5주령 된 흰쥐로서 중앙실험동물 (Japan)로부터 분양받아 온도 23 ± 3℃, 습도 55 ± 5%, 배기 10-18 회/h, light/dark 12 h, 조도 150-300 Lux의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육상자(280 W X 420 L X 170 Hmm)에 각각 5마리씩 넣어 사육하였다. 1주일간의 순화사육 기간 동안에 증상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였다.
- 시험물질은 투여 전날 하룻밤을 절식시킨 후 경구투여용 존데(zonde)를 장착한 주사기를 이용하여 조제시험물질을 강제 경구투여 하였다. 시험물질의 투여 경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였다. 투여 당일 오전에 개체별로 단회 투여하였으며 투여량은 투여 당일 측정된 체중을 기준으로 투여액량(10 mL/kg)을 계산하였다.
데이터처리
- 체중의 변화에 대한 통계학적 분석은 one-way analysis of variance test(ANOVA) 검정에 의해 대조군과 시험물질 투여군을 비교하였고/ LD50 치는 Pharmacologic Calculating Sy stem을이용하여 Litchfield-Wilcoxon법에 의하여 95% 신뢰 한계 내에서 결정하였다.
이론/모형
- 그리고 평균체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별카드 표시법으로 실시하였다. 본 시험물질은 한약재로서 식품의약품안전청의 ”의약품 등의 독성시험기주, 에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Line'"과 Principles and Methods of Toxicology4 * * * * * * 11) 을 참조하여 예비실혐 결과와 시험물질의 용해도 등을 코려하여 고용량군(5,000 ㎎/㎏), 저용량군(2, 500 ㎎/㎏)으로 대조군을 포함하여 모두 3개 군으로 정하였다.
성능/효과
- 심장, 폐, 비장, 간, 신장, 고환 및 난소의 절대무게와 상대무게에 대한 장기 중량 측정결과에서 대체로 대조군과 시험물질 투여군간의 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다. 다만, 마황 5,000 ㎎/㎏ 암컷 투여군에서 간의 상대무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p < 0.05, Table 6).
- 또한 모든 동물에서 시험물질 투여 후 자발적인 운동 및 호흡율의 증가 등과 같은 특이할 만한 임상증상은 관찰되지 않았으며 최종 투여일에 실시한 안구검사에서도 특이한 안구부위의 이상소견은 관찰되지 않았다(Table 2).
- 마황 단회 투여 14일 경과 후 대조군과 실험군의 심장, 폐, 비장, 간, 신장, 고환 및 난소의 절대무게와 상대무게를 측정한 결과, 간을 제외한 모든 장기에서 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 5,000 ㎎/㎏ 암컷 투여군에서 체중에 비례한간의 상대 무게가 대조군에 비해 116.
- 마황 단회 투여 14일 경과 후 대조군과 실험군의 혈액 및 혈액생화학적 지표로서 WBC, RBC, HB, HCT, AST, ALT, Total cholesterol 수치를 측정한 결과, 모든 지표 수치에서 시험물질투여에 의한 변화는 인정되지 않았다.
- 마황 단회 투여 후 14일 경과 동안 시험물질 투여에 의한 사망동물은 없었으며, 자발운동 저하, 호흡수 감소, 유루 및 복와위등의 일반증상은 관찰되지 않았다. 관찰 기간 동안 모든 생존동물에 대한 해부병리 소견에서 시험물질의 투여에 기인한다고 사료되는 변화는 관찰되지 않았다.
- 모든 대조군 및 시험물질 투여군에서 육안 소견상 이상이 있는 개체는 관찰되지 않았다(Table 5, 6). 심장, 폐, 비장, 간, 신장, 고환 및 난소의 절대무게와 상대무게에 대한 장기 중량 측정결과에서 대체로 대조군과 시험물질 투여군간의 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다.
- 시험물질을 투여한 후 14일 동안 체중 변화를 관찰하였을 때, 대조군 및 시험물질 투여군에서 시간이 경과함에 따라 모두 체중증가가 관찰되었다. 체중증가율과 식이효율은 수컷 그룹과 암컷 그룹 모두에서 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 3, 4).
- 관찰되지 않았다(Table 5, 6). 심장, 폐, 비장, 간, 신장, 고환 및 난소의 절대무게와 상대무게에 대한 장기 중량 측정결과에서 대체로 대조군과 시험물질 투여군간의 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다. 다만, 마황 5,000 ㎎/㎏ 암컷 투여군에서 간의 상대무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p < 0.
- 이상과 같이 마황에 대한 단회 투여 독성 시험에서 체중, 일반증상, 사료섭취량, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 육안적 소견, 병리조직학적 검사 등에서 특이한 독성병변은 관찰되지 않았다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 시험물질인 마황은 경구투여시 암수 흰쥐에서 급성독성을 나타내지 않았고, LD50값은 암수흰쥐에서 경구 투여 최51욜량인 5,000 ㎎/㎏ 이상으로 사료된다.
- 않았다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 시험물질인 마황은 경구투여시 암수 흰쥐에서 급성독성을 나타내지 않았고, LD50값은 암수흰쥐에서 경구 투여 최51욜량인 5,000 ㎎/㎏ 이상으로 사료된다.
- 관찰되었다. 체중증가율과 식이효율은 수컷 그룹과 암컷 그룹 모두에서 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 3, 4).
- 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사에 대한 측정 결과는 암수의 전 투여용량군에서 대조군에 비해 시험물질 투여에 의한 유의성 있는 변화는 인정되지 않았다(Table 7, 8).
후속연구
- 않았다. 5,000 ㎎/㎏ 암컷 투여군에서 체중에 비례한간의 상대 무게가 대조군에 비해 116.5%로 유의하게 증가하였으나, 수컷 흰쥐에서 시험 물질 투여에 의한 간의 무게에 이상이 있는 개체는 관찰되지 않았으므로 이에 대한 후속 연구가 필요하다고 사료된다.
- 본 연구에서는 단회 투여 독성시험이 기본 사항이외에 추가적으로 체중, 사료섭취량, 혈액학적검사 및 혈액생화학적 검사 항목, 병 리조직학적 검사로서 동물의 장기무게를 측정하여 연구의 근거를 명확하게 제시하였다. 본 연구에 의한 마황의 안전성, 유효성 검사는 차후 이루어질 한약재 및 한방 처방전반에 대한 안전성 및 유효성 검사의 필수 연구 항목의 시험방법으로서 의의가 있으리라 기대된다. 시험물질인 마황에 대한 경구 급성 독성을 시험하기 위하여 Sprague-Dawley계 흰쥐에 단회 경구 투여한 후 14일간 관찰하였다.
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