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문제 정의
- 한편, 기존 연구 내용을 검색한 결과 한방임상에서 자주 사용되는 한약 조합의 七情원리에 대한 명쾌한 과학적 근거에 대한 연구가 거의 없었으며, 대부분 신약개발을 목적으로 한약재의 생리활성을 검색하고, 활성을 증가시킬 목적으로 유효약재와 그 화학적 구성성분 간의 조합을 사용한 연구에 한정이 되어 있었다. 따라서 본 연구에서는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 마우스 대식세포와 항염증 동물모델 마우스를 이용하여 염증 매개 인자들의 분비에 대한 羌活과 威靈仙의 상승효과를 조사하고, 본초학적 七情원리 중 相使의 이론을 과학적으로 입증하고자 하였다.
- 한의학에서의 염증은 濕熱, 血熱, 熱毒, 瘀血, 痰熱, 風濕, 虛血 등과 그 기전이 유사하며, 淸熱燥濕, 淸熱凉血, 淸熱解 毒, 祛風勝濕, 濨補陰血 등의 효능을 가진 본초들이, 風濕痹 痛, 跌打損傷 등의 각종 염증성 질환에 처방되어 치료에 사용 되어 왔다. 따라서 본 연구에서는 염증성 질환에 널리 사용되고 있는 祛風藥에 속하는 羌活, 威靈仙의 조합과 七情과의 관계를 염증모델을 이용하여 과학적으로 입증하고자 하였다.
- 따라서 한약의 配伍 원칙인 七情원리 중, 효능이 유사한 약물끼리 配伍하여 한 종의 약물이 주가 되는 약물의 효능을 증대시키는 相使를 기반으로, 風濕과 止痛에 널리 사용되고 있는 羌活과 威靈仙의 相使 관계를 항염증 효과를 통해 검증해 보고자, 마우스 대식세포인 RAW 264.7에서 염증 유발인자들인 TNFα, IL-1β, PGE2, NO 생성량 및 마우스 항염증 모델에서 귀부종 억제율을 측정한 결과, 유의한 효과를 얻었기에 보고 하는 바이다.
- 본 연구에서는 염증성 질환에 널리 쓰이는 羌活과 威靈仙에 대하여 본초 배합 이론의 相使를 과학적으로 확인하기 위해 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포와 마우스 귀부종 모델을 이용하여 항염증 상승작용 및 그 작용기전을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이와 같은 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 相使 관계에 있는 羌活과 威靈仙이 항염증 활성에 대하여 상승작용을 가질 가능성을 제시하며, 본 결과는 한약의 配伍 원칙인 七情을 해 석함에 있어 중요한 의미와 가치가 있다고 사료된다.
제안 방법
- O (2:1:1)과 이용매에 녹인 추출물 (1 mg/ear)을 파이펫을 이용하여 마우스의 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽 표면에 10 μl씩 도포하였다. 1시간 후 아세톤에 12-O-Tetradecanoylphorbol -13-acetate (TPA)를 1 nM로 녹여서 마우스의 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽 표면에 10 ㎕씩 도포하고, 6시간 이후 실험동물을 C02 가스로 마취한 후, 각 귀의 두께를 micrometer로 측정하여 부종 지표로서 부종 증가율을 계산하였다. TPA 단독 처리된 군을 100% 부종지수로 정의하여 상대적인 부종억제율(% control)을 계산하였다.
- 시료의 세포 독성을 확인하고자 MTT assay를 실시하였다. 96-well plate에 배양된 RAW 264.7 세포에 시료를 농도별 (50, 100, 200, 400 ㎍/ml)로 처리하고 24시간 배양한 후 MTT 용액을 최종농도 500 ㎍/ml가 되도록 각 well에 첨가 한 후, 추가로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 배양액을 모두 제거한 후 100 ㎕의 DMSO용액을 첨가하여 생성된 formazan을 용해시킨 뒤, Multi-label leader (PerkinElmer, 미국)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포생존율 (% of control)을 계산하였다.
- 96-well plate에서 5 x 105 cells/well의 농도로 배양된 RAW 264.7 세포에, LPS 1 ㎍/ml와 시료를 100 ㎍/ml로 처리하고 20시간 동안 배양한 후, 배지에 분비된 NO를 Griess reaction system에 기초하여 측정하였다. LPS 단독 처리한 군의 분비량을 100%으로 정의하여 상대적인 생성량 (% of control)을 계산하였다.
- 7 세포에, LPS 1 ㎍/ml와 시료를 100 ㎍/ml로 처리하고 20시간 동안 배양한 후, 배지에 분비된 TNF-α, IL-1β, PGE2를 ELISA kits의 실험방법에 따라 측정하였다. LPS 단독 처리한 군의 분비량을 100%으로 정의하여 상대적인 생성량 (% of control)을 계산하였다.
- 1시간 후 아세톤에 12-O-Tetradecanoylphorbol -13-acetate (TPA)를 1 nM로 녹여서 마우스의 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽 표면에 10 ㎕씩 도포하고, 6시간 이후 실험동물을 C02 가스로 마취한 후, 각 귀의 두께를 micrometer로 측정하여 부종 지표로서 부종 증가율을 계산하였다. TPA 단독 처리된 군을 100% 부종지수로 정의하여 상대적인 부종억제율(% control)을 계산하였다.
- 羌活, 威靈仙, 羌活과 威靈仙 혼합추출물을 각각 1 mg/ear 농도로 도포 1시간 후, TPA로 귀부종을 유발시킨 마우스 염증모델에서 부종억제지수를 산출하였다(Fig. 5). 용매만 도포한 TPA 유발군과 약물군을 비교해본 결과, 羌活은 25.
- 본 실험에서 사용한 羌活, 威靈仙은 (주)옴니허브 (Kyungbuk, Korea)로부터 구입하였다. 羌活과 威靈仙 시료를 각각 100 g, 羌活과 威靈仙의 혼합시료는 각각 50 g씩 1:1로 혼합한 100 g에 10배의 증류수를 가하여 2시간씩 2회 반복하여 환류냉각 추출한 후 감압여과(Whatman No. 2)하고, -60℃ 이하에서 동결건조 하였다 (Ilshin, Korea). 동결 건조 후의 수득율은 羌活, 威靈仙, 羌活과 威靈仙의 혼합시료의 수율은 각각 23.
- 각 실험군은 8마리로 구성되며 MeOH-CHCl3-H2O (2:1:1)과 이용매에 녹인 추출물 (1 mg/ear)을 파이펫을 이용하여 마우스의 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽 표면에 10 μl씩 도포하였다.
- 2)하고, -60℃ 이하에서 동결건조 하였다 (Ilshin, Korea). 동결 건조 후의 수득율은 羌活, 威靈仙, 羌活과 威靈仙의 혼합시료의 수율은 각각 23.4%, 20.4%, 14.9%이었으며, 시료는 -20℃에 보관 후 실험 시 용매에 녹여 사용하였다.
- 7 세포에 시료를 농도별 (50, 100, 200, 400 ㎍/ml)로 처리하고 24시간 배양한 후 MTT 용액을 최종농도 500 ㎍/ml가 되도록 각 well에 첨가 한 후, 추가로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 배양액을 모두 제거한 후 100 ㎕의 DMSO용액을 첨가하여 생성된 formazan을 용해시킨 뒤, Multi-label leader (PerkinElmer, 미국)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포생존율 (% of control)을 계산하였다.
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2) 세포독성 시험
시료의 세포 독성을 확인하고자 MTT assay를 실시하였다. 96-well plate에 배양된 RAW 264.
- 염증 동물 모델로 많이 사용되고 있는 모델인 5주령의 C57BL/6J mice 수컷 (대한바이오링크, 한국) 40마리를 공급 받아, 온도 20-22℃, 상대습도 40-60%, 12시간 간격으로 명암이 조절되는 한국한의학연구원 동물사육실에서 1주일간 환경에 적응시켰으며, 각 군당 8마리씩 총 5군으로 무작위 분배하여 실험하였다.
대상 데이터
- Dulbeccos`s modified Eagle medium (DMEM)과, fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin은 Invitrogen Co. (Grand Island, 미국)에서 구입하였다. TNF-α, IL-1β, PGE2 측정을 위한 ELISA kits와 NO 측정을 위한 Griess reagent는 R&D System (Minneapolis, 미국)에서 구입하였다.
- TNF-α, IL-1β, PGE2 측정을 위한 ELISA kits와 NO 측정을 위한 Griess reagent는 R&D System (Minneapolis, 미국)에서 구입하였다.
- TNF-α, IL-1β, PGE2 측정을 위한 ELISA kits와 NO 측정을 위한 Griess reagent는 R&D System (Minneapolis, 미국)에서 구입하였다. TPA, Lipopolysaccharide (LPS), Escherichia coli0111：B4)와 3-(4,5-dimethylthiazol-2 -yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) solution 등 그 외 시약들은 Sigma (St. Louis, 미국)에서 구입하였다.
- 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구입하여 10% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin을 첨가한 DMEM을 배양액으로 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 羌活, 威靈仙은 (주)옴니허브 (Kyungbuk, Korea)로부터 구입하였다. 羌活과 威靈仙 시료를 각각 100 g, 羌活과 威靈仙의 혼합시료는 각각 50 g씩 1:1로 혼합한 100 g에 10배의 증류수를 가하여 2시간씩 2회 반복하여 환류냉각 추출한 후 감압여과(Whatman No.
데이터처리
- 각 실험군 간의 차이는 Micro Office Excel의 Student's t-test를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였으며, p값이 0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 모든 측정 결과는 평균 (mean)과 표준편차 (standard deviation; SD)로 나타내었다. 각 실험군 간의 차이는 Micro Office Excel의 Student's t-test를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였으며, p값이 0.
이론/모형
- 96-well plate에서 5 x 105 cells/well의 농도로 배양된 RAW 264.7 세포에, LPS 1 ㎍/ml와 시료를 100 ㎍/ml로 처리하고 20시간 동안 배양한 후, 배지에 분비된 TNF-α, IL-1β, PGE2를 ELISA kits의 실험방법에 따라 측정하였다.
- LPS에 의해 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 羌活, 威靈仙 그리고 두 약재의 혼합추출물의 억제효과를 알아보기 위하여 세포배양액으로부터 Griess reagent 반응법을 이용하여 측정하였다(Fig. 4). RAW 264.
- LPS에 의해 활성화 된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 TNF-α, IL-1β의 분비량에 대한 羌活, 威靈仙 그리고 두 약재의 혼합추출물의 억제효과를 알아보기 위하여, 세포배양 액으로부터 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다(Fig. 2).
- LPS에 의해 활성화 된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 염증 유발물질인 PGE2에 대한 羌活, 威靈仙 그리고 두 약재의 혼합추출물의 억제효과를 알아보기 위하여 세포배양액으로 부터 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다(Fig. 3). RAW 264.
- 羌活, 威靈仙 그리고 두 약재의 혼합추출물의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다(Fig. 1). LPS에 의해 활성화된 RAW 264.
성능/효과
- 1. 羌活과 威靈仙, 그리고 두 약재 혼합추출물은 LPS에 의해 활성화 된 마우스 대식세포 RAW 264.7에서 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β, 그리고 염증물질인 PGE2 생성을 유의적으로 감소시키며 탁월한 항염증 활성을 나타내었다.
- 2. 羌活과 威靈仙의 혼합 추출물은 각 약재 단독에 비해 TNF-α, IL-1β와 PGE2 생성량을 유의하게 억제하여 항염증 활성에 대한 상승작용을 나타냈으나, NO 생성량에서는 유의한 차이가 없었다.
- 3. TPA로 유도된 염증 모델 마우스에서 羌活과 威靈仙의 혼합 추출물은 각 약재 단독에 비해 유의한 귀부종 개선효과를 나타냈다.
- 1). LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포에 각각의 시료를 50, 100, 200, 400 ㎍/ml 처리하여 24시간 후 세포생존율을 측정한 결과, 모든 시료의 모든 농도에서 대조군과 비교했을 때 독성이 없는 것으로 나타났다.
- 4). RAW 264.7 세포에 LPS 1 ㎍ /ml를 전처리한 후, 각 시료를 100 ㎍/ml 농도로 처리한 결과 NO 생성량은 LPS로 자극한 대조군과 비교했을 때 羌活은 85.2%, 威靈仙은 48.6%, 혼합추출물은 51.7%로 나타났으며, 羌活과 羌活, 威靈仙 혼합추출물의 비교에서는 유의한 효과를 보였으나, 威靈仙의 경우 상승효과 면에서는 유의한 수준의 결과를 얻지 못했다.
- RAW 264.7 세포에 LPS 1 ㎍/ml를 전 처리한 후, 각 시료를 100 ㎍/ml 농도로 처리한 결과 TNF-α 생성량은 LPS 로 자극한 대조군과 비교했을 때 羌活은 93.6%, 威靈仙은 74.1%, 羌活, 威靈仙 혼합추출물은 62.4%로 나타났으며, 이는 각 약재 단독 억제율에 비해서도 통계적으로 유의성 있는 결과를 보였다(P <0.05).
- RAW 264.7 세포에 LPS 1 ㎍/ml를 전처리한 후, 각 시료를 100 ㎍/ml 농도로 처리한 결과 PGE2 생성량은 LPS로 자극한 대조군과 비교했을 때 羌活은 62.3%, 威靈仙은 63.5%, 羌活, 威靈仙 혼합추출물은 47.1%로 나타났으며, 이는 각각의 약재 단독 처리군과 혼합추출물을 비교한 결과 통계적으로 유의성 있는 결과를 보였다(P <0.001).
- 특히 IL-1β와 PGE2에 대한 분비억제 효과는 매우 뛰어난 것으로 확인 되었으며, 이러한 억제효과는 염증반응에서 PGE2의 생성을 조절하는 COX-2와 IL-1β 생성을 조절하는 IL-1β converting enzyme (ICE)의 활성과 연관되어 있을 것으로 예상된다. 그러나 NO를 측정해본 결과, 모든 약재처리군은 LPS 단독처리군에 비해 현저하게 NO를 억제하였으나, 羌活과 威靈仙 혼합추출물 처리 군은 약재 단독처리 군에 상승효과를 보이지 않았다. 또한, 염증 동물 모델을 사용한 동물실험에서도 羌活과 威靈仙 혼합 추출물 처리 시 각각의 단독 약재 처리군에 비해 현저하게 귀부종을 억제하는 것으로 확인 되었다.
- 또한 羌活과 威靈仙 혼합추출물의 염증 매개 물질의 분비량에 영향을 주는지 확인하기 위하여 TNF-α, IL-1β, PGE2, NO를 측정한 결과 羌活과 威靈仙 혼합추출물 100 ㎍/ml 처리 시, 각 단독 약재 100 ㎍/ml을 처리한 군에 비해 현저하게 TNF-α, IL-1β, PGE2 생성량을 억제하여 상승효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
- 이처럼 본초학적으로 祛風藥에 속하는 羌活과 威靈仙 두 약물은 염증성 질환에 대한 연구 결과들이 주로 보고 되어 왔으나, 실제 두 약물간의 상호작용에 관한 연구는 아직까지 보고된 바 없었다. 또한, 실제 사용되는 처방을 검색한 결과 羌活과 威靈仙이 공동으로 포함된 처방은 65 건이였으며, 이 들 중 1:1로 혼합한 처방이 69.2%로 확인되었다9). 따라서 한약의 配伍 원칙인 七情원리 중, 효능이 유사한 약물끼리 配伍하여 한 종의 약물이 주가 되는 약물의 효능을 증대시키는 相使를 기반으로, 風濕과 止痛에 널리 사용되고 있는 羌活과 威靈仙의 相使 관계를 항염증 효과를 통해 검증해 보고자, 마우스 대식세포인 RAW 264.
- 그러나 NO를 측정해본 결과, 모든 약재처리군은 LPS 단독처리군에 비해 현저하게 NO를 억제하였으나, 羌活과 威靈仙 혼합추출물 처리 군은 약재 단독처리 군에 상승효과를 보이지 않았다. 또한, 염증 동물 모델을 사용한 동물실험에서도 羌活과 威靈仙 혼합 추출물 처리 시 각각의 단독 약재 처리군에 비해 현저하게 귀부종을 억제하는 것으로 확인 되었다.
- 먼저 약재 독성을 알아보기 위하여 羌活, 威靈仙 추출물과 羌活과 威靈仙 혼합추출물를 처리한 후 MTT assay를 수행한 결과, 모든 약재 및 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았다. 또한 羌活과 威靈仙 혼합추출물의 염증 매개 물질의 분비량에 영향을 주는지 확인하기 위하여 TNF-α, IL-1β, PGE2, NO를 측정한 결과 羌活과 威靈仙 혼합추출물 100 ㎍/ml 처리 시, 각 단독 약재 100 ㎍/ml을 처리한 군에 비해 현저하게 TNF-α, IL-1β, PGE2 생성량을 억제하여 상승효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
- 용매만 도포한 TPA 유발군과 약물군을 비교해본 결과, 羌活은 25.5% 威靈仙은 29.7%,의 부종억제율을 나타냈으며, 혼합추 출물의 경우 41.9%의 부종억제율을 나타내 현저하게 부종을 억제하였고, 이러한 부종억제는 각각의 단독 약재 처리군에 비해 통계적으로 유의성 있는 결과를 보였다(P <0.01).
- 특히 IL-1β와 PGE2에 대한 분비억제 효과는 매우 뛰어난 것으로 확인 되었으며, 이러한 억제효과는 염증반응에서 PGE2의 생성을 조절하는 COX-2와 IL-1β 생성을 조절하는 IL-1β converting enzyme (ICE)의 활성과 연관되어 있을 것으로 예상된다.
후속연구
- 한약의 配伍 원칙인 七情 이론 중 相使를 기반으로 선별한 羌活과 威靈仙 혼합추출물을 이용하여 함염증 상승작용을 확인한 결과, 세포 및 동물 모델 모두에서 전반적인 항염증 상승작용이 나타나는 것으로 확인하였으며, 본 연구를 토대로 羌活과 威靈仙의 상승작용연구 뿐 아니라, 두 약재의 성분함 량의 변화 및 염증단계에서의 NF-kB, p53, MAPK, COX-2 등의 상·하위 염증매개물질의 작용기전의 연구 등과 같은 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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