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문제 정의
- 이에 저자는 서로 다른 성질을 갖는 小茴香과 金銀花의 효과를 비교하기 위해 췌장의 중량 비율, 호중구 및 림프구 함량비, 혈청의 amylase 농도, PAF 농도, TNF-α와 IL-6 농도를 조사하고, 조직학적인 관찰을 시행하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Cerulein 최초투여 6 시간 후에 모든 실험동물은 urethane (0.75㎎/㎏, Sigma, USA)을 복강 투여하여 마취한 상태에서 채혈을 한 다음 췌장을 절취한 후 wet pancreas weight/wet body weight 계산식을 통하여 체중에 대한 췌장의 중량을 측정하였다.
- 小茴香 400 g과 金銀花 400 g을 각각 물 3,000 mL에 약탕기(대웅, 한국)로 3 시간 가열 추출한 다음 여과하여 각각 200 mL로 농축하였다. 그리고 저온순환수조(CA-1500, EYELA, Japan)에서 1차 동결한 다음, 동결건조기로 동결건조하여 각각 13 g과 16 g의 小茴香과 金銀花 분말을 얻어 사용하였다.
- 小茴香과 金銀花 추출물 투여군은 cerulein 투여 2시간 전에 300 mg/kg의 농도로 생리식염수 1 mL에 용해하여 1 회 구강 투여하였으며, 정상군과 대조군은 동량의 생리식염수 1 mL을 1회 구강 투여하였다.
- 급성 췌장염을 유발시킨 6 시간 후 체중에 대한 췌장의 중량 변화를 측정하였다. 정상군(0.
- 먼저 각 well에 DTNB 10 µL, 혈청 10 µL 그리고 assay buffer2 5 µL씩 넣고 가볍게 흔들어 준 후, 모든 well에 substrate solution을 200 µL씩 채우고 30 초 동안 plate를 흔들어 준 다음 측정하였다.
- 모든 실험군은 16 시간 전부터 사료공급을 중단한 다음 약물을 투여하고 2 시간 후에 cerulein (40㎍/㎏, Sigma, USA)을 1 시간 간격으로 2 회 복강 투여하여 급성 췌장염을 유발하였다.
- 실험동물은 실험시작 16시간 전에 금식시키고 군 당 6 마리씩 분류하여 급성 췌장염을 유발시키지 않은 정상군(Normal)과 급성 췌장염을 유발시킨 대조군(Control), 소회향 추출액 투여군(FE) 및 금은화 추출액 투여군(LE)으로 나누었다.
- 염증성 질환인 급성 췌장염에 대한 小茴香과 金銀花의 효과를 비교하기 위해 췌장의 중량 비율, 호중구 및 림프구 함량비, 혈청의 amylase 농도, PAF 농도, TNF-α와 IL-6 농도를 조사하고, 조직학적인 관찰을 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이에 본 실험에서는 小茴香과 金銀花 추출물을 경구 투여한 흰쥐를 대상으로 cerulein으로 급성 췌장염을 유발한 후 체중에 대한 췌장의 중량 비율, 호중구 및 림프구 함량비, 혈청중의 amylase, PAF, TNF-α와 IL-6 농도 측정 및 광학현미경을 이용한 조직학적 관찰을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 흰쥐의 췌장 조직을 적출하고 4% paraformaldehyde 용액을 사용하여 관류 고정시킨 다음, 일반적인 조직표본제작 방법으로 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하였다. 조직 표본은 canada balsam으로 봉입한 후, 카메라 부착 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.
- 혈액은 EDTA bottle에 넣은 다음 잘 흔들어주고, 혈구측정기(HEMAVET 950FS, Japan)를 사용하여 호중구와 림프구를 측정하였다.
- 5 mL에 tube에 옮겨 담아 시료로 사용하였다. 혈청 내 Amylase 농도는 400 ㎚에서 FUJI DRI-CHEM 4000 (Japan)으로 측정하였다.
- 혈청중의 IL-6 농도는 Mouse IL-6 ELISA kit (BD, USA)를 이용하여 SpectraMax M2 (Molecular Device, USA)로 450 ㎚에서 측정하였다. 먼저 각 well에 ELISA dilution 50 µL와 혈청 50 µL를 넣고 5 초 동안 흔들어 준 후, 실온에서 2 시간 동안 incubation하였다.
- 혈청중의 PAF 농도는 PAF Acetylhydrolase assay kit (Cayman, USA)를 이용하여 SpectraMax M2 (Molecular Device, USA)로 414 ㎚에서 측정하였다. 먼저 각 well에 DTNB 10 µL, 혈청 10 µL 그리고 assay buffer2 5 µL씩 넣고 가볍게 흔들어 준 후, 모든 well에 substrate solution을 200 µL씩 채우고 30 초 동안 plate를 흔들어 준 다음 측정하였다.
- 흰쥐의 췌장 조직을 적출하고 4% paraformaldehyde 용액을 사용하여 관류 고정시킨 다음, 일반적인 조직표본제작 방법으로 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하였다.
대상 데이터
- 小茴香 400 g과 金銀花 400 g을 각각 물 3,000 mL에 약탕기(대웅, 한국)로 3 시간 가열 추출한 다음 여과하여 각각 200 mL로 농축하였다. 그리고 저온순환수조(CA-1500, EYELA, Japan)에서 1차 동결한 다음, 동결건조기로 동결건조하여 각각 13 g과 16 g의 小茴香과 金銀花 분말을 얻어 사용하였다.
- 실험동물은 동신대학교 한의과대학 동물사육실에서 일정한 조건(온도:21±2℃, 습도:50~60%, 명암:12시간 주기)하에서 일반 고형사료(㈜샘타코, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 1 주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 체중 210±10 g 내외의 Sprague Dawley계 웅성 흰쥐(㈜샘타코, 한국)를 구입하였다.
- 실험에 사용된 小茴香(Foeniculi Fructus)과 金銀花(Lonicerae Flos)는 (주)옴니허브에서 구입하여 사용하였다.
- 정상군에서는 정상적인 췌장조직 소견을 보였다(Fig. A). Cerulein을 투여한 대조군에서는 샘꽈리세포내 공포화 현상을 볼 수 있었고, 정상적인 소엽구조가 파괴됨을 관찰하였다(Fig.
데이터처리
- 실험 결과는 Mean±SE로 표시하였고, 대조군과 실험군과의 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's test로 검정하여 P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 동물실험의 전과정은 국립독성연구원의 ‘동물실험에 관한 지침안’을 준수하면서 수행하였다.
- 혈중 TNF 농도의 측정은 Enzyme-linked immunosorbent 법으로 solid phase sandwich ELISA kit(BD OptEIA TNF ELISA kit)로 측정하였으며, 검출 한계는 13 pg/mL이다.
성능/효과
- 1. 小茴香과 金銀花가 체중에 대한 췌장 비율에 미치는 영향을 실험한 결과, 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성있게 감소하였다.
- 2. 小茴香과 金銀花가 호중구 함량비율에 미치는 영향을 실험한 결과, 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다.
- 3. 小茴香과 金銀花가 림프구 함량비율에 미치는 영향을 실험한 결과, 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있게 증가하였다.
- 4. 小茴香과 金銀花가 혈중 amylase 활성에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있게 감소하였다.
- 5. 小茴香과 金銀花가 혈중 PAF 농도에 미치는 영향을 실험한 결과, 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있게 감소하였다.
- 6. 小茴香과 金銀花가 혈중 TNF-α 농도에 미치는 영향을 측정한 결과, 모든 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
- 7. 小茴香과 金銀花가 혈중 IL-6 농도에 미치는 영향을 측정한 결과, 모든 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
- 8. 조직학적 결과 대조군에 비해 모든 실험군에서 췌장조직의 손상이 감소된 경향을 보였다.
- A). Cerulein을 투여한 대조군에서는 샘꽈리세포내 공포화 현상을 볼 수 있었고, 정상적인 소엽구조가 파괴됨을 관찰하였다(Fig. B). 그러나 小茴香과 金銀花을 투여한 실험군들에서는 공포화나 소엽 구조의 파괴가 대조군에 비해 감소됨을 관찰하였다(Fig.
- 광학현미경을 통해 각 군의 췌장 샘꽈리세포를 관찰한 결과 小茴香과 金銀花를 투여한 실험군들은 대조군에 비해 공포화나 소엽 구조의 파괴가 경감됨을 보였다. 이는 여러 효소활성치 및 PAF, TNF-α, IL-6의 감소와 일치하는 결과로 사료된다.
- B). 그러나 小茴香과 金銀花을 투여한 실험군들에서는 공포화나 소엽 구조의 파괴가 대조군에 비해 감소됨을 관찰하였다(Fig. C, D).
- 림프구는 미생물이나 항원 등 다른 외부 침입체와 결합하여 이들을 몸 밖으로 제거하는 일을 돕는 역할을 하는데, 본 실험에서 림프구의 백분율은 대조군에 비해 실험군 모두 유의하게 증가하는 경향을 보였다. 이는 小茴香과 金銀花의 투여가 조직 손상을 예방하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 본 실험에서 급성췌장염의 유발로 인해 증가된 TNF-α와 IL-6의 양이 小茴香과 金銀花를 투여한 경우 감소된 결과는 특정 cytokines의 과다 분비에 의한 조직손상을 억제한 효과에 의한 것으로 사료된다.
- . 본 실험에서는 cerulein 투여 후 실험군들이 대조군에 비해 수치가 유의적으로 감소되는 경향을 보였다. 이는 小茴香과 金銀花의 투여가 급성췌장염에 의해 증가될 수 있는 PAF 수치를 줄일 수 있음을 의미한다.
- 이상의 실험 결과로 볼 때 小茴香과 金銀花가 염증성 질환인 급성 췌장염에 미치는 효과는 거의 비슷한 것으로 보이며, 급성 췌장염에 취약한 환자들의 예방에 金銀花와 小茴香을 활용할 수 있다고 사료된다.
- 이상의 실험 결과를 보면, 小茴香과 金銀花가 cerulein으로 유도된 급성 췌장염에 미치는 효과는 거의 비슷한 것으로 보인다. 그러나 본 실험은 급성췌장염의 어느 특정 단계를 조사한 것이고 향후 국소적인 염증뿐만 아니라 염증의 전 단계를 검증하는 실험이나 임상적 유용성을 위한 연구가 필요하리라 사료된다.
- 정상군(0.036±0.003 μmol/mim/mL)에 비하여 대조군(0.104±0.015 μmol/mim/mL)에서 유의성(*p<0.05) 있게 증가 하였으며, FE군(0.039±0.001 μmol/mim/mL)과 LE군(0.041±0.003 μmol/mim/mL)은 대조군에 비해 유의성(#p<0.05)있게 감소하였다(Fig. 5).
- 정상군(0.44±0.02%)에 비하여 대조군(0.51±0.00%)에서는 유의성(*p<0.05)있게 증가하였고, 대조군에 비하여 실험군인 FE군(0.43±0.02%), LE군(0.45±0.02%)에서는 췌장의 중량이 유의성(#p<0.05)있게 감소하였다(Fig. 1).
- 정상군(14.167±0.26 pg/mL)에 비하여 대조군(317.333±24.14 pg/mL)과 FE군(232±4.163 pg/mL), LE군(243.5±8.54 pg/mL)에서 모두 유의성(*p<0.05)있게 증가하였고, 실험군인 FE군과 LE군은 대조군에 비해 유의성(#p<0.05)있게 감소하였다(Fig. 7).
- 정상군(14.86±1.60 pg/mL)에 비하여 대조군(115.7±5.16 pg/mL)과 FE군(83.2±0.47 pg/mL), LE군(82.9±3.71 pg/mL)에서 모두 유의성(*p<0.05)있게 증가하였고, 실험군인 FE군과 LE군은 대조군에 비해 유의성(#p<0.05)있게 감소하였다(Fig. 6).
- 정상군(70.4±3.78%)에 비하여 대조군(36.3±2.84%)과 모든 실험군은 림프구의 함량비율이 유의성(*p<0.05)있게 감소하였다.
- 혈청 amylase는 급성 췌장염을 예측할 수 있는 중요한 지표 중 하나로 급성 췌장염 발생 시 효소분비가 상승하는데36) 본 실험을 통해 小茴香과 金銀花 추출물을 투여한 군 모두 대조군에 비해서 amylase 활성이 유의성 있게 감소됨을 확인할 수 있었다. 이는 小茴香과 金銀花가 급성 췌장염 발생 시 상승되는 혈청 amylase를 낮추는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 의미한다.
- 호중구는 염증이 발생된 부위에 몇 시간 이내에 출현하여 24시간 후 최고조에 달하다 곧 변성되어 없어지는데, 본 실험에서는 cerulein 투여 후 실험군 모두가 대조군에 비해 호중구 백분율이 감소하였지만 유의한 결과는 아니었다.
후속연구
- 이상의 실험 결과를 보면, 小茴香과 金銀花가 cerulein으로 유도된 급성 췌장염에 미치는 효과는 거의 비슷한 것으로 보인다. 그러나 본 실험은 급성췌장염의 어느 특정 단계를 조사한 것이고 향후 국소적인 염증뿐만 아니라 염증의 전 단계를 검증하는 실험이나 임상적 유용성을 위한 연구가 필요하리라 사료된다.
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