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문제 정의
- 본 연구에서는 은행잎 추출물이 항균효과가 확인된 바 [21], 항진균 작용이 있음을 확인하고 향후 항균 및 항진균 작용을 갖는 세제 첨가물로 제공하고자 한다. 균주로서 대표적인 비듬유발균인 Pityrosporum ovale을 선택하여 은행잎 추출방법과 추출물의 농도에 따른 영향을 항균작용이 있는 ginkgolide 및 bilobalide를 중심으로 항진균 효과를 검증 하고자 한다.
- 본 연구에서는 은행잎 추출물이 항균효과가 확인된 바 [21], 항진균 작용이 있음을 확인하고 향후 항균 및 항진균 작용을 갖는 세제 첨가물로 제공하고자 한다. 균주로서 대표적인 비듬유발균인 Pityrosporum ovale을 선택하여 은행잎 추출방법과 추출물의 농도에 따른 영향을 항균작용이 있는 ginkgolide 및 bilobalide를 중심으로 항진균 효과를 검증 하고자 한다.
제안 방법
- 100 g 은행잎분말을 1 L에서 추출한 추출물을 기준으로 원액 대비 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 및 1/64로 농축하여 사용하였으며 농축하기 전 추출원액을 HPLC로 분석한 결과 bilobalide와 ginkgolide A, B 함량이 각각 2153.026 mg/L, 8403.48 mg/L, 2722.957 mg/L 이었다. 비듬유발 균주로 Pityrosporum ovale (ATTC 12078)를 pityrosporum medium (PM, pH 7.
- HPLC를 이용하여 Pityrosporum ovale에 대한 항진균 효과를 나타내는 생리활성 성분을 분석하였다. HPLC의 분석조건은 Table 2와 같으며, 분석에 사용된 대조물질은 Sigma사로부터 bilobalide와 ginkgolide A, B의 표준시약으로 구입 하여 사용하였으며, 10 mg씩 칭량하여 ethylacetate 10 mL에 용해시킨 용액을 stock solution으로 하고 5 μg/mL 로 조제 한 후 20 μL씩 주입하여 chromatogram을 얻었다.
- Potato Dextrose Broth 10 mL에 Pityrosporum ovale 0.1 mL 과 각각의 은행잎 추출물을 접종하고 shaking incubator에서 최적 생육조건으로 배양시킴과 동시에 접종 시간부터 4시간 간격으로 spectrophotometer (UV-2401PC, shimazu)로 640 nm 에서 측정하였다. 그 결과 무처리한 균은 최대 흡광도 1.
- 6은 농축비율에 따른 Pityrosporum ovale에 대한 항진균효과를 나타낸 결과이다. Potato Dextrose Broth 100 mL 에 Pityrosporum ovale 1 mL과 은행잎 추출물 1/16 농축을 16 mL, 1/128 농축을 2 mL 접종하고 shaking incubator 에서 최적 생육조건으로 배양시킴과 동시에 접종 시간부터 4시간 간격으로 spectrophotometer로 660 nm에서 측정하였다. 이 실험 결과로 볼 때 무처리한 Pityrosporum ovale의 성장은 최대 흡광도 1.
- 연속희석법을 사용하여 Pityrosporum ovale를 2 × 104 cell 이 되게 하고 은행잎 추출물을 첨가하여 PM 배지에 도말하고 이 배지를 최적생육조건에서 1～2일 배양하여 colony 수를 비교하였다.
- 은행잎 추출 중 항균 및 항진균력이 있는 bilobalide 와 ginkgolide A, B의 함량을 HPLC로 분석하였다. Fig.
- 이 균체를 도말한 soft agar를 충분히 건조시킨 후 paper disc를 무균 조작에 의해 안착시켰고, 그 위에 각종 추출물 용액을 100 μL씩 주입하여 도말한 균체의 최적 생육온도에서 24시간 배양한 후 증식저지환의 유무로 그 활성을 검색하였다. 은행잎 추출물을 원액의 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 및 1/64로 농축하여 disc diffusion test 결과 각 각 1.25 cm, 1.25 cm, 1.3 cm, 1.8 cm, 2.0 cm, 2.5 cm의 증식 저지환을 형성하였다. 이러한 은행잎 추출물의 농축별 항진균력 실험 결과, 은행잎 추출물의 농도가 높으면 높을수록 더 큰 항진균력을 보여줌으로써 은행잎 추출물은 농도 의존성이 큰 것으로 나타났다.
- 이 균체를 도말한 soft agar를 충분히 건조시킨 후 paper disc를 무균 조작에 의해 안착시켰고, 그 위에 각종 추출물 용액을 100 μL씩 주입하여 도말한 균체의 최적 생육온도에서 24시간 배양한 후 증식저지환의 유무로 그 활성을 검색하였다.
대상 데이터
- HPLC의 분석조건은 Table 2와 같으며, 분석에 사용된 대조물질은 Sigma사로부터 bilobalide와 ginkgolide A, B의 표준시약으로 구입 하여 사용하였으며, 10 mg씩 칭량하여 ethylacetate 10 mL에 용해시킨 용액을 stock solution으로 하고 5 μg/mL 로 조제 한 후 20 μL씩 주입하여 chromatogram을 얻었다.
- 본 실험에서 사용한 은행잎은 9월 하순과 10월 중순에 채취하여 증류수로 수세한 후 음지에서 풍건시켜 완전히 건조된 것을 믹서를 이용하여 분말로 제조하였다. 은행잎 분말 100 g을 40% 에탄올 1 L에 넣은 후 80℃에서 4시간 동안 추출하여 중탕한 후 rotary vacuum evaporator (BUCHIV-800, R205, B-490, Vacv-500)로 농축하였다.
- 비듬유발 균주는 Pityrosporum ovale (ATTC 12078)로 한국종균협회에서 분양받아 pityrosporum medium (PM, pH 7.0 24℃)에서 24시간 진탕 배양하였다. 실험 균주 배양용 배지로는 실험 Potato Dextrose Broth와 Ox Gall Powder 가 함유된 PDA배지를 사용하였고 희석액으로는 K2HPO4와 KH2PO4가 함유된 phosphate buffer를 autoclave를 이용 하여 고압 멸균한 후 사용하였다.
- 0 24℃)에서 24시간 진탕 배양하였다. 실험 균주 배양용 배지로는 실험 Potato Dextrose Broth와 Ox Gall Powder 가 함유된 PDA배지를 사용하였고 희석액으로는 K2HPO4와 KH2PO4가 함유된 phosphate buffer를 autoclave를 이용 하여 고압 멸균한 후 사용하였다.
이론/모형
- 비듬 유발균 Pityrosporum ovale의 항진균작용을 colony counting test를 이용하여 측정하였다. 연속희석법을 사용하여 Pityrosporum ovale를 2 × 104 cell 이 되게 하고 은행잎 추출물을 첨가하여 PM 배지에 도말하고 이 배지를 최적생육조건에서 1～2일 배양하여 colony 수를 비교하였다.
- 은행잎 추출물을 농축조건별 항진균력을 확인하기 위하여 100 g 은행잎분말을 1 L에서 추출한 추출물을 기준으로 원액 대비 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 및 1/64로 농축하여 디스크확산법 (disc diffusion test), 광화학적 탁도법 (optical density test) 그리고 colony counting test법을 이용하였다.
성능/효과
- 9%로 나타났다. 700 mg/mL을 투여한 은행잎 추출물의 항진균 효과가 1800 mg/mL투여한 ketoconazole 보다 19.2%의 항진균력이 증가함을 확인할 수 있었다.
- Optical density test 결과로부터 실제 은행잎 추출물을 세제에 첨가하여 비듬억제 효과를 얻기 위해서는 은행잎 추출물을 적어도 1/16이상 농축하는 것이 요구된다. Colony counting test 결과 은행잎 추출물 원액 700 mg/mL을 투여한 경우 (bilobalide; 1.505 mg, ginkgolide A; 5.880 mg, ginkgolide B; 1.904 mg) 사멸율이 99.1%로 나타났으며 양성대조군으로 쓰인 ketoconazole은 1800 mg/mL에서 79.9%로 나타났다. 700 mg/mL을 투여한 은행잎 추출물의 항진균 효과가 1800 mg/mL투여한 ketoconazole 보다 19.
- 1 mL 과 각각의 은행잎 추출물을 접종하고 shaking incubator에서 최적 생육조건으로 배양시킴과 동시에 접종 시간부터 4시간 간격으로 spectrophotometer (UV-2401PC, shimazu)로 640 nm 에서 측정하였다. 그 결과 무처리한 균은 최대 흡광도 1.2까지 성장하였으나 추출물 원액의 1/2와 1/4로 농축한 은행잎 추출물은 0.15, 1/8에서 1/64로 농축한 은행잎 추출물을 사용했을 경우 균의 성장이 나타나지 않았다. 이 결과로부터 은행잎 추출물은 농도가 증가할수록 균의 성장 억제 효과가 증가하는 농도 의존성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 은행잎 추출물 100 mg/mL (bilobalide; 0.215 mg ginkgolide A; 0.840 mg, ginkgolide B; 0.272 mg)에서는 28.8%, 200 mg/mL (bilobalide; 0.430 mg, ginkgolide A;1.680 mg, ginkgolide B; 0.544 mg)에서는 48.9%, 300 mg/mL (bilobalide; 0.645 mg, ginkgolide A; 2.520 mg, ginkgolide B;0.816 mg)에서는 83.3%, 400 mg/mL (bilobalide; 0.860 mg, ginkgolide A; 3.360 mg, ginkgolide B; 1.088 mg)에서는 87.4%, 500 mg/mL (bilobalide; 1.075 mg, ginkgolide A;4.200 mg, ginkgolide B; 1.360 mg)에서는 97.0%, 600 mg/mL (bilobalide; 1.290 mg, ginkgolide A; 5.040 mg, ginkgolide B;1.632 mg)에서는 98.7%, 700 mg/mL (bilobalide; 1.505 mg, ginkgolide A; 5.880 mg, ginkgolide B; 1.904 mg)에서는 대조군에 비하여 사멸율이 99.1%로 나타났다. 양성대조군으로 쓰인 ketoconazole은 1800 mg/mL에서 79.
- 957 mg/L 이었다. 비듬유발 균주로 Pityrosporum ovale (ATTC 12078)를 pityrosporum medium (PM, pH 7.0, 24℃)에서 24시간 진탕 배양하여 디스크확산법 (disc diffusion test), 광화학적 탁도법 (optical density test) 그리고 colony counting test법을 이용하여 항진균력을 실험한 결과 은행잎 추출물은 농도가 증가할수록 균의 성장 억제 효과가 증가하는 농도 의존성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. Optical density test 결과로부터 실제 은행잎 추출물을 세제에 첨가하여 비듬억제 효과를 얻기 위해서는 은행잎 추출물을 적어도 1/16이상 농축하는 것이 요구된다.
- 15, 1/8에서 1/64로 농축한 은행잎 추출물을 사용했을 경우 균의 성장이 나타나지 않았다. 이 결과로부터 은행잎 추출물은 농도가 증가할수록 균의 성장 억제 효과가 증가하는 농도 의존성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 실제 은행잎 추출물을 세제에 첨가하여 비듬억제 효과를 얻기 위해서는 은행잎 추출물을 적어도 1/16이상 농축하는 것이 요구된다.
- Potato Dextrose Broth 100 mL 에 Pityrosporum ovale 1 mL과 은행잎 추출물 1/16 농축을 16 mL, 1/128 농축을 2 mL 접종하고 shaking incubator 에서 최적 생육조건으로 배양시킴과 동시에 접종 시간부터 4시간 간격으로 spectrophotometer로 660 nm에서 측정하였다. 이 실험 결과로 볼 때 무처리한 Pityrosporum ovale의 성장은 최대 흡광도 1.2까지 나타냈으나, 추출 원액의 1/16농축과 1/128 농축의 은행잎 추출물을 첨가한 경우 비듬균은 흡광도가 0.6 미만의 생장억제를 보였다. 이러한 농축추출물을 세제에 첨가하고자 할 때는 농축된 추출물을 사용하는 것이 항진균력을 높이는데 유리하고 세제의 부피를 줄이는데 기여할 것으로 사료된다.
- 5 cm의 증식 저지환을 형성하였다. 이러한 은행잎 추출물의 농축별 항진균력 실험 결과, 은행잎 추출물의 농도가 높으면 높을수록 더 큰 항진균력을 보여줌으로써 은행잎 추출물은 농도 의존성이 큰 것으로 나타났다.
- 9%로 나타났다. 즉 700 mg/mL을 투여한 은행잎 추출물의 항진균효과가 ketoconazole은 1800 mg/mL을 투여한 ketoconazole 더 19.2%의 항진균력이 증가함을 확인할 수 있었다.
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