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문제 정의
- 본 연구는 블루베리 추출물이 인체유방암세포 MCF7에서 세포의 생존, 증식, ROS 축적과 세포 사멸 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 블루베리 추출물 20 ug/mL를 MCF7세포에 첨가 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속시켰다.
- 유도한 것으로 나타났다. 이러한 결과가 과연 세포내에 축적되는 ROS의 양과 연계되어 있는지를 알기 위하여 ROS를 측정하였다. ROS는 생체 세포를 공격하여 지질과 단백질 핵산을 파괴하고, 여 러가지 효소 기능을 저해하여 암과 같은 질병을 발생시키고 노화를 촉진한다(Sahinoglu et al 1996, Nakamura et cd 2003).
제안 방법
- Louis, MO, USA)을 넣은 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM, GibcoBRL, Grand Island, NY, USA)에서 세포 농도는 2xl05 cells/mL로 10 mL의 배양액에 계대하여 세포가 confluent한 경우 계대 배양하여 유지하였다. 세포 분석을 위하여 gelatin-coated coverslip 위에 drop 형태로 부착한 후 이용하였으며, 2일 후 선행 연구(Lee et al 2009)에서 결과가 가장 좋았던 블루베리 20 "mL를 첨가 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속하게 한 후 세포 증식과 세포 사멸을 3 반복하여 관찰하였다. 블루베리 처리군에 대한 대조군으로는 vehicle인 DMEM 20 /zL/mL를 사용하였다.
- MCF7 세포를 24-well plate에 2시05의 세포 농도로 1 mL씩 분주한후 37℃ 배양기에서 24시간 증식시킨 후 블루베리 20 卜잉 mL를 첨가한 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속시켰다. 각각의 시간이 지난 후, 각각의 well에 100 유 L의 MTT 용액(5 mg/mL, phosphate buffered saline: PBS, pH 7.
- MCF7세포의 증식을 시각화하기 위해 블루베리를 첨가한후 각각의 지속시킨 시간 완료 6시간 전에 10 mM/mM 농도의 BrdU 용액이 되도록 BrdU를 첨가하여 증식 중인 세포로 incorporation시킨 후, 세포 증식을 분석하였다. 염색이 보이게 하기 위하여 anti-BrdU antibody(1:200 희석, Sigma Co, St.
- 결과는 평균과 표준편차 또는 %로 표시하였다. PCR 산물의 발현 정도를 수치화하기 위하여 Quantity One program 을 이용하여 그 비율을 결정하였다. 실험군 간의 유의성 차이는 SPSS program을 이용하여 Duncan’s multiple range test로 月<0.
- RT-PCR 산물을 1.0% agarose(BMA, USA cat No. 50004)gel(lX Tris-acetate-EDTA butter, 1.0% agar, 1 mg/mL ethidium bromide)에서 30분 동안 70 voltage에서 전기영동을 한 후 image analyzer로 관찰하였다.
- PBS?} 담긴 세포에 각 처리시간 별로 첨가하여 20분간 반응시킨 후, 즉시 차가운 PBS로 5회 철저히 수세하여 잔여량의 DCFDA를 제거하고 96-well dish(Coming Incorporated Coming, NY, USA)를 Zenyth 3100 rrmltiwell plate reader에서 485 nm(excitation) and 535 nm(emission)에서 각각 측정하여 ROS 값을 구하였다.
- 4)을 가한 후, 4시간 동안 37 ℃ 배양기에서 반응시켰으며, 4시간 후 배양액을 제거하고, 1 mL의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 살아있는 세포에 의해 생성된 보라색 formazan을 용해시켰다. 그 후 96-well용 분광광도계 (THERMO max, USA)를 이용하여 540 때의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생존율은 정상 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
- RNA를 분리하였다. 분리된 RNA로부터 표적 유전자의 mRNA를 역전사시 켜 cDNA를 합성하고, Bcl-2, Bax, caspase-3, caspase-9 primer 쌍을 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR의 총 부피는 25 aL이고, 1 //L의 "산물, 2.
- 미치는 영향을 살펴보았다. 블루베리 추출물 20 ug/mL를 MCF7세포에 첨가 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속시켰다. MTT 분석에 의한 세포 활성은 처리 시간이 증가됨에 따라 점차로 활성이 감소됨을 보여 주었다.
- 블루베리에 함유된 주요 색소 성분인 anthocyanin 등과 같은 단일 화합물의 항암 작용에 의한 선행 연구는 잘 알려져 있지만 순수한 블루베리 원액이 유방암에 미치는 영향에 대한 연구는 미비하므로, 블루베리 첨가 후 지속 시간에 따라 인체 유방암 MCF7 세포의 증식과 사멸을 다양한 세포염색법에 의하여 관찰하였고, 또한 세포 사멸에 영향을 미치는 유전자인 Bcl-2, Bax, caspase-3 및 caspase-9의 mRNA 발현을 조사하였다.
- 세포 사멸에 관여하는 유전자 발현을 관찰하기 위하여 블루베리를 첨가한 후 시간별로 지속시킨 MCF7세포로부터 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA로부터 표적 유전자의 mRNA를 역전사시 켜 cDNA를 합성하고, Bcl-2, Bax, caspase-3, caspase-9 primer 쌍을 첨가하여 PCR을 수행하였다.
- 세포 사멸을 분석하기 위하여 세포를 trypsin으로 분산시켜 Eppendorf tube에 부유세포 및 부착세 포를 수집하여 세포소실을 방지하였다. 이들 각 세포 부유액을 각각 10 mg/mL의 Hoechst 33342와 1 mg/mL의 propidium iodide(PI) 혼합염색액으로 20분 배양하여 염색하였다.
- 이들 각 세포 부유액을 각각 10 mg/mL의 Hoechst 33342와 1 mg/mL의 propidium iodide(PI) 혼합염색액으로 20분 배양하여 염색하였다. 원심분리로 세포 부유액 내의 과다량의 염색액을 수세한 후 세포 관찰 표본을 만들어 형광현미경으로 분석하였다. 형광 현미경에서 무작위로 선정된 현미경 시야의 세포를 촬영 기록한 후, 세포 수를 측정하였다.
- Louis, MO, USA)를 사용하였다. 핵의 배경 염색은 100 /zg/mL 의 propidium iodide로 10분간 염색한 후, 세포를 mounting, sealing하여 형광현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
- 원심분리로 세포 부유액 내의 과다량의 염색액을 수세한 후 세포 관찰 표본을 만들어 형광현미경으로 분석하였다. 형광 현미경에서 무작위로 선정된 현미경 시야의 세포를 촬영 기록한 후, 세포 수를 측정하였다.
대상 데이터
- 세포 분석을 위하여 gelatin-coated coverslip 위에 drop 형태로 부착한 후 이용하였으며, 2일 후 선행 연구(Lee et al 2009)에서 결과가 가장 좋았던 블루베리 20 "mL를 첨가 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속하게 한 후 세포 증식과 세포 사멸을 3 반복하여 관찰하였다. 블루베리 처리군에 대한 대조군으로는 vehicle인 DMEM 20 /zL/mL를 사용하였다.
- 블루베리는 냉동, 동결 건조시킨 미국산용을 방산시장(Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 대부분의 시 약은 Sigma-Aldrich Co.
- 후, 세포 증식을 분석하였다. 염색이 보이게 하기 위하여 anti-BrdU antibody(1:200 희석, Sigma Co, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 핵의 배경 염색은 100 /zg/mL 의 propidium iodide로 10분간 염색한 후, 세포를 mounting, sealing하여 형광현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
- 인체 유방암 MCF7세포(한국 세포주 은행)는 10% fetal bovin serum(FBS; PAA, Exton PA, USA), penicillin-streptomy-cin(Sigma Co, St. Louis, MO, USA)을 넣은 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM, GibcoBRL, Grand Island, NY, USA)에서 세포 농도는 2xl05 cells/mL로 10 mL의 배양액에 계대하여 세포가 confluent한 경우 계대 배양하여 유지하였다. 세포 분석을 위하여 gelatin-coated coverslip 위에 drop 형태로 부착한 후 이용하였으며, 2일 후 선행 연구(Lee et al 2009)에서 결과가 가장 좋았던 블루베리 20 "mL를 첨가 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속하게 한 후 세포 증식과 세포 사멸을 3 반복하여 관찰하였다.
데이터처리
- 각각의 실험은 독립적으로 3번 이상 실시하였으며, 얻어진 결과는 평균과 표준편차 또는 %로 표시하였다. PCR 산물의 발현 정도를 수치화하기 위하여 Quantity One program 을 이용하여 그 비율을 결정하였다.
- PCR 산물의 발현 정도를 수치화하기 위하여 Quantity One program 을 이용하여 그 비율을 결정하였다. 실험군 간의 유의성 차이는 SPSS program을 이용하여 Duncan’s multiple range test로 月<0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- MCF7세포의 생존률은 MTT(3-^^-dimethylthiazol-Z-yyee-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법으로 즉정하였다. MCF7 세포를 24-well plate에 2시05의 세포 농도로 1 mL씩 분주한후 37℃ 배양기에서 24시간 증식시킨 후 블루베리 20 卜잉 mL를 첨가한 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속시켰다.
성능/효과
- MCF7세포의 세포 사멸 진행이 세포 활성의 감소와 관련되어 있는지를 규명하기 위하여 세포 변화와 형태를 Hoechst 33322와 propidium(PI)으로 이 중 염색한 결과, Fig. 2A에서 보듯이 PI(red)(+) 세포수가 블루베리 첨가 후 6시간을 개시로 급격하게 증가되는 것을 보여주고 있어, MTT assay에 의한 세포 활성의 감소는 유방암 세포가 사멸을 진행시키고 있으며, 이는 그 이후로도 지속적으로 유사한 세포 사멸을 보이는 것과 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있다. 또한 핵의 형태도 대조군에 비하여 둥근모습보다는 농축되고 때로는 파편화된 염색체 형태를 보여, 세포가 사멸했거나 사멸 중인세포임을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 블루베리 추출물 20 ug/mL를 MCF7세포에 첨가 후 0, 6, 12, 24 및 48시간 동안 지속시켰다. MTT 분석에 의한 세포 활성은 처리 시간이 증가됨에 따라 점차로 활성이 감소됨을 보여 주었다. 세포 생존율도 Hoechst 33342와 propidium iodide로 이중생사염색으로 분석한 결과, 유사한 경향을 나타내었다.
- 결론적으로, 블루베리는 인체유방암세포 MCF7의 증식을 억제하고, ROS 축적과 세포 사멸을 증가시키며, Bcl-2, Bax, caspase-3 및 caspase-9의 발현을 통하여 세포 사멸을 유도하는 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 3). 따라서 블루베리를 첨가하여 6시간이 되었을때부터 급격히 ROS를 축적시킴으로써 세포 내의 ROS 농도를 증가시켜 세포에 손상을 주기 시작하며, 결국 12시간 정도의 작용시간을 가지고 세포활성 저하 및 세포 증식 저하활동을 보이는 것으로 추정할 수 있을 것이다.
- 보인다. 따라서 전체적으로 볼 때, 블루베리 추출물은 유방암 세포의 생존성을 12시간 지속시켰을 때에 급격히 감소시키며, 그 이후 감소 상대가 지속되는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- Wang et a/(2006)의 연구에 의하면 유방암 발생은 과도한 활성 산소종을 억제할 수 있는 항산화 체계의 불균형에서 야기된 DNA와 세포 조직의 손상때문이라고 보고하였다. 본 실험 결과에서 블루베리를 첨가한 즉시에는(0시간) baseline의 배경 형광만을 보여주지만 블루베리 추출물을 첨가하여 6시간 지남에 따라 ROS가 급격히 증가되며, 이후에는 그 증가 폭이 완만히 되는 것을 볼 수있었다(Fig. 3). 따라서 블루베리를 첨가하여 6시간이 되었을때부터 급격히 ROS를 축적시킴으로써 세포 내의 ROS 농도를 증가시켜 세포에 손상을 주기 시작하며, 결국 12시간 정도의 작용시간을 가지고 세포활성 저하 및 세포 증식 저하활동을 보이는 것으로 추정할 수 있을 것이다.
- 본 실험의 결과, 블루베리를 유방암세포 MCF7에 첨가 한후 0, 6, 12, 24, 48시간 지속시켰을 때 블루베리는 MCF7의 증식을 억제하고, ROS 축적과 세포 사멸을 증가시키며, Bcl-2, Bax, caspase-3 및 caspase-9의 발현을 통하여 세포 사멸을 유도하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 앞으로 in vitro와 in vivo 실험에서 더욱 더 다양한 연구의 필요성이 요구되어진다.
- Yang et «/(2001)은 caspase-3은 세포 사멸을 일으키는데 중요한 역할을 하며, 유방암이나 다른 종류의 암에서 caspase-3 이 결핍되거나 감소되었음을 보고하였다. 본 연구에서 caspase-3 의 발현은 블루베리를 첨가하고 24시간이 되었을 때가장 높았으며, 48시간이 되었을 때는 발현이 유의적으로 감소됨을 보였다. Caspase-9의 발현도 caspase-3의 발현과 유사하게 나타나고 있다.
- Malik et a/(2005)의 연구에서는 석류 추출물 10-100 g/mL를 48시간 PC3 전립선암세포에 첨가시켜 배양한 경우 석류추출물이 G0/G1 phase 지수를 증가시켜 DNA 합성을 저해하여 전립선암세포의 사멸을 유도하였다고 보고하였다. 본 연구에서도 블루베리 첨가 후 48시간이 되었을 때 대부분의 세포가 G0/G1 phase 수치가 증가하여 S/M기로 넘어가지 못하였으며, 이러한 결과로 인해 세포 증식이 억제됨을 알 수 있었다.
- 블루베리 20 /zg/mL를 인체 유방암세포 MCF7에 첨가하고 각각 0, 6, 12, 24및 48시간이 지난 후 MTT assay를 한 결과, 블루베리를 첨가하고 12시간이 되었을 때 세포 생존성이 급격히 감소되었으며, 24시간 지속시켰을 시에는 12시간지속시켰을 시보다는 유의성이 높게 나타났지만 6 및 12시간 지속 시에 보이는 세포 생존성의 대조군 대비 감소 비율(각각 약 25 및 50% 감소)에 비하면 미미한 차이로 보인다. 따라서 전체적으로 볼 때, 블루베리 추출물은 유방암 세포의 생존성을 12시간 지속시켰을 때에 급격히 감소시키며, 그 이후 감소 상대가 지속되는 것으로 나타났다(Fig.
- 상기의 결과에서 세포활성 감소는 세포 사멸과 관련이 있으며, 블루베리 첨가 후 24시간까지는 시간 의존적으로 세포사멸을 유도한 것으로 나타났다. 이러한 결과가 과연 세포내에 축적되는 ROS의 양과 연계되어 있는지를 알기 위하여 ROS를 측정하였다.
- 세포 사멸 이외에 MCF7세포가 DNA 합성으로 세포 증식활동을 보이는지를 알기 위하여 증식된 세포만을 염색해 주는 BrdU핵 염색법을 이용하여 유방암 세포 증식에 미치는 결과를 분석한 결과, 세포 증식 비율은 블루베리 첨가 후 지속 시간에 따라 점차로 감소됨을 보여 주었으며, 특히 블루베리 첨가 후 12시간이 되었을 때는 0, 6시간 동안 지속시킨 때에 비해 유의적으로 낮아짐을 알 수 있었다. 24시간 지속시켰을 때에는 12시간 지속시켰을 때에 비해 유의적으로 높아졌다가 48시간째에는 12시간 지속시보다 더 낮아졌다<Fig.
- 세포 사멸을 억제흐}는 기능을 갖는 Bcl-2, 세포 사멸을 유도하는 Bax, 사멸 신호 전달의 마지 막 경로인 caspase-3 및 caspase-9 발현을 분석한 결과, Bcl-2의 발현은 블루베리 첨가 시간이 증가함에 따라 Bcl-2의 발현이 저하됨으로써 세포 사멸이 일어남이 관찰되었다(Fig. 4). 그와 반대로 Bax의 발현은 블루베리를 첨가하고 6, 12 및 24시간까지는 급격히 증가하다가 ⑦<0.
- 05). 세포 사멸의 지표로 사용되는 Bcl-2 와 Bax의 비율은 첨가시간이 증가할수록 감소하였다.
- 05), 48시간째에는 유의적으로 낮아졌다. 세포 사멸의 지표로 사용되는 Bcl-2와 Bax의 비율(Fig. 5)은 블루베리를 첨가하고 24시간이 되었을 때 유의적으로 높았고, 48시간에는 감소함을 보였다. Oltvai et a/(1993)은 세포 사멸 과정에서 Bcl-2 family 단백질의 세포 내 균형은 미토콘드리아 막의 유지 여부에 중요한 지표가 된다고 보고하였으며, Antonsson et aZ(2001)은 세포 사멸 시에는 Bcl-2 단백질은 4배 정도 감소하였고, Bax는 7배 정도 증가되었다고 보고하였다.
- 2A). 이같이, MTT와 이중염색 분석으로 블루베리 추출물이 인체 유방암 MCF7 세포생존성을 저해하며, 이는 세포 사멸과 관련이 있다는 것을 보여 주었다.
- 세포 생존율도 Hoechst 33342와 propidium iodide로 이중생사염색으로 분석한 결과, 유사한 경향을 나타내었다. 이와 더불어, 세포 증식에 영향을 주는지를 규명하기 위하여 BrdU incorporation 을 이용한 결과, 블루베리 추출물은 세포 사멸을 유도할 뿐 아니라, 세포 증식도 경시적으로 억제함을 보였다. 이 같은 경향은 세포 내에 축적되는 ROS에 의하여 12시간 정도의 ROS 작용시간을 거쳐 급격한 세포 사멸을 블루베리 첨가 후 24시간동안 지속시켰을 때 유도함을 알 수 있었다.
- 이 같은 경향은 세포 내에 축적되는 ROS에 의하여 12시간 정도의 ROS 작용시간을 거쳐 급격한 세포 사멸을 블루베리 첨가 후 24시간동안 지속시켰을 때 유도함을 알 수 있었다. 지속 시간에 따라 Bcl-2의 발현은 유의적으로 감소하였고(p<0.05), Bax의 발현은 24시간 지속시켰을 때 유의적으로 높았다⑦<0.05). 한편, caspase-3 와 caspase-9도 모두 24시간 지속시 켰을 때 유의 적으로 높았다⑦<0.
후속연구
- 효과가 있는 것으로 나타났다. 앞으로 in vitro와 in vivo 실험에서 더욱 더 다양한 연구의 필요성이 요구되어진다.
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