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문제 정의
- 16) 그러나, 복용 방법의 불편함과 불쾌한 맛 등으로 임상 적용에서 한계가 발생하는 경우가 있다. 이에 본 연구에서는 항진균 효과가 있다고 알려진 자연물질인 편백나무(Chamaecyparis obtusa Sieb. et Zucc.) 피톤치드가 Candida albicans 균주에게 미치는 영향을 확인하고, 항진균 효과 및 피톤치드에 노출된 C. albicans의 변화를 관찰하여 편백나무 피톤치드의 임상적용의 가능성을 제안하였다.
제안 방법
- C. albicans의 성장곡선을 관찰하기 위해 C. albicans를 0.0625, 0.125, 0.25% 피톤치드를 각각 첨가한 배지와, 피톤치드를 첨가하지 않은 대조군 배지에 24시간 배양하면서 4시간 간격으로 흡광도와 생균수를 측정하였다. 흡광도를 측정하여 C.
- 이 절편을 1% toluidine blue로 염색하여 우선 광학현미경으로 관찰 함으로써 전자현미경으로 관찰하고자 하는 부위를 정하고 나서 retrimming한 후 80 ㎚정도 두께로 thin section하였다. Thin section한 절편을 copper grid에 올려놓고 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색한후 transmission electron microscope (JEM-1011, JEOL)로 관찰하였다.
- albicans의 증식여부를 혼탁도로 확인하였다. 맨 눈으로 관찰하였을 때 C. albicans가 증식하지 못해 혼탁도가 전혀 없는 배지 중에서 피톤치드가 가장 적게 들어간 배지의 피톤치드 농도를 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)로 결정하였다.
- 4가 될 때까지 호기 상태에서 배양하였다. 배양한 실험균주에 피톤치드를 0.0625, 0.125, 0.25% 첨가하고, 피톤치드를 첨가하지 않은 대조군을 포함하여 6시간을 추가로 배양하였다. 배양액을 10,000 ×g로 30분간 4℃에서 원침시켜 회수한 균 pellet을 PBS로 3회 세정하였다.
- 배양액을 10,000 ×g로 30분간 4℃에서 원침시켜 회수한 균 pellet을 PBS로 3회 세정하였다. 세정된 균 pellet은 0.1M PBS (pH 7.4)로 조정한 Karnovsky고정액(2% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 0.5% CaCl2) 으로 6시간 이상 전고정하고 나서 0.1M PBS로 2시간 수세한 후 1% OsO4-0.1 M PBS로 2시간 후고정하였다. 후고정된 시료를 0.
- 25 ㎛ 두께로 semithin section하였다. 이 절편을 1% toluidine blue로 염색하여 우선 광학현미경으로 관찰 함으로써 전자현미경으로 관찰하고자 하는 부위를 정하고 나서 retrimming한 후 80 ㎚정도 두께로 thin section하였다. Thin section한 절편을 copper grid에 올려놓고 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색한후 transmission electron microscope (JEM-1011, JEOL)로 관찰하였다.
- 3이 되도록 배양한 다음 4 개의 시험관에 균액을 분주하였다. 이 중 3 개의 시험관에 피톤치드를 각각 0.0625, 0.125, 0.25%가 되도록 첨가하고 나머지 1 개는 대조군으로 피톤치드를 첨가하지 않은 상태로 24시간동안, 4시간 간격으로 흡광도와 생균수를 측정하였다.
- 나무가 갖는 특유의 향인 피톤치드는 휘발성 화학물질로서, 식물이 방어를 위해 스스로 생성하여 발산하는 물질이다. 이는 항균, 방충, 소취 등 다양한 기능을 가지고 있는 천연 물질이며, 편백나무에서 추출한편백 피톤치드 정유가 구강 내 상주균주이면서 구강 캔디다증을 일으키는 C. albicans에 대한 효과를 알아보기 위해 편백 피톤치드와 함께 C. albicans 를 배양한 후, 성장정도, 생존력 및 형태적 변화를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 1M PBS로 10분간 세정한 다음 저농도 alcohol에서 100% alcohol (50, 60, 70, 80, 90, 95, 100%)까지 순차적으로 탈수한 후 propylene oxide 에 10분간 치환하였다. 이어서 EPON mixture (EPON 812, MNA, DDSA, DMP30)와 propylene oxide를 1:1로 혼합하여 시료를 하룻밤 처리한 후 EM oven에서 35℃ 6시간, 45℃ 12시간, 60℃에서 24시간 포매하여 시료 block을 만들었다. EM oven에서 꺼낸 block을 trimming한 다음 ultramicrotome을 이용하여 block을 0.
- albicans ATCC 18804를 피톤치드가 0-1% 첨가된 Sabouraud -Dextrose 액체배지에 1:100으로 접종하였다. 접종 후 24시간 배양하여 C. albicans의 증식여부를 혼탁도로 확인하였다. 맨 눈으로 관찰하였을 때 C.
- albicans 생균수를 측정하였다. 피톤치드가 첨가된 배지에 형성된 집락 수, 즉 생균수를 초기 접종 균수와 비교하여 99.9%(3 log10 사멸) 이상 차이가 나는 배지 중에서 피톤치드가 가장 적게 첨가된 배지의 피톤치드 농도를 최소살균농도(minimum fungicidal concentration, MFC)로 결정하였다.21)
- 피톤치드가 첨가된 액체배지에서 24시간 배양한다음 C. albicans가 증식하여 혼탁도를 보이는지 눈으로 관찰하였다. 첨가된 피톤치드의 농도가 증가할수록 혼탁도는 감소하여 0.
- 피톤치드에 의한 C. albicans의 세포막과 세포질 내 구조 변화를 관찰하기 위하여 투과전자현미경으로 관찰하였다. 우선 실험균주를 액체배지에 접종하여 37℃ 호기 상태에서 24시간 배양한 다음 배양액 100 ㎕를 새로운 액체배지 10 ㎖에 접종한 후 분광광도계 (600 ㎚)로 흡광도 0.
- 피톤치드에 의한 C. albicans의 형태변화를 투과전자현미경으로 관찰하였다. 피톤치드를 첨가하지 않고 배양한 C.
- 피톤치드와 함께 배양한 C. albicans를 한천배지에도말한 다음 형성된 생균수로 피톤치드의 살균효과를 관찰하였다. 피톤치드를 첨가하지 않고 배양한 대조군 C.
- 하룻밤 배양한 C. albicans를 피톤치드가 각각 0.0625, 0.125, 0.25%씩 첨가된 액체배지와 피톤치드를 첨가하지 않은 대조군 액체배지 15㎖에 1:100으로 새 액체배지에 접종하고 24시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 흡광도를 측정하여 성장곡선(growth curve)을 관찰하였고, 동시에 같은 시간대의 생균수도 측정하였다.
- 한편, 하룻밤 배양한 C. albicans를 새 Sabouraud -Dextrose 액체배지에 접종하여 대수기까지 배양한 다음, 같은 액체배지로 600nm에서 흡광도를 0.1로 조절하였다. 흡광도 0.
- 호기 상태에서 하룻밤 배양한 C. albicans ATCC 18804를 피톤치드가 0-1% 첨가된 Sabouraud -Dextrose 액체배지에 1:100으로 접종하였다. 접종 후 24시간 배양하여 C.
- 1 M PBS로 2시간 후고정하였다. 후고정된 시료를 0.1M PBS로 10분간 세정한 다음 저농도 alcohol에서 100% alcohol (50, 60, 70, 80, 90, 95, 100%)까지 순차적으로 탈수한 후 propylene oxide 에 10분간 치환하였다. 이어서 EPON mixture (EPON 812, MNA, DDSA, DMP30)와 propylene oxide를 1:1로 혼합하여 시료를 하룻밤 처리한 후 EM oven에서 35℃ 6시간, 45℃ 12시간, 60℃에서 24시간 포매하여 시료 block을 만들었다.
- 흡광도를 측정한 같은 시간대에 C. albicans 균액을 수집하여 Sabouraud-Dextrose 한천배지에 도말, 접종하여 생균수를 측정하였다. 흡광도와 마찬가지로 피톤치드의 첨가량이 증가할수록 생균수는 비례하여 감소하였다.
- 흡광도를 측정한 같은 시간대에 C. albicans 균액을 수집하여 Sabouraud-Dextrose 한천배지에 도말, 접종하여 생균수를 측정하였다. 흡광도와 마찬가지로 피톤치드의 첨가량이 증가할수록 생균수는 비례하여 감소하였다.
- 배양 후, 미리 준비해둔 멸균된 PBS (phosphate -buffered saline) 900㎕가 들어있는 microcentrifuge tube에 각각 배양된 균액 100㎕를 넣고 1:10 단계희석하였다. 희석된 균액 100㎕를 Sabouraud-Dextrose 한천배지에 고르게 퍼지도록 유리막대로 도말하여 호기 상태에서 24시간 배양한후, 200개 정도의 집락이 형성된 배지를 선택하여 집 락수를 센 다음 희석배율에 따라 계산하여 배양균 원액 1㎖당 C. albicans 생균수를 측정하였다. 피톤치드가 첨가된 배지에 형성된 집락 수, 즉 생균수를 초기 접종 균수와 비교하여 99.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 피톤치드는 편백나무(Chamaecyparis obtusa Sieb. et Zucc.)에서 추출한 정유((주)SH제약)였으며, 실험 균주는 Candida albicans ATCC 18804 (American Type Culture collection, Manassas Virginia, U.S.A)를 사용하였고, Sabouraud-Dextrose 액체배지(Bacto-peptone 10g/L, glucose 20g/L)에서 24시간 37℃에서 호기 상태로 배양하였다.
성능/효과
- 1. 피톤치드는 C. albicans에 강한 항진균력을 보였다.
- 2. C. albicans에 대한 피톤치드의 최소억제농도(MIC)는 0.25%, 최소살균농도(MFC)는 0.5%였다.
- mentagrophytes에 대한 항진균 효과가 더 높게 나타났다.28) 편백정유의 효모형 균주 Candida albicans에 대한 항진균 효과는 200ppm의 농도부터 나타났으며, 편백정유의 농도가 증가할 수록 항진균 효과가 높게 나타나고, 사상형 균주 Alternaria mali와 Aspergillus nidulans에 대해서는 400ppm부터, Fusarium oxyporum에 대해서는 100ppm부터 항진균 효과를 보였으며 편백정유의 농도가 증가 할수록 균주의 성장억제대가 증가한다고 보고되었다.13)
- 3. 성장 곡선 상에서, MIC에 근접한 농도의 피톤치드는 C. albicans의 성장을 억제하였다.
- 18) 구강에서 분리된 C albicans 의 발병률은 신생아에서 45%,32) 건강한 어린이에서는 45–65%,33) 건강한 성인에서는 30-45%,19,20) 가철성 의치를 사용하는 사람에서는 50-65%,20) 급성 질환이 생기고 장기간 치료받는 사람들의 65-88%,20,34-36) 급성 백혈병으로 화학치료를 받고 있는 환자들의 90%,37) 그리고 HIV 환자들의 95% 라고 보고되었다.38) C. albicans 는 점막에 친화적으로 군락을 이루며, 기회감염으로 병인요소로 작용할 수 있기 때문에 면역이 억제된 환자들에게 일상적인 점막 감염이 될 뿐만 아니라 삶을 위협하는 침해적인 감염이 될 수 있다.39) 구강 캔디다증이 발생했을 때 원인 요소가 제거되어 자연스럽게 치유되는 경우도 있지만, 대부분 항진균제 치료가 필요하다.
- 4. 피톤치드를 첨가하여 배양한 C. albicans는 투과전자현미경 상에서, MIC 농도에서 대다수의 세포가 세포질 내 전자밀도가 높은 과립물질과 공포를 보이는 비전형적인 형태를 보였다.
- 40,41) 국소적 항진균제 치료를 먼저 시행하여 전신적 약물 투여를 진행하여 투약의 양과 기간을 줄여야 할 필요가 있으며, 환자의 전신적 진균 감염 위험이 있거나 국소적 약물 치료에 반응하지 않을 때 전신적 약물 투여를 시행해야 한다.42) Nystatin 구강 도포액과 clotrimazole 정제는 고농도의 설탕이 첨가되는 경우가 있어서 치아 우식이 발생하는 경우나 구강 캔디다증이 당뇨, 스테로이드 사용, 면역기능 문제로 인하여 발생한 경우 fluconazole이나 itraconazole과 같은 triazoles 약물을 하루에 한 번 복용하게 하는 것이 효과적이라고 알려져 있다.43) 피톤치드 정유의 항진균 작용이 확인되었고,13,28-30) 구강내 병원균에 대한 항균작용도 밝혀진 바 있다.
- C. albicans를 흡광도가 0.3이 되도록 배양한 후 피톤치드를 첨가 또는 첨가하지 않은 상태로 추가배양한 결과, 대조군의 경우 20시간 경과 후 가장 높은 흡 광도를 보였으며 24시간 경과하였을 때는 다소 감소 하는 양상을 보였다. 피톤치드를 0.
- 1). 또한, C. albicans를 흡광도 0.3까지 미리 배양한 후 피톤치드를 첨가한 경우라도 피톤치드는 MIC 농도 이하에서도 C. albicans가 증식하는 것을억제하였으며 MIC 농도 0.25%에서는 흡광도를 감소 시키고 생균수를 감소시켜 20시간 경과 후 C. albicans가 모두 사멸하는 것이 관찰되었다(Fig. 2). 이는 피톤치드가 C.
- 본 연구결과로 미루어 볼 때, 피톤치드의 항진균력은 구강 내 상주균주이면서 특별한 경우에 구강 캔디다증을 일으키는 C. albicans에 유효하게 작용하며 이를 이용한 구강 위생용품의 적용으로 구강 캔디다증의 예방과 치료 후 예후관리에도 매우 유용하게 사용되리라고 생각된다.
- albicans에 대한 성장억제기전은 아직까지 확실하지 않다. 본 연구에서 C. albicans를 흡 광도 0.3까지 증식시킨 후 피톤치드를 첨가하고 24시간 추가 배양했을 때 0.25% 농도에서 20시간 후 모든 세포가 사멸한 것으로 나타났으나(Fig. 2B), 흡광도는 초기의 흡광도보다 다소 감소하였으나 큰 차이는 없었다(Fig. 2A). 이 사실은 피톤치드가 C.
- 본 연구에서 피톤치드를 첨가하고 Candida albicans를 배양했을 때 성장이 크게 억제되었으며 MIC와 MFC는 각각 0.25%, 0.5%였다(Table 1, 2). 건강한 사람들의 구강 내에서도 흔히 발견되는 이 효모형 진균은 보통 특이한 병변을 일으키지 않으나, 균주가 병변을 일으킬 수준으로 증가하거나 숙주의 국소적 또는 전신적 요인으로 인해 기회감염이 발생하여 구강 캔디다증을 일으킬 수 있다.
- albicans는 전반적으로 정상적인 원형의 세포형태를 보였다. 온전한 외형과 함께 핵이 뚜렷하게 관찰되었고(arrow), 미토콘드리아도 구별할 수 있었으며(arrowhead) 세포질의 밀도도 세포 전체에 걸쳐 비교적 균등하게 나타났다(Fig. 3A, B).
- 이상의 결과로, 피톤치드는 C. albicans에 대해 살균작용에 의한 항진균효과를 갖고 있는 것으로 판단 된다. 따라서, 피톤치드의 항진균력은 구강 내 상주균주이면서 특별한 경우에 구강 캔디다증을 일으키는 C.
- 흡광도와 마찬가지로 피톤치드의 첨가량이 증가할수록 생균수는 비례하여 감소하였다. 피톤치드가 0.0625% 첨가되었을 때 24시간 후 대조군과 비교하였을 때 생균수는 약 2 log10, 0.125%일 때는 3 log10 이상 감소하였다. 이 정도의 첨가농도 범위에서 피톤치드는 C.
- albicans의 성장곡선은 감소하는 것으로 나타났다. 피톤치드를 0.0625% 첨가하고 24시간 배양했을 때 대조군에 비해 흡광도가 1/2 이하로 감소하였고, 피톤치드를 0.125% 첨가하였을 때는 약 1/3로 감소하였다. 피톤치드를 MIC 농도인 0.
- 3이 되도록 배양한 후 피톤치드를 첨가 또는 첨가하지 않은 상태로 추가배양한 결과, 대조군의 경우 20시간 경과 후 가장 높은 흡 광도를 보였으며 24시간 경과하였을 때는 다소 감소 하는 양상을 보였다. 피톤치드를 0.0625, 0.125% 첨가한 경우 시간에 따라 24시간까지 지속적으로 흡광도가 증가하였으나 피톤치드를 첨가하지 않은 대조군과 비교했을 때 피톤치드의 첨가량에 비례하여 C. albicans의 성장곡선은 감소하였다. MIC 농도인 0.
- albicans에 대하여 살균작용을 발휘하지만, 세포용해현상을 유도하는 것은 아니라는 것을 시사한다. 피톤치드를 첨가하고 6시간 배양한 후 C. albicans를 전자현미경으로 관찰한 결과, 피톤치드의 첨가량이 증가할수록 비전형적인 모양의 세포수가 증가하였고, 세포질의 전자밀도도 더 높게 나타났을 뿐만 아니라, 고밀도의 과립도 많이 나타났으며, 세포내 기관의 구분도 불분명하였다. 그러나 뚜렷한 세포용해현상은 관찰되지 않았다.
- albicans를 한천배지에도말한 다음 형성된 생균수로 피톤치드의 살균효과를 관찰하였다. 피톤치드를 첨가하지 않고 배양한 대조군 C. albicans는 생균수가 100㎕당 4.50 x 109이었으나, 피톤치드와 함께 배양했을 때는 생균수가 크게 줄어 피톤치드 첨가량이 0.125%일 때 생균수 3.10 x 107 , 0.25%일 때 1.15 x 105이었고, 0.5%이상 첨가한 경우 모든 Candida 균이 사멸되었다. 따라서 C.
- 피톤치드의 첨가량을 0.125%로 증가시키고 6시간 추가배양 하였을 때 비전형적인 외형을 보이는 세포의 수도 증가하였다. 핵, 미토콘드리아 등과 같은 세포 내부 기관의 형태를 구분할 수 없는 세포들이 나타났고 전반적으로 세포질의 전자밀도가 높게 나타났으며 전자밀도가 매우 높은 과립들(arrow)도 관찰되었다(Fig.
- 125%로 증가시키고 6시간 추가배양 하였을 때 비전형적인 외형을 보이는 세포의 수도 증가하였다. 핵, 미토콘드리아 등과 같은 세포 내부 기관의 형태를 구분할 수 없는 세포들이 나타났고 전반적으로 세포질의 전자밀도가 높게 나타났으며 전자밀도가 매우 높은 과립들(arrow)도 관찰되었다(Fig. 3E, F).
- 25% 피톤치드를 각각 첨가한 배지와, 피톤치드를 첨가하지 않은 대조군 배지에 24시간 배양하면서 4시간 간격으로 흡광도와 생균수를 측정하였다. 흡광도를 측정하여 C. albicans의 성장곡선을 관찰한 결과 피톤치드를 첨가하지 않은 대조군과 비교했을 때 피톤치드의 첨가량에 비례하여 C. albicans의 성장곡선은 감소하는 것으로 나타났다. 피톤치드를 0.
후속연구
- albicans에 대해 살균작용에 의한 항진균효과를 갖고 있는 것으로 판단 된다. 따라서, 피톤치드의 항진균력은 구강 내 상주균주이면서 특별한 경우에 구강 캔디다증을 일으키는 C. albicans에 유효하게 작용하며, 이를 이용한 구강위생용품의 적용으로 구강 캔디다증의 예방과 치료 및 예후관리에도 매우 유용하게 사용되리라고 생각 된다.
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