식물근권에서 분리한 세균을 처리한 감귤열매에서 감귤 역병 억제 효과 Suppressive Effect of Bacterial Isolates from Plant Rhizosphere against Late Blight Caused by Phytophthora citrophthora on Citrus Fruits원문보기
식물근권에서 유래된 12개의 근권세균이 Phytophthora citrophthora에 의해 발생되는 감귤 역병에 대해 감귤 열매에서 병진전 억제 효과를 나타내는지 조사하였다. 조사한 근권세균 중 THJ609-3, TRH423-3, BRH433-2, Lysochit 및 KRY505-3 등에 의해 역병이 억제되는 것을 역병균의 in vivo 상처접종을 통하여 밝혀졌다. 근권세균을 P.citrophthora의 균사체와 대치 배양하여 역병균 저지대의 길이를 측정한 결과 역병 진전억제효과를 보였던 5개의 균주에서 모두 항진균활성이 나타났다. 그러나 근권세균의 균사생장억제효과와 역병억제효과 사이에 양의 상관관계는 성립되지는 않았다. 한편, 근권세균 rDNA의 internal transcript spaces(ITS)을 분석을 통해 동정 한 결과 Lysochit과 KRY505-3은 Bacillus cereus로 동정 되었고, BRH4332은 B. circulans로, TRH423-3는 Burkholderia gladiol로 동정되었다. 이 연구는 친환경 농가와 같이 농약사용이 제한된 농장에서 감귤 역병에 대해 생물적 방제를 위한 활성균을 모색하는데 매우 가치가 있을 것으로 생각된다.
식물근권에서 유래된 12개의 근권세균이 Phytophthora citrophthora에 의해 발생되는 감귤 역병에 대해 감귤 열매에서 병진전 억제 효과를 나타내는지 조사하였다. 조사한 근권세균 중 THJ609-3, TRH423-3, BRH433-2, Lysochit 및 KRY505-3 등에 의해 역병이 억제되는 것을 역병균의 in vivo 상처접종을 통하여 밝혀졌다. 근권세균을 P.citrophthora의 균사체와 대치 배양하여 역병균 저지대의 길이를 측정한 결과 역병 진전억제효과를 보였던 5개의 균주에서 모두 항진균활성이 나타났다. 그러나 근권세균의 균사생장억제효과와 역병억제효과 사이에 양의 상관관계는 성립되지는 않았다. 한편, 근권세균 rDNA의 internal transcript spaces(ITS)을 분석을 통해 동정 한 결과 Lysochit과 KRY505-3은 Bacillus cereus로 동정 되었고, BRH4332은 B. circulans로, TRH423-3는 Burkholderia gladiol로 동정되었다. 이 연구는 친환경 농가와 같이 농약사용이 제한된 농장에서 감귤 역병에 대해 생물적 방제를 위한 활성균을 모색하는데 매우 가치가 있을 것으로 생각된다.
Suppression effect of the 12 bacterial isolates from plant rhizosphere against late blight caused by Phytophthora citrophthora were investigated on citrus fruits. Among the bacterial isolates, THJ609-3, TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit and KRY505-3 presented disease suppression after wound inoculation ...
Suppression effect of the 12 bacterial isolates from plant rhizosphere against late blight caused by Phytophthora citrophthora were investigated on citrus fruits. Among the bacterial isolates, THJ609-3, TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit and KRY505-3 presented disease suppression after wound inoculation with the fungal pathogen in vivo. The anti-fungal activity was evaluated by measuring the length of inhibition zone of the mycelium P. citrophthora adjacent to the effective bacterial isolates in which all of the 5 bacterial isolates showed antagonistic effects. However, there was no positive correlations between the efficacy of disease suppression and the antagonistic effect. On the other hand, Lyso-chit and KRY505-3 were identified as Bacillus cereus, BRH433-2 as B. circulans and TRH423-3 as Burkholderia gladioli, respectively, by analysis of rDNA sequence on the internal transcript spaces. It is suggested that the effective bacterial isolates may be useful for finding biological control agents against late blight especially on environment-friendly farm where the application of fungicide is limited.
Suppression effect of the 12 bacterial isolates from plant rhizosphere against late blight caused by Phytophthora citrophthora were investigated on citrus fruits. Among the bacterial isolates, THJ609-3, TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit and KRY505-3 presented disease suppression after wound inoculation with the fungal pathogen in vivo. The anti-fungal activity was evaluated by measuring the length of inhibition zone of the mycelium P. citrophthora adjacent to the effective bacterial isolates in which all of the 5 bacterial isolates showed antagonistic effects. However, there was no positive correlations between the efficacy of disease suppression and the antagonistic effect. On the other hand, Lyso-chit and KRY505-3 were identified as Bacillus cereus, BRH433-2 as B. circulans and TRH423-3 as Burkholderia gladioli, respectively, by analysis of rDNA sequence on the internal transcript spaces. It is suggested that the effective bacterial isolates may be useful for finding biological control agents against late blight especially on environment-friendly farm where the application of fungicide is limited.
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문제 정의
감귤 역병에 의한 감염정도 조사. 감귤 역병균에 의해 감염된 병반의 직경을 접종 5일 후에 버니어 캘리퍼스로 측정하였다.
본 연구는 식물에서 분리한 길항근권세균들을 이용하여 in Vitro에서 활성 검증 및 생물검정 시험을 통해 감귤 역병에 대한 효과적인 예방 및 방제 가능성을 제시하고자 했으며, 생물적 방제제로 유용될 수 있는 길항근권세균을 중심으로 DNA의 특정부위 염기서열분석을 통한 동정을 수행하였다.
제안 방법
0。(3에서 2분 동안 처리하였다. DNA증폭 유무를 1% agarose gel에서 전기 영동한 후 ethidium bromide(EtBr)로 염색하여 UV하에서 확인하였고, DNA elutione NucleoSpin®kits(Macherey-Nagel, Germany)에 기술된 방법대로 수행하였다. DNA sequence는 Genetic Analyzer(Applied Biosystems 3130x1, USA)에 의해 시행 후 Applied Biosystems(AB, version 1.
PCR 조건 맟 염기서열 분석. 각각의 길항근권세균에서 유래된 total DNA에서 rDNA의 internal transcribe spaces(ITS) 염기서열을 universal 프라이머 38r: 5'-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3, 와 72f: 5, -TGC GGC TGG ATC TCC TT-3, (Gurtler와 Stanisich, 2001)를 이용하여 분석함으로써 동정하였다. PCR 반응액은 2 B의 분리된DNA(5 ng/m/), 2.
감귤 역병에 의한 감염정도 조사. 감귤 역병균에 의해 감염된 병반의 직경을 접종 5일 후에 버니어 캘리퍼스로 측정하였다. 시험결과는 분산분석과 처리평균 사이의 비교를 위하여 Duncan 검정 (/F.
감귤 역병에 대한 억제력이 있는 길항근권세균을 ITS primer를 이용하여 rDNA의 특정유전자를 증폭하여 동정하였다(Fig. 3). 증폭된 유전자의 염 기서열분석을 AB programl에 의해 진행하여 TRH423-3, Lyso-chit 및 KRY505- 3은 각각 761 bp, 268 bp, 266 bp의 sequence을 확인하였고, BRH433-2에서는 340bp와 241 bp 두 개의 sequence 가 나타났다.
감귤 역병 균 Phytophthora citrophthora을 Korea Agricultural Culture Collection (KACC)에서 분양받아 10% V8 배지에 옮긴 후 2UC에서 7일 동안 배양하였다. 배양된 근권세균 및 감귤 역병균을 포함한 배지(직경 5 mm)를 각각 절취하여 Potato Dextrose Agar(PDA) 배지에 직경 1/3지점에 근권 세균을, 반대편의 직경 1/3 지점에 감귤 역병균을 치상한 후 25%:에서 10일간 대치 배양하였다. 식물근권세균의 감귤 역병균에 대한 항균 활성은 대치된 근권세균의 반대편에서 생장한 감귤 역병균사체의 길이에 대한 근권 세균과 대치 배양으로 인해 생장이 억제된 균사체의 길이의 비로 나타내었다.
선발된 식물근권세균을 각각 TSA배지에서 28℃, 48 hr 동안 배양하였다. 배양된 배지에 10 ml 살균수를 넣고 loop를 이용하여 현탁액을 만든 후 UV-Visible Spectrophotometer(Varian Aust, AU/CARY 50 Cone.)를 이용하여 세균농도를 측정한 후 농도를 l.OxiVcfh/m/가 되도록 조정하였다.
접종된 열매를 습도 100%를 유지하도록 습실 처리된 용기(340x270x93 mm; 가로x세로x높이) 에 넣고 28℃ 배양기에서 보관하였다. 시험구는 완전 임의법에 의해 배치하였으며, 각 처리는 감귤열매 9개씩 완전 분리된 실험으로 4반복하였다.
감귤의 과피에 처리된 현탁액이 건조될 때까지 상온(2(rc)에서 자연 건조하였다. 식물근권세균의 현탁액에 대신하여 음의 비교구로 살균수를 처리하였고, 양의 비교구로서 cyazofamid를 동일한 방법으로 처리 하였다.
2009년 9월부터 2010년 1월까지 제주도 서귀포시 남원리 소재의 무농약 재배된 과원에서 감귤열매의 8번과(직경 7 cm)에 해당하는 감귤을 채집하여 실험에 사용하였다. 준비된 식물근권세균의 현탁액(l.OxlO, cfh/m/)에 tween 20을 총부피의 0.01%가 되도록 첨가한 후 감귤의 과피가 흥건히 젖을 정도로 분무하였다. 감귤의 과피에 처리된 현탁액이 건조될 때까지 상온(2(rc)에서 자연 건조하였다.
감귤 역병 접종원은 항균활성을 위한 실험과 동일하게 작성하였으며 배양된 역병균 균사체를 cork borer(직경 7 mm)로 떼어내어 접종원으로 준비하였다. 한 개의 감귤 열매에 서로 다른 3부분의 각각 4 개씩 살균된 침으로 과피에 상처를 낸 다음 접종 원으로 준비된 배지조각을 역병균의 균사가 감귤의 과피 표면에 닿게 접종하였다. 접종된 열매를 습도 100%를 유지하도록 습실 처리된 용기(340x270x93 mm; 가로x세로x높이) 에 넣고 28℃ 배양기에서 보관하였다.
대상 데이터
감귤열매에 길항세균 현탁액 처리. 2009년 9월부터 2010년 1월까지 제주도 서귀포시 남원리 소재의 무농약 재배된 과원에서 감귤열매의 8번과(직경 7 cm)에 해당하는 감귤을 채집하여 실험에 사용하였다. 준비된 식물근권세균의 현탁액(l.
DNA증폭 유무를 1% agarose gel에서 전기 영동한 후 ethidium bromide(EtBr)로 염색하여 UV하에서 확인하였고, DNA elutione NucleoSpin®kits(Macherey-Nagel, Germany)에 기술된 방법대로 수행하였다. DNA sequence는 Genetic Analyzer(Applied Biosystems 3130x1, USA)에 의해 시행 후 Applied Biosystems(AB, version 1.0)을 이용하여 분석하였고 분석된 자료는 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 홈페이지의 Basic Local Alignment Search Tool(Blast; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를이용하여 동정하였다.
옮긴 후 28。(3에서 48시간동안 배양하였다. 감귤 역병 균 Phytophthora citrophthora을 Korea Agricultural Culture Collection (KACC)에서 분양받아 10% V8 배지에 옮긴 후 2UC에서 7일 동안 배양하였다. 배양된 근권세균 및 감귤 역병균을 포함한 배지(직경 5 mm)를 각각 절취하여 Potato Dextrose Agar(PDA) 배지에 직경 1/3지점에 근권 세균을, 반대편의 직경 1/3 지점에 감귤 역병균을 치상한 후 25%:에서 10일간 대치 배양하였다.
OxiVcfh/m/가 되도록 조정하였다. 감귤 역병에 대한 식물근권세균의 억제효과를 비교하기 위해 한국 작물 보호 협회에 등록되어 있는 살균제 cyazofamid(미리카트, 경농)를 약제사용지침서에 따라 660 ull의 농도로 조정하여 준비하였다.
제주의 산간지역, 중산간지역, 해안지역에 자생하고 있는 일년생식물 근권에서 근권세균들을 분리했으며(Lee 등, 2003), 그 중에서 식물병원균에 대해 항미생물 효과가 확인된 12 가지의 균주를 선택하여 실험에 이용하였다.
데이터처리
감귤 역병균에 의해 감염된 병반의 직경을 접종 5일 후에 버니어 캘리퍼스로 측정하였다. 시험결과는 분산분석과 처리평균 사이의 비교를 위하여 Duncan 검정 (/F.001)을 실시했으며 , Statistical Analysis System(SAS Institute, version 8.02) program-g;이용하였다.
이론/모형
식 물근권세균의 total DNA 추출. 식 물근권세 균의 DNA 를 Ausubel 등(1987)의 제시된 방법에 따라 추출하였다. 선발된 식물근권세균 중 감귤 역병에 억제효과가 있는THJ609-3, TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit, KRY505-3을 각각 Tryptic Soy Broth(TSB) 배지에 옮긴 후 28。(2에서 24시간 진탕 배양하였다.
성능/효과
증폭된 유전자의 염 기서열분석을 AB programl에 의해 진행하여 TRH423-3, Lyso-chit 및 KRY505- 3은 각각 761 bp, 268 bp, 266 bp의 sequence을 확인하였고, BRH433-2에서는 340bp와 241 bp 두 개의 sequence 가 나타났다. NCBI의 GenBank에 등록된 균주들의 database에 대해 분석된 균주들의 DNA 염기서열을 각각 비교했더니, TRH423-3(NCBI NO.EF552070.1)은 Burkholderia gladiolt로 동정되 었고, Lyso-chit(NCBI NO.EJ932354.1)와 KRY505-3(NCB[ NO.EV915688.1)는 Bacillus cereus로 동정되었으며 BRH433-2의 두 sequence 는 모두 Bacillus circulans(NCBI NO.AF478111.1)로 동정되었다.
ID, E, F, G 와 Table 1). THJ609-3을 처리한 감귤에서의 병반은 33.29 mm로 유의성은 없었지만 역병 억제효과는 나타났다(Fig. 1C와 Table 1). 양의 비교구로 시판농약인 cyazofamid가 함유된 약제를 처리한 감귤에서는 병진전이 매우 억제되어 병반크기가 평균 20.
그러나 식물근권세균 TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit 및 KRY505-3을 처리한 감귤에서는 병진전이 지연되어무처리구보다 하루 늦은 접종 3일째에 과피에 병징이 나타나기 시작했으며, 접종 5일째에는 단지 소수의 병반에서만 역병의 표징을 관찰할 수 있었다. 병반 크기도 작아져서 TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit 및 KRY505-3을 처리한 감귤에서 병반의 직경은 평균 각각 31.
1). 무처리구에서 감귤 역병균에 의해 발생된 과피의 병반 크기는 평균 36.58 mm였으며, 발병된 병반에서 다시 병원균을 분리하여 검경한 결과 감귤 역병의 특징과 동일함을 확인할 수 있었다. 무 처리구에서 의병 진전은 접종 2일째부터 과피가 연한 갈색으로 변하면서 점차 흑갈색으로 변하면서 괴사되었다.
2). 반대로 KRY505-3에 의한 감귤열매의 역병억제력은 유의성 있게 나타났으나 역병균의 균사생장억제력을 낮았다. 이는 근권세균에 의한 역병균 균사생장억제력과 병 진전억제력 사이에 항상 양의 상관관계가 성립하지는 않는다는 것을 의미한다.
역병의 표징을 관찰할 수 있었다. 병반 크기도 작아져서 TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit 및 KRY505-3을 처리한 감귤에서 병반의 직경은 평균 각각 31.39 mm, 30.02 mm, 27.71 mm 및 27.61 mm로 무처리한 비교 구에 비해 유의성 있게 병 발생이 억제되었다(Fig. ID, E, F, G 와 Table 1). THJ609-3을 처리한 감귤에서의 병반은 33.
배양된 근권세균 및 감귤 역병균을 포함한 배지(직경 5 mm)를 각각 절취하여 Potato Dextrose Agar(PDA) 배지에 직경 1/3지점에 근권 세균을, 반대편의 직경 1/3 지점에 감귤 역병균을 치상한 후 25%:에서 10일간 대치 배양하였다. 식물근권세균의 감귤 역병균에 대한 항균 활성은 대치된 근권세균의 반대편에서 생장한 감귤 역병균사체의 길이에 대한 근권 세균과 대치 배양으로 인해 생장이 억제된 균사체의 길이의 비로 나타내었다.
식물병원균에 대해 항미생물 효과가 있는 12개의 균주를 감귤의 과피에 분무 처리 후 감귤 역병을 접종한 결과 THJ609-3, TRH423-3, BRH433-2, Lyso-chit, KRY505-3 등 5개의 균주에서 역병 진전 억제효과를 확인하였다 (Table 1, Fig. 1). 무처리구에서 감귤 역병균에 의해 발생된 과피의 병반 크기는 평균 36.
1C와 Table 1). 양의 비교구로 시판농약인 cyazofamid가 함유된 약제를 처리한 감귤에서는 병진전이 매우 억제되어 병반크기가 평균 20.07 mm로 식물근권세균을 처리한 감귤보다 높은 방제효과를 나타냈다(Fig. 1H과 Table 1). 각 근권세균들은 감귤 역병에 대해 반복 간에 균일한 발병지연 효과를 나타냈다(Table 1).
역병억제 효과가 확인된 5개의 식물근권세균을 대상으로 항진균성을 조사하기 위해 감귤 역병과 대치 배양하였더니, 배양 10일 후 병원균의 생장에 뚜렷한 차이가 나타나서 식물근권세균의 반대쪽에서 생장한 감귤 역병의 균사체의 길이가 평균 32.61~34.88 mm인데 반해 식물근권세균 쪽 방항로 생장하는 균사체의 길이는 평균 13.90~ 22.50 mm로 균사 생장이 억제되었다(Fig. 2와 Table 2). 대부분의 식물근권세균에 의해 균사생장억제율이 50% 이상을 나타냈었으나 KRY505-3는 33.
3). 증폭된 유전자의 염 기서열분석을 AB programl에 의해 진행하여 TRH423-3, Lyso-chit 및 KRY505- 3은 각각 761 bp, 268 bp, 266 bp의 sequence을 확인하였고, BRH433-2에서는 340bp와 241 bp 두 개의 sequence 가 나타났다. NCBI의 GenBank에 등록된 균주들의 database에 대해 분석된 균주들의 DNA 염기서열을 각각 비교했더니, TRH423-3(NCBI NO.
한편, 근권세균 THJ609-3는 감귤 역병균에 대해 높은 균사 생장 억제 활성을 나타냈지만 다른 길항세균에 비해 감귤 역병에 대한 발병 억제효과가 다소 낮았다(Table 2). 반대로 KRY505-3에 의한 감귤열매의 역병억제력은 유의성 있게 나타났으나 역병균의 균사생장억제력을 낮았다.
후속연구
절감하는데 기여할 것으로 보인다. 따라서 본 연구를 통해 미생물을 이용한 농약 대체 수단을 개발하는데 도움을 줄 수 있으며 특히 친환경 농가와 같이 농약사용이 제한된 농가에서는 본 연구에서 보고된 근권세균을 매우 유용하게 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
참고문헌 (28)
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