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문제 정의
- 본 연구에서는 삼천 당제약 주식회사에서 발매하고자 하는 염산밤부테롤 제제인 “밤부콜 정 10밀리그람”이 기존의 염산밤부테롤 제제인 “밤벡® 정 10밀리그람”과 그 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험 기준3)에 따라 건강한 성인 남자(평균 연령 23.86세) 28명을 대상으로 라틴 방격법에 따라 시험하여 얻은 혈청 중 밤부테롤의 최고 혈중 농도(Cmax), 최고 혈중 농도 도달시간(Tmax)과 혈중 약물농도-시간 곡선하 면적(AUCt)에 대하여 Tmax를 제외한 대조약과 시험약의 비교 평가항목인 AUCt와 Cmax의 로그변환치를 생물학적동등성시험 통계처리용 프로그램 K-BE Test20024)를 이용하여 α(유의수준)=0.05에서 분산분석을 실시하였다.
- 약물의 용출은 생체이용률과 깊은 상관관계가 있으므로 먼저 용출시험을 행하여 대조약 및 시험약이 생물학적으로 동등할 것인지를 추정하고자 하였다. 즉, 동일성분을 동일량 함유하는 제제라 하더라도 원료, 부형제 및 제조공정 등에 따라 약물흡수의 전제조건이 되는 용출률이 다르게 나타날 수 있으므로 대조약과 시험약의 용출률을 비교하기 위하여 비교용출시험을 행하였다.
- 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”을, 제 2군에는 시험약으로 삼천당제약에서 제조한 “밤부콜 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”을 동일 투약일에 투약하고, 제 II기에는 그 반대로 투약하였으며, 투약량은 각 제제 모두 2정(염산밤부테롤 20 mg)을 1회 경구 투약하였다. 한편, 건강한 성인에게 염산밤부테롤 20 mg을 경구투여하였을 때, 최종상 반감기는 최대 18.82시간으로 보고되고 있으며, 대사체인 테르부탈린의 최종상 반감기가 약 23.0시간 내외로 나타나 있으므로1-2) 생물학적동등성시험 기준3) 제 18조 제 4항 휴약기간의 산정기준에 따라 충분한 휴약기간을 두고자 13일로 하였다.
제안 방법
- “밤벡® 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”에 대한 “밤부콜 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”의 생물학적 동등성 여부는 식품의약품안전청이 시험 당시 고시한 생물학적동등성시험 기준3) 및 최근의 고시9)에 따라 AUCt, Cmax 및 Tmax 등을 평가하였다.
- 3단계: 시료를 주입한 지 7분이 지났을 때, 스윗칭 밸브를 다시 C위치로 전환시켜 농축용 컬럼에 농축된 분석물질이 분석용 이동상에 의해 분석용 컬럼에서 분리되도록 하였다. 시료 주입 7분 후부터 30분까지 23분에 걸쳐 분석을 진행하였으며 이 기간 동안에 전처리 컬럼은 전처리 이동상을 흘려 보내 재평형시켰다.
- 대조약과 시험약에 대하여 대한약전 제 8개정에 수재된 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 염산밤부테롤 두 제제를 pH 1.2, 4.0, 6.8 및 물의 용출액 각각 900 mL씩을 사용하여 용출시험하였다. 이 용출시험 결과 pH 1.
- 삼천당제약 주식회사에서 발매하고자 하는 염산밤부테롤 제제인 “밤부콜 정 10밀리그람”이 기존의 염산밤부테롤 제제인 유한양행에서 제조하고 한국아스트라제네카에서 판매하는 “밤벡® 정 10밀리그람”과 그 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험 기준3)에 따라 건강한 성인 남자(만 20~28세) 28명을 대상으로 2시기 2제품 라틴 방격법에 따라 시험하여 얻은 밤부테롤의 Tmax와 로그변환한 AUCt 및 Cmax에 대하여 통계검정과 분산분석을 행하였다.
- 3단계: 시료를 주입한 지 7분이 지났을 때, 스윗칭 밸브를 다시 C위치로 전환시켜 농축용 컬럼에 농축된 분석물질이 분석용 이동상에 의해 분석용 컬럼에서 분리되도록 하였다. 시료 주입 7분 후부터 30분까지 23분에 걸쳐 분석을 진행하였으며 이 기간 동안에 전처리 컬럼은 전처리 이동상을 흘려 보내 재평형시켰다. 분석이 끝나고 3분 동안은 분석용 이동상을 100 µL/min의 유속으로 흘려보내 분석용 컬럼을 재평형시켜 두었다(Fig.
- 모든 지원자는 정해진 투약일 일주일 전부터 어떠한 약물 복용도 금지하였을 뿐만 아니라 흡연, xanthine계 음료 및 음주 등을 제한 관리하였다. 시험 전일 오후 7시 30분부터 익일 약 1시까지는 금식시켰으며, 시험기간 중에는 연구자의 지시에 따라 모두 같은 식단의 식사 및 경미한 활동을 하게 하였다.
- 5℃에서 50 rpm으로 시험하였다. 시험약과 대조약의 용출액은 용출시험 조건에 따라 pH 1.2, 4.0, 6.8 및 물의 용출액 각각 900 mL씩을 사용하여 용출 개시 5, 10, 15, 30분에 용출액을 채취하고 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 용출률을 산출하였다.
- 약물 투약은 2시기 2제품의 라틴 방격법에 따른 교차시험법으로 투약계획을 세우고 28명의 피험자를 군당 14명씩 임의로 2군으로 나눈 후, 제 I기 제 1군에는 대조약인 유한양행의 “밤벡® 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”을, 제 2군에는 시험약으로 삼천당제약에서 제조한 “밤부콜 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”을 동일 투약일에 투약하고, 제 II기에는 그 반대로 투약하였으며, 투약량은 각 제제 모두 2정(염산밤부테롤 20 mg)을 1회 경구 투약하였다.
- 염산밤부테롤 표준품을 밤부테롤로서 10 mg을 물에 녹여 농도를 1,000 µg/mL로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 blank 혈청을 가하여 밤부테롤의 혈청 중 농도가 각각 0.3, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 30 ng/mL가 되도록 검량선용 표준혈청액을 조제하고, 다음에 기술한 컬럼스윗칭 방법에 따라 분석을 수행하였다.
- 05에서 분산분석을 실시하여 순서효과(sequence effect)를 검증한 후, 각 변동요인 간의 유의성 여부를 검토하였고 90% 신뢰한계를 구하였다. 이 때 Cmax와 Tmax는 실측치를 사용하였으며 AUCt는 사다리꼴 면적계산 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값을 구해 사용하였다. “밤벡® 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”에 대한 “밤부콜 정 10밀리그람(염산밤부테롤)”의 생물학적 동등성 여부는 식품의약품안전청이 시험 당시 고시한 생물학적동등성시험 기준3) 및 최근의 고시9)에 따라 AUCt, Cmax 및 Tmax 등을 평가하였다.
- 이동상으로는 전처리 및 농축용으로 인산완충액(20 mM, pH 7.0):아세토니트릴=92:8(v/v%)을, 분석용으로는 50 mM KH2PO4:아세토니트릴:메탄올=65:5:30(v/v%)을 사용하였고, Falcó 등8)이 컬럼스윗칭 방법에서 일반적인 방법으로 제시한 바와 같이 내부표준물질을 사용하지 않고 다음과 같이 검량선을 작성하였다.
- 이렇게 얻은 크로마토그램으로부터 밤부테롤의 피크 면적을 구하여 검량선을 작성하였으며 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
- 약물의 용출은 생체이용률과 깊은 상관관계가 있으므로 먼저 용출시험을 행하여 대조약 및 시험약이 생물학적으로 동등할 것인지를 추정하고자 하였다. 즉, 동일성분을 동일량 함유하는 제제라 하더라도 원료, 부형제 및 제조공정 등에 따라 약물흡수의 전제조건이 되는 용출률이 다르게 나타날 수 있으므로 대조약과 시험약의 용출률을 비교하기 위하여 비교용출시험을 행하였다.
- 피험자 모두에게 heparin-locked (150 unit/mL) I.V. catheter(Jelco™, 22G, Jonson & Jonson Medical, Pomezia, 이탈리아)를 팔 또는 손등의 정맥부위에 설치하고 대조약 또는 시험약 2정씩을 물 240 mL와 함께 복용시켰다.
- 한편, 피험자로부터 각 시간 별로 채취하여 -80℃에 보관 했던 혈청 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 3초간 진탕한 다음 이 혈청 1 mL를 취하여 검량선 작성방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
- catheter(Jelco™, 22G, Jonson & Jonson Medical, Pomezia, 이탈리아)를 팔 또는 손등의 정맥부위에 설치하고 대조약 또는 시험약 2정씩을 물 240 mL와 함께 복용시켰다. 혈액 채취는 각 피험자로부터 투약직전, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 8, 12, 24, 36 및 60시간째(총 13시점)에 약 5 mL의 혈액을 채취하여 혈구분리용 원심분리관에 넣고 3,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후, 혈청 분리관을 사용하여 혈청을 채취하고 분석시까지 영하 -80℃에서 보관하였다. 채혈 및 피험자의 휴식 등의 모든 일은 전남대학교 병원에서 타인과 격리된 상태에서 이루어졌다.
대상 데이터
- HPLC용 메탄올 및 아세토니트릴(Fisher Scientific., Fair Lawn, NJ, 미국), 생리식염수 및 헤파린(중외제약, 서울, 한국)은 시판품을, 증류수는 Milli Q(Millipore Co., Milford, MA, 미국)에서 18 MΩ-cm로 통과시킨 것을 사용하였다. 아세트산 에틸 및 기타 시약들은 특급 및 1급 시약들을 사용하였다.
- 비교용출시험용 기기로는 용출시험기(DST-610, Lab Fine Inc., 한국)와 펌프(Waters 515, 미국), 검출기(Waters 996 PDA Detector, 미국), 컬럼(µ Bondapak C18, Waters, 미국) 및 자동 주입기(Waters 717, 미국)로 구성된 HPLC를 사용하였다.
- 시험에 사용된 시험약은 의약품임상시험관리기준5) 제 36조 및 37조의 규정에 따라 제조한 삼천당제약의 “밤부콜 정 10밀리그람”(제조번호: 3001, 사용기한: 2006. 9. 15)이었으며, 대조약은 식품의약품안전청으로부터 허가를 받아 주식회사 유한양행에서 제조하고 한국아스트라제네카에서 시판하고 있는 “밤벡® 정 10밀리그람”(제조번호: 2003, 사용기한: 2005. 6. 18)으로 염산밤부테롤을 10 mg 함유하는 정제이었다.
- 이와 같은 절차를 걸쳐 이 시험의 최종 피험자로 선정된 사람은 평균 체중 68.98±9.58 kg, 평균 연령 23.86±1.65세의 건강한 성인 남성 지원자 28명이었으며, 이들 모두로부터 시험 참여 동의서를 받은 후 생물학적동등성 시험을 실시하였다.
- 에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인 남성 지원자를 공고를 통하여 모집하였다. 지원자는 40명으로 이 시험에 대한 설명회에 참석한 후 전남대학교 병원(광주, 한국)에서 담당의사가 건강진단을 실시하여 건강인으로 판정한 자 중에서 선정하였다. 이와 같은 절차를 걸쳐 이 시험의 최종 피험자로 선정된 사람은 평균 체중 68.
- 피험자는 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험 기준3)에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인 남성 지원자를 공고를 통하여 모집하였다. 지원자는 40명으로 이 시험에 대한 설명회에 참석한 후 전남대학교 병원(광주, 한국)에서 담당의사가 건강진단을 실시하여 건강인으로 판정한 자 중에서 선정하였다.
- 혈중 약물농도 분석기기로는 Nanospace SI-2 system(Shiseido, 동경, 일본)을, 검출기로는 UV-VIS detector 3002(210 nm)를, 컬럼은 전처리 컬럼으로 Capcell Pak MF Ph-1(10×4.0 mm I.D., Shiseido)과 농축용 컬럼으로 Capcell Pak C18 UG120V(35×2.0 mm I.D., Shiseido), 그리고 분석용 컬럼으로 Capcell Pak C18 UG120V(250×1.5 mm I.D., Shiseido)를 사용하였다.
데이터처리
- “밤벡® 정 10밀리그람(염산밤부테롤)” 및 “밤부콜 정 10밀리그람(염산밤부테롤)” 각각 2정씩 28명의 지원자에게 라틴 방격법에 따른 교차시험법에 따라 경구투여하여 얻은 각 제품의 혈청 중 약물농도-시간 곡선으로부터 약물속도론적 파라미터인 AUCt, Cmax 및 Tmax를 구하였으며, 이들 두 제품에서 각각 얻은 값에 대해 Tmax를 제외한 AUCt와 Cmax의로그변환치를 생물학적동등성시험 통계처리용 프로그램인 K-BE Test20024)를 이용하여 α(유의수준)=0.05에서 분산분석을 실시하여 순서효과(sequence effect)를 검증한 후, 각 변동요인 간의 유의성 여부를 검토하였고 90% 신뢰한계를 구하였다.
이론/모형
- 에 대하여 통계검정과 분산분석을 행하였다. 또한 대한약전 제 8개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 비교용출시험을 행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 시험약 “밤부콜 정 10밀리그람”과 대조약 “밤벡® 정 10밀리그람”의 in vitro 용출 특성을 대한약전 제 8개정에 수록된 용출시험법 제 2법(패들법)에 따라 37.0±0.5℃에서 50 rpm으로 시험하였다.
- 아울러, 시험약 “밤부콜 정 10밀리그람"과 대조약 “밤벡® 정 10밀리그람”의 in vitro 용출 특성을 대한약전 제 8개정에 수록된 용출시험법 제 2법(패들법)에 따라 37.0±0.5℃에서 50 rpm으로 시험하였다.
- 혈청 중 염산밤부테롤의 정량은 기 보고된 혈청 중 밤부테롤의 HPLC 분석법6)을 참조하여 당 연구실에서 확립한 컬럼스윗칭 방법7)에 따라 상기 기기조건하 실온에서 실시하였다. 이동상으로는 전처리 및 농축용으로 인산완충액(20 mM, pH 7.
성능/효과
- 1. 대조약인 “밤벡® 정 10밀리그람”과 시험약인 “밤부콜 정 10밀리그람”에 대하여 대한약전 제 8개정에 수재된 제 2법(패들법)에 따라 용출시험한 결과 pH 1.2, 4.0 및 6.8에서는 10분 이내에, 물에서는 30분 이내에 85% 이상 용출되었고, 두 제제의 용출 양상은 거의 차이가 없었다.
- 2. 본 실험에서 염산밤부테롤 10밀리그람 정을 대조약과 시험약으로 각각 2정 투여한 결과 대조약인 “밤벡® 정 10밀리그람”의 평균 AUCt(ng·hr/mL)는 25.81±11.53, 시험약인 “밤부콜 정 10밀리그람”의 평균 AUCt(ng·hr/mL)는 23.72±10.91으로 대조약에 대한 평균치 차가 -8.10%이었고, Cmax(ng/mL)는 3.14±1.35과 3.02±1.33으로 -3.82%의 차이를 보였으며, Tmax(hr)는 2.96±1.21과 3.34±2.04로 12.65%의 차이를 나타내 대조약에 대한 시험약의 평균치 차이는 대조약의 ±20%이내이어야 한다는 생물학적동등성 평가를 위한 전제 조건을 만족하였다.
- 3. “밤벡® 정 10밀리그람”에 대한 “밤부콜 정 10밀리그람”의 분산분석 결과, 로그변환한 AUCt 및 Cmax에 대해 유의수준 α=0.05에서 군간 순서효과는 나타나지 않았으며, 90% 신뢰한계는 각각 log(0.8093)~log(1.0302) 및 log(0.8564)~log(1.1280)으로 나타나 log0.8에서 log1.25 이내에 들어야 한다는 조건을 만족하였다.
- 대조약인 “밤벡® 정 10밀리그람”의 평균 AUCt(ng·hr/mL)는 25.81±11.53, 시험약인 “밤부콜 정 10밀리그람”의 평균 AUCt(ng·hr/mL)는 23.72±10.91으로 대조약에 대한 평균치 차가 -8.10%이었고, Cmax(ng/mL)는 3.14±1.35과 3.02±1.33으로 -3.82%의 차이를 보였으며, Tmax(hr)는 2.96±1.21과 3.34±2.04로 12.65%의 차이를 나타내 대조약에 대한 시험약의 평균치 차이는 대조약의 ±20% 이내이어야 한다는 생물학적동등성 평가를 위한 전제 조건을 만족하였으므로 이하 분산분석을 행하였다.
- 3~30 ng/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었다. 또한 이농도범위에 있어서 밤부테롤의 일내 및 일간 변동계수(C.V)는 LLOQ를 제외하고 15% 이내로 나타났고, 0.3, 0.5, 2 및 10 ng/mL의 농도에서 5회 반복 측정하여 얻은 표준편차(%, deviation)도 LLOQ를 제외하고 15% 이내로 나타났다(Table 1).
- 23보다 모두 작게 나타나 교차시험이 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 로그변환한 평균치 차의 AUCt 및 Cmax에 대한 90% 신뢰한계는 log(0.8093)~log(1.0302) 및 log(0.8564)~log(1.1280)으로 나타나 log(0.8)에서 log(1.25) 이내에 들어야 한다는 조건을 만족하였다. 한편, 참고값인 Tmax 평균치 차의 90% 신뢰구간이 -5.
- 먼저 유의수준 α가 0.05일 때 로그변환한 AUCt 및 Cmax값에 대한 F비(FG)가 F분산표의 한계값인 F(1, 26)=4.23보다 모두 작게 나타나 교차시험이 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
- 3에 나타내었다. 염산밤부테롤 피크의 출현 시간은 분석 시작 후 19.5분대이었고, 분석조건에서 밤부테롤은 기타 혈청 성분들과 잘 분리됨을 확인할 수 있었다. 신호대 잡음비(S/N ratio)를 10 이상으로 하고 일내 및 일간 변동계수의 크기를 20% 미만으로 하였을 때의 최저정량한계(lower limit of quantification, LLOQ)는 0.
- 8 및 물의 용출액 각각 900 mL씩을 사용하여 용출시험하였다. 이 용출시험 결과 pH 1.2, 4.0 및 6.8에서는 10분 이내에, 물에서는 30분 이내에 85% 이상 용출되었고, FDA guideline에 따라 계산한 similarity factor(f2)가 68.36으로 나타나, 두 제제간의 용출은 차이가 없는 것으로 판단하였다(Fig. 2).
- 이로부터 혈청 중 염산밤부테롤에 대한 상기 HPLC 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 적합한 정밀성 및 정확성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 시험결과를 종합해 보면 시험약인 “밤부콜 정 10 밀리그람”은 대조약인 “밤벡® 정 10밀리그람”에 대하여 생물학적동등성시험의 판단기준인 2항목(AUCt 및 Cmax)에 대하여 시험 당시 및 최근 식품의약품안전청의 생물학적동등성 시험 기준 고시3,9)에서 모두 동등한 것으로 나타나 두 제제는 생물학적으로 동등하다고 사료되었다.
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